山皂莢多糖的提取工藝及抑菌活性

高 潔董文賓 王 勇 王 燕

(1. 陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2. 陜西科技大學(xué)，陜西 西安 710000；3. 陜西省食品加工工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710000；4. 陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，陜西 西安 710000)

山皂莢多糖的提取工藝及抑菌活性

高 潔1董文賓2,3王 勇4王 燕1

(1. 陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2. 陜西科技大學(xué)，陜西 西安 710000；3. 陜西省食品加工工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710000；4. 陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，陜西 西安 710000)

以山皂莢多糖為研究對象，在單因素的基礎(chǔ)上，以液固比、提取時(shí)間、提取溫度作為主要影響因素，使用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化了山皂莢多糖的提取工藝，并使用濾紙片擴(kuò)散法對所提多糖進(jìn)行抑菌活性試驗(yàn)。結(jié)果表明：山皂莢多糖的最佳提取工藝為：液固比50∶1(mL/g)，提取溫度65 ℃，提取時(shí)間80 min，山皂莢多糖的得率可達(dá)(31.52±0.54)%；山皂莢多糖溶液濃度為100 mg/mL時(shí)，對細(xì)菌的抑菌效果為：沙門氏菌<大腸桿菌<蠟樣芽孢桿菌<枯草芽孢桿菌<金黃色葡萄球菌，山皂莢多糖抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌的最小抑菌濃度分別為25，50，50，25，50 mg/mL。

山皂莢；多糖；抑菌活性

皂莢(GleditsiasinensisLam. )系豆科蘇木亞科(或云實(shí)亞科)的多年生木本植物。皂莢中主要含有鞣質(zhì)、酚性物質(zhì)、生物堿、有機(jī)酸、糖類、油脂等化學(xué)成分[1]，其具有抗菌[2-3]、殺蟲[4]、抗病毒[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]等功效，現(xiàn)有的皂莢成分研究多集中在皂苷上，而皂莢中多糖的含量遠(yuǎn)大于皂苷，皂莢多糖藥用價(jià)值較高，可提高免疫力[7]、保肝護(hù)肝[8-9]、抗菌消炎[10]等。

植物多糖的分離提取方法較多，主要有酶提取法、微波輔助法、超聲波提取法等[11]，它們雖優(yōu)點(diǎn)較多，但有機(jī)溶劑使用量大，條件不易控制，且影響因素較多。而水提法相比其他提取方法具有便捷、經(jīng)濟(jì)、適合量化生產(chǎn)等特點(diǎn)。本研究擬采用水提取法提取山皂莢多糖，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并研究不同濃度的山皂莢多糖對5種細(xì)菌的抑菌效果，旨在為皂莢資源的有效利用及工業(yè)化生產(chǎn)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

山皂莢：采摘于陜西省安康寧陜縣旬陽壩鎮(zhèn)平河梁，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)雷國蓮教授鑒定為山皂莢Gleditsiajaponic.miq；

無水乙醇：分析純，西安福晨化學(xué)試劑有限公司；

其他試劑均為分析純；

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)、蠟狀芽胞桿菌(Bacilluscereus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(S.typhimurium)：陜西科技大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心；

牛肉膏-蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基[12-13]：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，氯化鈉5 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

真空干燥箱：DZF-6020型，上海赫田科學(xué)儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HH-M4型，上海赫田科學(xué)儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；

循環(huán)水多用真空泵：SHZ-D(III) 型，鄭州長城工貿(mào)有限公司；

離心機(jī)：TGL-16B型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

紫外可見分光光度計(jì)：TU-1810型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

壓力蒸氣滅菌鍋：YXQ-LS-100A型，濟(jì)南捷島分析儀器有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：HT-350B型，上海赫田科學(xué)儀器有限公司；

