肉桂醛/殼聚糖功能化碳納米管的制備及其固定脂肪酶的研究

劉 威 賈承勝 張曉鳴 夏書芹

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

肉桂醛/殼聚糖功能化碳納米管的制備及其固定脂肪酶的研究

劉 威 賈承勝 張曉鳴 夏書芹

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

肉桂醛改性處理的殼聚糖對碳納米管表面進(jìn)行修飾，制得一種新型的肉桂醛/殼聚糖/碳納米管復(fù)合材料。用傅立葉紅外光譜(FT-IR)、X射線衍射儀(XRD)、熱分析系統(tǒng)(TGA)、透射電鏡(TEM)對該肉桂醛/殼聚糖/碳納米管復(fù)合材料及相應(yīng)中間產(chǎn)物進(jìn)行表征與分析。以豬胰脂肪酶為模型，探究該肉桂醛/殼聚糖/碳納米管復(fù)合材料固定化酶的性質(zhì)。結(jié)果表明：在肉桂醛與殼聚糖中游離氨基的物質(zhì)的量之比為4∶1、 pH 7.0及脂肪酶濃度為5 mg/mL時，該復(fù)合材料最大負(fù)載量為248 mg/g，酶活性為8 064 U/g，重復(fù)利用7次后，酶活性仍然保持69%。

碳納米管；肉桂醛；殼聚糖；非共價修飾；固定化酶

自被發(fā)現(xiàn)以來，碳納米管一直受到科學(xué)家們的關(guān)注[1-2]。由于碳納米管管束具有非常大的比表面積，體系內(nèi)碳原子形成高度離域的π電子體系，故其易于與含有π電子體系的化合物(如苯系化合物)發(fā)生非共價結(jié)合[3-5]，具備優(yōu)異的吸附性能，因此一直是相關(guān)學(xué)者研究的熱點(diǎn)[6]。但是，由于碳納米管之間具有非常強(qiáng)的范德華力，碳納米管非常容易團(tuán)聚[7-8]，這種團(tuán)聚行為嚴(yán)重限制了碳納米管的應(yīng)用，所以對碳納米管進(jìn)行表面修飾以改善其分散性顯得非常重要[9-11]。目前，對碳納米管表面修飾方法主要分為共價修飾和非共價修飾。共價修飾是指通過化學(xué)反應(yīng)破壞碳納米管結(jié)構(gòu)，在碳納米管表面引入新的基團(tuán)。非共價修飾即為通過物理吸附作用，在碳納米管表面引入有機(jī)高分子。共價修飾一般需要濃硫酸或濃硝酸作為氧化劑，反應(yīng)條件苛刻，且破壞碳納米管剛性結(jié)構(gòu)[12-13]。目前，已有文獻(xiàn)[14-16]報道利用有機(jī)高分子對其表面進(jìn)行非共價修飾以改善其分散性，其工藝簡單，操作方便，且碳納米管結(jié)構(gòu)未被破壞。Xu等[17]將少根根霉(RAL)共價固定在羧基化碳納米管上，F(xiàn)T-IR表征表明其保留了游離酶63%的α螺旋結(jié)構(gòu)。Feng等[18]在碳納米管上引入氨基環(huán)糊精，將耶氏酵母脂肪酶YLL物理吸附在碳納米管上，負(fù)載量可達(dá)750 mg/g。

殼聚糖是甲殼素脫乙酰作用后的產(chǎn)物，作為一種天然的有機(jī)高分子，其分子鏈中存在著大量的氨基和羥基，這種結(jié)構(gòu)特性使其具有良好的生物相容性、成纖成膜性和吸附性[19-20]，也為殼聚糖改性提供了條件[21]，因而在眾多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。Long等[22]采用羧甲基殼聚糖對碳納米管非共價修飾，以用于細(xì)胞載體運(yùn)輸領(lǐng)域，證明羧甲基殼聚糖能夠改善碳納米管的分散性和生物兼容性。目前尚未見殼聚糖衍生物功能化碳納米管在固定化酶中的應(yīng)用。同時，Sara等[23]通過分子動力學(xué)模型研究20種氨基酸吸附碳納米管的影響因素和機(jī)理，在氨基酸吸附模型中，苯環(huán)基團(tuán)的影響最大，根本原因是苯環(huán)基團(tuán)與碳納米管管束形成了較強(qiáng)的π-π鍵。因此，本試驗(yàn)將以肉桂醛/殼聚糖接枝物作為有機(jī)高分子對碳納米管表面進(jìn)行修飾，制得肉桂醛/殼聚糖/碳納米管復(fù)合材料。先通過肉桂醛對殼聚糖進(jìn)行接枝化改性，生成肉桂醛/殼聚糖接枝物。肉桂醛的引入使得改性殼聚糖分子鏈中存在苯環(huán)結(jié)構(gòu)，有助于在π—π共軛作用以及高分子疏水作用下接枝化的殼聚糖分子纏繞在碳納米管的表面，同時，殼聚糖分子中存在的羥基和氨基增加了復(fù)合材料對蛋白分子的固載能力，且有助于穩(wěn)定蛋白酶分子構(gòu)象，減少蛋白酶分子失活。并為其工業(yè)化應(yīng)用提供條件。最后，以豬胰脂肪酶為模型，探究該肉桂醛/殼聚糖/碳納米管復(fù)合材料固定化脂肪酶的性質(zhì)及其應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

