沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)基的優(yōu)化研究

幸晶晶，王瑞品，柳忠玉 (長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

馬立安 (長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；長江大學(xué)荊楚特色食品研發(fā)中心，湖北 荊州 434025)

沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)基的優(yōu)化研究

幸晶晶，王瑞品，柳忠玉
(長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

馬立安
(長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；長江大學(xué)荊楚特色食品研發(fā)中心，湖北 荊州 434025)

為有效促進(jìn)沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)的生長和繁殖，采用單因素試驗和正交試驗對其培養(yǎng)基配方進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，最佳培養(yǎng)基組成配方為:乙酸鈉3.8g/L，氯化銨1.3g/L，酵母膏0.7g/L，微量元素0.8 mL/L。在此條件下培養(yǎng)，沼澤紅假單胞菌菌液D660nm值可達(dá) 2.186，比優(yōu)化前提高了29.4%。

沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)；培養(yǎng)基；優(yōu)化

光合細(xì)菌(Photosynthetic Bacteria，PSB)是一類具有原始光合體系、能在厭氧或兼性厭氧環(huán)境中進(jìn)行光合作用不產(chǎn)氧氣的原核生物總稱。光合菌具有固碳、產(chǎn)氫、可氧化和分解硫化氫及多種毒物的能力[1～3]。沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)是光合細(xì)菌的代表菌株之一。沼澤紅假單胞菌作為養(yǎng)殖水質(zhì)凈化劑，早已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，可有效降低對蝦養(yǎng)殖廢水中的化學(xué)需氧量(Chemical Oxygen Demand，COD)。沼澤紅假單胞菌富含各種生物活性蛋白、泛酸、葉酸和多種維生素，可作為飼料添加劑用于經(jīng)濟(jì)動物的養(yǎng)殖[4～7]。沼澤紅假單胞菌也能加速植物對養(yǎng)分的吸收和轉(zhuǎn)化，有利于提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，同時又能夠改善土壤菌群的分布，提高土壤的肥力[8,9]。但是，沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)基成分以及各種培養(yǎng)條件的研究仍然是制約該菌廣泛應(yīng)用的主要因素之一[10]。本研究旨在對沼澤紅假單胞菌的培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，簡化生產(chǎn)配方，降低生產(chǎn)成本，以期為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)沼澤紅假單胞菌菌劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

沼澤紅假單胞菌為長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室保藏。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分：乙酸鈉、氯化銨、酵母膏、微量元素(由FeCl3·6H2O 5mg、CuSO4·5H2O 0.05mg、H3BO41mg、MnCl2·4H2O 0.05mg、ZnSO4·7H2O 1mg、CO(NO3)2·6H2O 0.5mg溶于蒸餾水中，并定容至1000mL配制而成)、蒸餾水。

1.2 方法1.2.1 菌種的活化

將實驗室保存的菌株在無雜菌的條件下轉(zhuǎn)接 3 次，接種量10%，于 32℃、1500 lx 光照條件下培養(yǎng) 72h。

1.2.2 單因素試驗

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加4.2g/L乙酸鈉、0.8g/L酵母膏、1mL/L微量元素，先改變氯化銨濃度(1.1、1.3、1.5g/L)，確定最優(yōu)的氯化銨濃度；接著在最優(yōu)的氯化銨濃度基礎(chǔ)上改變酵母膏的濃度(0.5、0.6、0.7g/L)，確定最優(yōu)的酵母膏濃度；再在優(yōu)化的氯化銨、酵母膏濃度基礎(chǔ)上改變微量元素的濃度(0.0、0.4、0.6、0.8、1.0mL/L)，確定最優(yōu)的微量元素濃度；最后在優(yōu)化的氯化銨、酵母膏、微量元素濃度基礎(chǔ)上改變乙酸鈉濃度(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5g/L)，確定最優(yōu)的乙酸鈉濃度。

1.2.3 正交試驗

采用 L9 (34)正交試驗設(shè)計，選擇沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)基中上述4種成分作為試驗的因素，每個因素選3個水平，分別進(jìn)行試驗組合。然后對這 9 種不同組合的培養(yǎng)基按 10%接種量分別接種沼澤紅假單胞菌菌株，于 32℃、1500lx 光照條件下培養(yǎng) 72h，測定培養(yǎng)液的光密度D660nm值。

2 結(jié)果與分析

2.1 氯化銨對沼澤紅假單胞菌生長的影響

注：不同字母表示組間顯著性差異(P<0.05)，圖2～4同。圖1 不同濃度氯化銨下沼澤紅假單胞菌的生長情況

圖2 不同濃度酵母膏下沼澤紅假單胞菌的生長情況

不同濃度氯化銨下的沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)液D660nm測定結(jié)果如圖1 所示。由圖1可見，沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)液的D660nm值隨著氯化銨濃度的升高呈先上升后下降的趨勢，但不同濃度氯化銨下的沼澤紅假單胞菌生長沒有顯著影響(P> 0.05)，當(dāng)氯化銨濃度為 1.3g/L 時，沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)液的D660nm值稍高，因此，后續(xù)試驗中氯化銨的濃度采用1.3g/L。