透析袋：MD25(8 000-14 000)型，上海歐韋達(dá)儀器科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 山皂莢多糖的制備 取去籽后的山皂莢莢果，粉碎過5號篩，干燥后得皂莢粉末。用天平稱取5 g，加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，浸制預(yù)處理10 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)蒸出乙醇，殘留液乙醇洗滌后進(jìn)行干燥，得預(yù)處理山皂莢干粉。稱量山皂莢干粉5 g，蒸餾水回流提取2次，合并濾液，紗布過濾，濾液離心(3 000 r/min，10 min)去殘?jiān)?，收集濾液，3倍無水乙醇沉淀，脫水干燥，得山皂莢粗多糖。

山皂莢粗多糖采用sevag法除蛋白[14-15]，稱取一定量的山皂莢粗多糖，蒸餾水溶解后加入1/5體積的sevag試劑，分液漏斗中混合均勻，除去蛋白層，取脫蛋白后的多糖溶液進(jìn)行H2O2脫色，將脫色后的多糖溶液置于透析袋中，3 h換一次水，透析24 h，透析后的多糖溶液加入3倍乙醇，4 ℃沉淀過夜，離心(4 000 r/min，10 min)除清液，沉淀干燥至恒重得山皂莢精多糖。

(1)

式中：

Y——山皂莢多糖的得率，%；

m——提取純化后山皂莢多糖的質(zhì)量，g；

M——山皂莢干粉質(zhì)量，g。

1.2.2 單因素試驗(yàn) 以山皂莢多糖得率為考核指標(biāo)，選取可能影響多糖得率的液固比、提取時(shí)間、提取溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定每個(gè)因素對山皂莢多糖得率的影響范圍。

(1) 液固比的影響：固定提取溫度60 ℃，回流時(shí)間80 min，回流2次，分別設(shè)置液固比為25∶1，35∶1，45∶1，55∶1，65∶1，75∶1，85∶1，95∶1(mL/g)，考察液固比對山皂莢多糖得率的影響。

(2) 提取時(shí)間的影響：固定提取溫度60 ℃，液固比55∶1(mL/g)，分別回流提取30，50，70，90，110，130，150，170 min，回流2次，考察提取時(shí)間對山皂莢多糖得率的影響。

(3) 提取溫度的影響：固定液固比55∶1(mL/g)，回流提取2次，每次80 min，分別設(shè)置溫度為20，30，40，50，60，70，80，90 ℃，考察提取溫度對山皂莢多糖得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取工藝 綜合單因素試驗(yàn)中各個(gè)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，將液固比、提取時(shí)間及提取溫度3個(gè)因素作為本次響應(yīng)面法的主要考察因素，以山皂莢多糖得率為考察指標(biāo)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，模型確立，從而確定最優(yōu)提取工藝條件。

1.2.4 抑菌試驗(yàn)

(1) 供試溶液制備：將1.2.1提取所得的山皂莢精多糖用無菌水分別配置成25，50，75，100 mg/mL的多糖溶液，濾膜過濾，備用。

(2) 菌懸液的的制備：將試驗(yàn)菌接入斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行活化(置于37 ℃恒溫箱中，培養(yǎng)24 h)，然后制備菌懸液(挑取活化菌種于生理鹽水中)，菌懸液濃度約為106～107CFU/mL。

(3) 抑菌效果測定：采用濾紙片擴(kuò)散法[16-18]，將細(xì)菌培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待凝固后，吸取0.2 mL菌懸液于培養(yǎng)皿內(nèi)，涂抹均勻，用鑷子取出經(jīng)不同濃度皂莢多糖溶液浸泡過的濾紙片(6 mm濾紙圓片，經(jīng)160 ℃干熱滅菌2 h)，每個(gè)平皿放3個(gè)濾紙片，用無菌水浸泡的濾紙片做對照，每種菌重復(fù)做3次，每個(gè)濃度平行做5個(gè)。倒置于水循環(huán)式恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃，培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈的直徑。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理方法 采用Design-Expert 8.0.6對山皂莢多糖提取結(jié)果進(jìn)行處理，對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，對模型進(jìn)行顯著性分析，從而得出最優(yōu)提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 山皂莢多糖提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 液固比的影響 由圖1可知，山皂莢多糖的得率會(huì)隨著液固比的增大而有明顯的升高趨勢，當(dāng)液固比為55∶1(mL/g)時(shí)皂莢多糖得率最大，而當(dāng)液固比再持續(xù)增大后，皂莢多糖得率未見增加，而呈現(xiàn)出下降趨勢。這是由于液固比的大小決定固液兩相的混合情況，從而改變傳質(zhì)速率。當(dāng)液固比較小時(shí)，固相濃度較低，不利于整體得率的提高，當(dāng)液固比較高時(shí)，會(huì)出現(xiàn)攪拌不均勻，固液兩相混合不徹底的現(xiàn)象，且醇沉不徹底，從而使得率降低，因此，適宜固液比為55∶1(mL/g)。