碳納米管(CNT)：95%，C Nano Technology Ltd(Santa Clara, CA)；

甲醇、乙醇、氫氧化鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

殼聚糖(CS)、牛血清白蛋白(BSA)：生化試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

肉桂醛(CA)：95%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

豬胰脂肪酶：酶活力≥3 000 U/g，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

電子天平：EL104型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

離心機(jī)：DL-5-B型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

超聲波清洗器：SK5210HP型，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；

真空干燥箱：DZG-6020型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

磁力攪拌器：C-MAG-HS7型，德國IKA。

1.3 分析方法

傅立葉紅外光譜儀(FT-IR)，掃描光譜范圍：4 000～400 cm-1，分辨率2.0 cm-1。X射線衍射儀(XRD)，Cu靶，光管功率2.2 kW，輸出功率300 W，掃描范圍：5～60°。熱分析系統(tǒng)(TGA)，溫度掃描范圍30～600 ℃，升溫速率10 ℃/min。透射電鏡(TEM)，點(diǎn)分辨率：0.23 nm，線分辨率：0.14 nm。

1.4 肉桂醛/殼聚糖接枝物的合成

取一定量殼聚糖粉末置于50 mL甲醇中，超聲(200 W)1 h，室溫下磁力攪拌(500 r/min)溶脹12 h，再量取與殼聚糖中游離氨基等物質(zhì)的量的肉桂醛乙醇溶液(肉桂醛與乙醇體積比為1∶1)，混合均勻后逐滴滴加到上述殼聚糖的甲醇溶液中，45 ℃恒溫水浴條件下反應(yīng)8 h，抽濾，無水乙醇洗滌3次，真空干燥24 h，即得不同接枝度的肉桂醛/殼聚糖接枝物。

1.5 肉桂醛/殼聚糖功能化碳納米管的制備

取50 mg上述肉桂醛接枝化殼聚糖分散于100 mL、1%的乙酸溶液中，室溫下磁力攪拌(500 r/min)15 min，加入50 mg碳納米管于上述混合液中，超聲(200 W)1.5 h，室溫下磁力攪拌(500 r/min)2 h，溶液呈黑色均一相，2 000 r/min離心3 min，去除底部未參與反應(yīng)的沉淀，滴加氨水溶液于上清液調(diào)節(jié)溶液pH至弱堿性，靜置10 min，溶液分層，離心(2 000 r/min，3 min)，棄上清液，去離子水洗滌3次，50 ℃真空干燥，即為肉桂醛/殼聚糖非共價修飾碳納米管。

1.6 功能化碳納米管固定化脂肪酶

取一定量脂肪酶粉溶解于PBS緩沖液(pH=7)中，配置一定濃度的酶溶液，5 000 r/min離心3 min，取上清液留存，稱取適量功能化碳納米管加入上述酶溶液中，30 ℃振蕩固定4 h，蒸餾水洗滌3次，于4 ℃下留存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.1 不同取代度殼聚糖修飾碳納米管對固定化脂肪酶的影響 以肉桂醛與殼聚糖中游離氨基的物質(zhì)的量之比分別為0∶1，0.5∶1，1∶1，2∶1，4∶1，8∶1制取不同取代度的改性殼聚糖，將改性殼聚糖按照前述方法修飾碳納米管，探究殼聚糖取代度對固定化酶負(fù)載量的影響。

1.6.2 pH對功能化碳納米管固定化酶的影響 以肉桂醛與殼聚糖中游離氨基的物質(zhì)的量之比為4∶1制取改性殼聚糖功能化碳納米管，利用該功能化碳納米管在不同pH緩沖液中對脂肪酶的負(fù)載率，探究pH對固定化酶的影響。