2.2 酵母膏對沼澤紅假單胞菌生長的影響

不同濃度酵母膏下的沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)液D660nm測定結(jié)果如圖2 所示。由圖2可見，沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)液的D660nm值隨著酵母膏濃度的升高而上升，當(dāng)酵母膏濃度為 0.7g/L時，沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)液的D660nm值最高，且顯著高于其他濃度組 (P<0.05)。因此，后續(xù)試驗中酵母膏的濃度采用0.7g/L。

2.3 微量元素對沼澤紅假單胞菌生長的影響

不同濃度微量元素下的沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)液D660nm測定結(jié)果如圖3 所示。由圖3可見，在培養(yǎng)基中添加微量元素的條件下，沼澤紅假單胞菌的D660nm值顯著高于不加微量元素的對照組(P<0.05)，沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)液的D660nm值隨著微量元素濃度的升高呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)微量元素濃度為0.6mL/L 時，沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)液的D660nm值最高，因此，后續(xù)實驗中微量元素的濃度采用0.6mL/L。

2.4 乙酸鈉對沼澤紅假單胞菌生長的影響

不同濃度乙酸鈉下的沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)液D660nm測定結(jié)果如圖4所示。由圖4可見，沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)液的D660nm值隨著乙酸鈉濃度的升高呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)乙酸鈉濃度為4.0g/L時，沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)液的D660nm值最高，且顯著高于其他濃度組(P<0.05)。

2.5 培養(yǎng)基配方優(yōu)化的正交試驗

采用L9(34)正交試驗對培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，對乙酸鈉、氯化銨、酵母膏及微量元素進(jìn)行4因素3水平的正交試驗，考察培養(yǎng)基組分對沼澤紅假單胞菌生長影響，選取最優(yōu)的培養(yǎng)基配方。正交試驗因素水平見表1，正交試驗結(jié)果見表2。由表2可得出，培養(yǎng)基成分對沼澤紅假單胞菌生長的影響順序為D>A>B>C，微量元素對沼澤紅假單胞菌生長的影響最大，酵母膏對生長的影響最小。最終確定優(yōu)化培養(yǎng)基的組分為A2B2C3D3，即乙酸鈉3.8g/L、氯化銨1.3g/L、酵母膏0.7g/L、微量元素0.8mL/L。在此條件下培養(yǎng)，沼澤紅假單胞菌D660nm值可達(dá)2.186，比優(yōu)化前提高了29.4%。

圖3 不同濃度微量元素下沼澤紅假單胞菌的生長情況圖4 不同濃度微量元素下沼澤紅假單胞菌的生長情況

表1 因素水平表

表2 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗結(jié)果

3 討論與小結(jié)

近年研究發(fā)現(xiàn)，pH、溫度、接種量、光照強(qiáng)度等因素影響沼澤紅假單胞菌的生長，并且它們之間又相互影響[10～15]。本研究在自然pH、37℃培養(yǎng)箱條件下重點考察了培養(yǎng)基成分對沼澤紅假單胞菌生長的影響。在沼澤紅假單胞菌株培養(yǎng)基組成的優(yōu)化試驗中，對正交試驗設(shè)計得到的9種配方組合分別進(jìn)行了培養(yǎng)試驗，其結(jié)果顯示最優(yōu)配方組合為:乙酸鈉為3.8g/L，氯化銨1.3g/L，酵母膏0.7g/L，微量元素0.8mL/L。在此條件下培養(yǎng)，沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)液D660nm值可達(dá)2.186，比優(yōu)化前提高了29.4%，說明該配方培養(yǎng)基可顯著促進(jìn)沼澤紅假單胞菌的生長和繁殖。由于沼澤紅假單胞菌在農(nóng)作物、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及污水凈化方面應(yīng)用效果較多。因此，對沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)的最優(yōu)化培養(yǎng)基成分配搭和培養(yǎng)條件的研究，可為該類光合菌的規(guī)模培養(yǎng)和工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

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[編輯] 余文斌

2016-10-14

幸晶晶(1993-)，女，碩士生，研究方向為食品微生物與生態(tài)學(xué)。通信作者：馬立安，malian@yangtzeu.edu.cn;柳忠玉，179595859@qq.com。

Q935

A

1673-1409(2017)02-0042-04

[引著格式]幸晶晶，王瑞品，柳忠玉，等.沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)基的優(yōu)化研究[J].長江大學(xué)學(xué)報(自科版)，2017，14(2)：42～45.