2.1.2 提取時(shí)間的影響 由圖2可知，山皂莢多糖得率在提取初始隨著提取時(shí)間的增加而明顯提高，提取時(shí)間的延長有助于多糖的充分浸提，當(dāng)提取時(shí)間為80～90 min時(shí)，多糖得率最大，繼續(xù)延長提取時(shí)間后，由于多糖結(jié)構(gòu)部分發(fā)生了破壞和降解，使山皂莢多糖得率不再增加，并且呈現(xiàn)下降趨勢，綜合考慮山皂莢多糖得率和節(jié)能，適宜提取時(shí)間為80 min。

Figure 1 Effect of liquid/material rate on yield of polysaccharide inGleditsiajaponic.miq

2.1.3 提取溫度的影響 由圖3可知，在反應(yīng)初始階段，皂莢多糖得率會(huì)隨著提取溫度的升高而有明顯的增大，說明溫度較高有助于破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使多糖能夠較好地浸出；當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，皂莢多糖得率達(dá)到最大，之后開始下降，溫度過高可使皂莢多糖糖鏈發(fā)生斷裂，生物活性受損，得率下降，因此，適宜提取溫度為60 ℃。

Figure 2 Effect of extraction time on yield of polysaccharide inGleditsiajaponic.miq

Figure 3 Effect of the extraction temperature on yield of polysaccharide inGleditsiajaponic.miq

2.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化皂莢多糖提取工藝試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)法制定試驗(yàn)方案，對影響多糖得率的液固比、提取時(shí)間、提取溫度3個(gè)因素進(jìn)行因素水平設(shè)計(jì)，得到17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的設(shè)計(jì)方案，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表1、2。

使用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果分析，以山皂莢多糖得率為響應(yīng)值，得到多元回歸方程為：

Y=31.40+0.76A-0.43B+0.48C-7.85A2-1.23B2-1.81C2+0.06AB+0.17AC+0.42BC(R2=0.999 6)。

(2)

2.3 皂莢多糖提取工藝的響應(yīng)曲面法分析

由圖4可知，液固比對響應(yīng)值的影響較提取時(shí)間圖形陡，液固比的曲線呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且變化幅度較

表3 回歸方程方差分析?

Table 3 Result of variance (ANOVA) analysis for the fitted quadratic polynomial model

? **表示極顯著(P<0.01)，*表示顯著(P<0.05)。

大；提取時(shí)間的曲線較平緩，表明其對多糖得率的影響較小，且交互作用不顯著。由圖5可知，液固比對響應(yīng)值的影響較提取溫度圖形陡，曲線先升高后降低，變化幅度較大，提取溫度圖形走向較為平緩，表明其對多糖得率變化的影響不大。由圖6可知，提取溫度和提取時(shí)間的曲線均較平緩，表明其對多糖得率的影響較不明顯。

本試驗(yàn)根據(jù)響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)所得山皂莢多糖的最優(yōu)提取工藝條件為：液固比51.02∶1(mL/g)，提取溫度64.77 ℃，提取時(shí)間82.02 min，在該提取工藝條件下得率最大可達(dá)31.502 5%。考慮到在實(shí)際操作條件，會(huì)有一定的限制，所以將以上結(jié)果優(yōu)化為：液固比50∶1(mL/g)，提取時(shí)間80 min，提取溫度65 ℃，在此提取條件下平行實(shí)驗(yàn)3次，測得皂莢多糖得率為(31.52±0.54)%，與預(yù)測值基本一致，說明本次響應(yīng)面法所得到的山皂莢多糖提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可用。