1.6.3 功能化碳納米管固定化過程的吸附動力學(xué) 以肉桂醛與殼聚糖中游離氨基的物質(zhì)的量之比為4∶1，磷酸鹽緩沖液pH=7.0的條件下，探究在不同酶濃度時改性殼聚糖功能化碳納米管負(fù)載脂肪酶的動力學(xué)過程。

1.6.4 3種碳納米管材料固定化酶性質(zhì)的比較 固定化酶在重復(fù)利用的過程中，都會不可避免地出現(xiàn)損耗和失活，考察3種碳納米管材料固定化脂肪酶的活性隨使用次數(shù)的變化。

1.7 固定化脂肪酶酶濃度以及酶活力的測定

酶濃度測定方法采用Bradford法[24]測定?？梢罁?jù)式(1)計算在不同酶濃度下固定化酶的負(fù)載量：

(1)

式中：

W——單位功能化碳納米管載體負(fù)載酶的質(zhì)量，mg/mg·載體；

C1——反應(yīng)前的酶濃度，mg/mL；

C2——反應(yīng)后的酶濃度，mg/mL；

V——反應(yīng)體系的體積，mL；

M——功能化碳納米管載體的質(zhì)量，mg。

酶活力測定方法采取中國藥典[25]中提供的方法，酶活力單位為指定條件下每分鐘催化水解橄欖油生成1 μmol脂肪酸所需的酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂醛/殼聚糖接枝物的表征

2.1.1 傅里葉紅外光譜(FT-IR) 由圖1可知，曲線CS顯示了殼聚糖紅外光譜圖，3 200～3 600 cm-1的寬峰是O—H鍵伸縮振動峰與—N—H鍵伸縮振動峰的重合峰；1 642 cm-1屬于殘留乙酰中C═O鍵的伸縮振動，是酰胺I譜帶；1 600 cm-1屬于N—H鍵的彎曲振動；1 153 cm-1和1 068 cm-1處為C—O—C的伸縮振動；896 cm-1處為殼聚糖的結(jié)構(gòu)搖擺峰。

曲線CA顯示了肉桂醛的紅外圖譜，1 681 cm-1屬于醛基中C═O 鍵的伸縮振動，1 625 cm-1處弱峰為C═C鍵的伸縮振動峰，1 495 cm-1和1 449 cm-1處為苯環(huán)的特征吸收峰。

曲線CA/CS顯示了肉桂醛/殼聚糖的紅外圖譜，1 600 cm-1處峰基本消失，這是由于—NH2與肉桂醛中—CHO反應(yīng)導(dǎo)致N—H減少產(chǎn)生的，1 633 cm-1為反應(yīng)新生成的C═N鍵的伸縮振動峰，750 cm-1和689 cm-1處為苯環(huán)取代基上C—C的伸縮振動峰，表明肉桂醛已成功接枝在殼聚糖上。

2.1.2 X射線衍射譜(XRD) 由于殼聚糖分子中存在—OH、—NH2等基團(tuán)，分子內(nèi)以及分子間存在很強(qiáng)的氫鍵作用，使得殼聚糖分子排列有序，容易形成結(jié)晶體，結(jié)晶峰主要在2θ=20.0°，峰強(qiáng)并且尖銳，從肉桂醛/殼聚糖的X射線衍射圖中(圖2)，可以看到2θ=20.0°的峰強(qiáng)明顯減弱，變得較為平緩，且在2θ=5.0°和2θ=12.0°出現(xiàn)新的結(jié)晶峰，說明肉桂醛的接枝化導(dǎo)致殼聚糖分子內(nèi)以及分子間的氫鍵作用力被破壞，結(jié)晶性能改變。

2.2 肉桂醛/殼聚糖功能化碳納米管的表征

2.2.1 傅里葉紅外光譜(FT-IR) 由圖3可知，在碳納米管(CNT)的紅外圖譜中，1 632 cm-1處是其重要特征峰，為碳納米管中共軛雙鍵C═C鍵的振動吸收峰[26]。在肉桂醛/殼聚糖功能化碳納米管(CA/CS/CNT)的紅外圖譜中，1 567 cm-1處為肉桂醛/殼聚糖中C═N鍵在碳納米管共軛作用下的特征峰，1 151 cm-1和1 067 cm-1為纏繞在碳納米管表面的肉桂醛/殼聚糖(CS/CA)中C—O—C鍵的伸縮振動，由此可以推斷肉桂醛/殼聚糖與碳納米管發(fā)生了非共價結(jié)合。

2.2.2 熱分析系統(tǒng) 為進(jìn)一步分析肉桂醛/殼聚糖在碳納米管上負(fù)載量，以碳納米管作為平行對照，對肉桂醛/殼聚糖碳納米管進(jìn)行熱重分析。由圖4可知，隨著溫度增加，碳納米管質(zhì)量曲線未出現(xiàn)斷崖形態(tài)，說明碳納米管結(jié)構(gòu)體系性質(zhì)穩(wěn)定，高溫狀態(tài)下也不會分解，曲線中的緩慢下降趨勢可能是樣品中存在少量雜質(zhì)碳引起的；肉桂醛/殼聚糖碳納米管在220 ℃附近出現(xiàn)明顯的失重現(xiàn)象，300 ℃附近曲線形態(tài)走勢變緩，基本與碳納米管形態(tài)曲線平行，說明在此區(qū)間內(nèi)肉桂醛/殼聚糖完全分解，由試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，在220～300 ℃時樣品失重占比為23%，所以肉桂醛/殼聚糖在碳納米管上負(fù)載量大約為23%。

2.2.3 透射電鏡 為了探究肉桂醛/殼聚糖修飾作用對碳納米管團(tuán)聚現(xiàn)象的改善，對碳納米管以及肉桂醛/殼聚糖/碳納米管進(jìn)行透射電子顯微鏡試驗(yàn)。由圖5可知，碳納米管相互纏繞，扭曲聚集；相比于碳納米管，功能化碳納米管呈直立分散形態(tài)，管束之間纏繞現(xiàn)象不明顯，團(tuán)聚現(xiàn)象明顯改善。由此可以得出肉桂醛/殼聚糖對碳納米管表面修飾后減弱了管束之間的疏水作用結(jié)合力，團(tuán)聚現(xiàn)象改善，為后續(xù)的應(yīng)用試驗(yàn)提供了可行性基礎(chǔ)。

2.3 功能化碳納米管固定化脂肪酶

2.3.1 不同取代度殼聚糖修飾碳納米管對固定化脂肪酶的影響 負(fù)載率是指成功負(fù)載的脂肪酶量占溶液中總酶量的比率。由圖6可知，與未取代殼聚糖(物質(zhì)的量之比0∶1)相比，當(dāng)取代度較低(物質(zhì)的量之比0.5∶1)時，酶的負(fù)載量反而降低，當(dāng)取代度逐漸增加時，酶的負(fù)載量先增加后減小，物質(zhì)的量之比為4∶1時，酶的負(fù)載量最大。這可能是肉桂醛與殼聚糖取代反應(yīng)減少了殼聚糖分子鏈中裸露的游離氨基，使得與脂肪酶結(jié)合力減弱，所以在取代度較低時，負(fù)載量先呈降低趨勢，當(dāng)取代度逐漸增加時，改性殼聚糖分子與碳納米管間作用力增加，殼聚糖分子構(gòu)型改變，疏水性苯環(huán)支鏈吸附在碳納米管管束表面，親水性羥基和氨基完全裸露在該復(fù)合材料外側(cè)，增加了該復(fù)合材料與酶蛋白的結(jié)合力，使得酶的負(fù)載量增加，然而當(dāng)取代度過高時，游離氨基絕對數(shù)量驟減，使得其與脂肪酶結(jié)合力減弱，故酶的負(fù)載量又呈降低趨勢。

2.3.2 pH對功能化碳納米管固定化酶的影響 由圖7可知，在pH=7.0時，負(fù)載脂肪酶的效率最大，偏酸或偏堿都會影響脂肪酶的負(fù)載量，可能是溶液酸堿性影響了脂肪酶與復(fù)合材料間氫鍵的形成而導(dǎo)致的。

2.3.3 功能化碳納米管固定化過程的吸附動力學(xué) 由圖8可知，在酶濃度較低(1 mg/mL)時，4 h后吸附效率幾乎可以達(dá)到100%，隨著酶濃度的增加，吸附效率逐漸降低，吸附平衡的時間縮短，這是由于酶濃度增加，增大了碳納米管與蛋白酶分子的接觸頻率。通過計算吸附平衡時固定化酶的最大負(fù)載量可知，1，2，5，10，15 mg/mL酶溶液所對應(yīng)負(fù)載量分別為75，137，248，250，254 mg/g，當(dāng)酶濃度為5 mg/mL以上時，酶濃度增加，負(fù)載量幾乎不變，因此當(dāng)酶濃度為5 mg/mL 時，負(fù)載量已達(dá)到最大，考慮到酶的利用效率以及負(fù)載量的最大化，后續(xù)酶活性探究試驗(yàn)中，酶濃度均為5 mg/mL。