2.4 山皂莢多糖抑菌活性

由表4可知，當(dāng)皂莢多糖濃度為100 mg/mL時(shí)，對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌抑制效果最好，抑菌圈分別為14.5，12.0 mm；該濃度下多糖對沙門氏菌、大腸桿菌與蠟樣芽胞桿菌也具有一定的抑制作用，抑菌圈均在7 mm以上。同時(shí)可看出，隨著多糖濃度的增加，抑菌圈直徑呈增大趨勢。

當(dāng)皂莢多糖溶液濃度為100 mg/mL時(shí)，多糖溶液對細(xì)菌的抑菌效果為：金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>蠟樣芽孢桿菌>大腸桿菌>沙門氏菌。整體而言，山皂莢多糖對革蘭氏陽性菌的抑菌作用較革蘭氏陰性菌強(qiáng)。

由表5可知，山皂莢多糖對供試菌有不同程度的抑制作用，其抑菌活性隨著多糖濃度的降低而逐漸減弱，當(dāng)多糖濃度在15 mg/mL時(shí)，對5種供試菌均無抑菌活性，當(dāng)多糖濃度在50 mg/mL及以上時(shí)，抑菌作用較為顯著。山皂莢多糖的最小抑菌濃度MIC分別為：金黃色葡萄球菌25 mg/mL，大腸桿菌50 mg/mL，沙門氏菌50 mg/mL，枯草芽孢桿菌25 mg/mL，蠟樣芽胞桿菌50 mg/mL。

3 結(jié)論

采用應(yīng)用響應(yīng)曲面分析法對山皂莢多糖的水提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到較為理想的多糖提取條件：液固比為50∶1(mL/g)，提取時(shí)間為80 min，提取溫度為65 ℃，在此提取條件下山皂莢多糖的得率為(31.52±0.54)%，相較于其他提取方法，水提法是一種較為方便經(jīng)濟(jì)的方法；抑菌試驗(yàn)表明山皂莢多糖具有一定的抑制金黃色葡萄糖菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌生長的作用，但影響山皂莢多糖抑菌效果的因素較多，本試驗(yàn)只選用了一種品系的皂莢多糖和一種提取方法，下一步可對不同品系和不同提取方法的皂莢多糖抑菌效果展開系統(tǒng)全面的研究。

? “+” 表示有抑菌圈，“-”表示無抑菌圈。

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Extraction of polysaccharide fromGleditsiajaponic.miqand its antibacterial activities

GAO Jie1DONGWen-bin2,3WANGYong4WANGYan1

(1.CollegeofMedical,ShaanxiInstituteofInternationalTrade&Commerce,Xianyang,Shaanxi712046,China; 2.ShaanxiUniversityofScience&Technology,Xi‘a(chǎn)n,Shaanxi710000,China; 3.ShaanxiResearchInstituteofFoodProcessingTechnology,Xi‘a(chǎn)n,Shaanxi710000,China; 4.ShaanxiResearchInstituteofAgriculturalProductsProcessingTechnology,Xi‘a(chǎn)n,Shaanxi71000,China)

The polysaccharide inGleditsiajaponic.miqwas researched. Based on the single factor level determination, the major factors including liquid/material ratio, extraction temperature and time were investigated by response surface analysis, and then its antibacterial activity was studied by filter paper diffusion method. The results showed that the optimum technology condition were using liquid/material at 50 mL/g, extracted at 65 ℃ for 80 min. Under these conditions, the yield of polysaccharide was (31.52±0.54) %. Furthermore, when the concentration of polysaccharide was 100 mg/mL, the antibacterial activity was in this order,S.typhimurium

Gleditsiajaponic.miq; polysaccharide; antibacterial activities

陜西省教育廳科研計(jì)劃項(xiàng)目(編號：12JK1044)；陜西省咸陽市科技局科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(編號：2015K04-20)

高潔，女，陜西國際商貿(mào)學(xué)院講師，碩士。

董文賓(1951—)，男，陜西科技大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，碩士。E-mail：251536749@qq.com

2016—12—26

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.030