2.3.4 3種碳納米管材料固定化酶性質(zhì)的比較 由表1可知，在3種碳納米管材料中，碳納米管負(fù)載脂肪酶量最小以及酶的相對活性最低，肉桂醛/殼聚糖/碳納米管對脂肪酶的負(fù)載量以及酶的相對活性均最高，可能是殼聚糖和改性殼聚糖分子改善了碳納米管的分散性，故增加了碳納米管對酶的負(fù)載量，同時，殼聚糖和改性殼聚糖分子中的羥基以及氨基有利于穩(wěn)定酶的構(gòu)象，所以酶的活性相對較高，另外，肉桂醛改性促使殼聚糖構(gòu)型改變，減少了負(fù)載酶的空間位阻，有利于酶活性中心與底物接觸，提高了酶的相對活性。

2.3.5 重復(fù)使用率對固定化酶活性的影響 由圖9可知，碳納米管固定化酶的相對活性隨著重復(fù)利用次數(shù)的增加失活速率較快，而肉桂醛/殼聚糖/碳納米管固定化酶的相對活性相對穩(wěn)定，重復(fù)使用7次后，肉桂醛/殼聚糖/碳納米管固定化酶的相對活性保持在69%，可能是改性殼聚糖有利于酶活性中心穩(wěn)定，在一定程度上避免了酶的失活。

表1 3種碳納米管材料固定化酶性質(zhì)的比較

Table 1 The comparison of three kinds of carbon nanotubes material’s properties on immobilization of enzyme

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用肉桂醛接枝化的殼聚糖對碳納米管表面成功進(jìn)行了修飾并制備了一種新型的復(fù)合載體材料。通過傅立葉紅外光譜(FT-IR)、X射線衍射(XRD)、熱分析系統(tǒng)(TGA)、透射電鏡(TEM)對該肉桂醛/殼聚糖/碳納米管復(fù)合材料及相應(yīng)中間產(chǎn)物進(jìn)行比較分析，表征了其結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果表明：① 肉桂醛成功接枝在殼聚糖分子鏈中；② 肉桂醛/殼聚糖對碳納米管表面成功地進(jìn)行了修飾，改善了碳納米管的團(tuán)聚現(xiàn)象，并得到肉桂醛/殼聚糖在碳納米管上負(fù)載量大約為23%。肉桂醛/殼聚糖改性碳納米管的方法，為碳納米管充當(dāng)活性分子的載體提供了新的解決途徑。

通過對肉桂醛/殼聚糖/碳納米管復(fù)合材料的固定化脂肪酶性質(zhì)進(jìn)行分析得出，當(dāng)肉桂醛與殼聚糖中游離氨基的物質(zhì)的量之比為4∶1，PBS緩沖液pH=7.0，酶濃度為5 mg/mL時，肉桂醛/殼聚糖/碳納米管負(fù)載酶量最大，達(dá)到248 mg/g，酶活性為8 064 U/g，且重復(fù)利用7次后，酶相對活性依然保持在69%左右。

本試驗(yàn)中仍需進(jìn)一步研究探索的部分：① 肉桂醛/殼聚糖在碳納米管表面的空間構(gòu)象，可以通過分子對接模擬試驗(yàn)來研究；② 肉桂醛/殼聚糖對酶蛋白活性位點(diǎn)影響的機(jī)理。

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Preparation of carbon nanotube composite functionalized by cinnamaldehyde/chitosan and application for lipase immobilization

LIU WeiJIACheng-shengZHANGXiao-mingXIAShu-qin

(SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China)

Using chitosan modified by cinnamaldehyde to decorate carbon nanotubes, a novel cinnamaldehyde/ chitosan/ carbon nanotubes composites were synthesized. The modified composites and its corresponding intermediates were characterized by FT-IR, XRD, high-resolution SEM and TGA. Taking porcine pancreatic lipase as a model, explored the properties of cinnamaldehyde/ chitosan/ carbon nanotubes composite materials. The results indicated that when the conditions were: molar ratio of cinnamaldehyde to chitosan of 4∶1, pH =7.0 and the enzyme concentration of 5 mg/mL, and the maximum load of 248 mg/g and the enzyme activity of 8 064 U/g were obtained. The enzyme activity was still above 69% after seven recycles.

carbon nanotubes; cinnamaldehyde; chitosan; non covalent modification; immobilization of enzyme

江蘇省自然科學(xué)基金(編號：BK20161133)

劉威，男，江南大學(xué)在讀碩士研究生。

賈承勝 (1968—)，男，江南大學(xué)副教授，博士。 E-mail:840646207@qq.com

2017-02-20

10.13652/J.ISSN.1003-5788.2017.03.002