擬層孔菌屬中7種羊毛甾烷型三萜抗腫瘤活性及構(gòu)效關(guān)系研究

史幀婷+包海鷹+馮爽

[摘要]對(duì)擬層孔菌屬中紅緣擬層孔菌Fomitopsis pinicola和藥用擬層孔菌F. officinalis子實(shí)體的7種羊毛甾烷型三萜類化合物fomitopsin C（1）、3-酮基-去氫硫色多孔菌酸（2）、去氫齒孔酮酸（3）、3-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯-21-酸（4）、松苓酸A（5）、栓菌酸（6）和齒孔酸（7）進(jìn)行了分離純化；體外抗腫瘤方面，采用MTT法測(cè)試7種單體化合物對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人宮頸癌Hela細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞和人肺癌A549細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明7種化合物對(duì)MCF-7細(xì)胞較為敏感，對(duì)MCF-7半數(shù)抑制濃度IC₅₀為2<5<4<1<3<6<7；體內(nèi)抗腫瘤方面，采用H22荷瘤小鼠模型，對(duì)比研究體外抗腫瘤活性較好的化合物2～5對(duì)小鼠的影響，結(jié)果表明化合物2和化合物4抗腫瘤活性好，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系，化合物2， 4， 5劑量為20 mg·kg^-1時(shí)的抑瘤率分別為65.31%， 59.75%， 58.72%，接近陽(yáng)性藥組的抑瘤率69.19%；近一步試驗(yàn)表明抗腫瘤作用與抑制VEGF表達(dá)和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)，對(duì)細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ表達(dá)的影響較大，與抗氧化作用關(guān)聯(lián)性較少，根據(jù)結(jié)果推斷出羊毛甾烷型四環(huán)三萜結(jié)構(gòu)抗腫瘤構(gòu)效關(guān)系可能為，在3位羥基被酮基或乙?；〈虲環(huán)中15位連有羥基時(shí)，此類化合物的抗腫瘤作用增強(qiáng)。

[關(guān)鍵詞] 紅緣擬層孔菌； 藥用擬層孔菌； 羊毛甾烷型四環(huán)三萜； 抗腫瘤； 構(gòu)效關(guān)系

[Abstract] Seven lanostane-type triterpenes including fomitopsin C（1），3-keto-dehydrosulfurenic acid（2），dehydroeburiconic acid（3），3-acetyloxylanosta-8， 24-dien-21-oic acid（4），pinicolic acid A（5），trametenolic acid B（6），and eburicoic acid（7），were isolated from the fruitbodies of Fomitopsis pinicola and F. officinalis. In vitro assay， all compounds were evaluated against MCF-7， HeLa， HepG2 and A549 cells lines using the MTT assay and the structure-activity relationship of antitumor activity was discussed. The results showed that the seven compounds were more sensitive to MCF-7 cells.The IC50 value for MCF-7 was 2<5<4<1<3<6<7. H22 tumor mouse model was used to assay compounds 2， 3， 4 and 5 in vivo. Compounds 2 and 4 had obvious effect and the necrosis area and measurement were positively correlated. The results showed that compounds 2， 4 and 5 had significant antitumor activities at a dose of 20 mg·L^-1with 65.31%， 56.71%， 58.72% suppression， respectively， approaching to CTX group with 69.19% suppression in subcutaneous H22-implanted mice.The results showed that these compounds had significant against the expression of VEGF，cytokines IL-4 and IFN-γ tumor， additionally， the structure-activity relationship of lanostane-type triterpenes indicated that the acetoxyl or carbonyl at C-3 and hydroxy at C-15 can enhance the antitumor activity.

[Key words] Fomitopsis pinicola； Fomitopsis officinalis； lanostane-type triterpenes； antitumor； structure-activity relationship

癌癥疾病人們談之色變，它是人類健康的主要威脅之一，其分布廣、患者多，目前各國(guó)學(xué)者對(duì)其研究一直火熱，本研究以隸屬于真菌界Fungi，擔(dān)子菌門(mén)Basidiomycota，擔(dān)子菌綱Basidiomy cetes，多孔菌目Polyporales，多孔菌科Polyporaceac擬層孔菌屬Fomitopsis紅緣擬層孔菌F. pinicola和藥用擬層孔菌F. officinalis子實(shí)體為試驗(yàn)原材料^[1]，紅緣擬層孔菌其味微苦、性平，具滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正培本、祛風(fēng)除濕、安神定志和強(qiáng)心等作用，在東北地區(qū)民間當(dāng)作“桑黃”藥用^[2]，趙興華等^[3-5]研究表明其子實(shí)體和發(fā)酵產(chǎn)物氯仿提取物均具有較高的抑瘤率，能夠顯著地延長(zhǎng)小鼠的生存率，并證明了3-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯-21-酸和松苓酸A為其活性成分。藥用擬層孔菌在新疆被稱為“阿里紅”，是維吾爾醫(yī)常用的民族藥材，用于治療腹痛、感冒、肺結(jié)核患者盜汗和慢性氣管炎^[6]。研究表明其子實(shí)體乙酸乙酯提取層具有非常好的抗腫瘤活性及提高機(jī)體免疫力的活性，進(jìn)一步研究表明3-酮基-去氫硫色多孔菌酸，去氫齒孔酮酸為其活性成分^[7-8]。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，分離得到的7種羊毛甾烷型三萜類化合物：fomitopsin C（1）、3-酮基-去氫硫色多孔菌酸（2）、去氫齒孔酮酸（3）、3-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯-21-酸（4）、松苓酸A（5）、栓菌酸（6）和齒孔酸（7），進(jìn)行了體內(nèi)外的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，并對(duì)其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了分析。

1 材料

原材料：藥用擬層孔菌子實(shí)體F. officinalis采自內(nèi)蒙古阿爾山，紅緣擬層孔菌子實(shí)體F. pinicola采自吉林省長(zhǎng)白山，均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心圖力古爾教授鑒定。

瘤株：人乳腺癌細(xì)胞 MCF-7、人宮頸癌細(xì)胞Hela、人肝癌細(xì)胞 HepG2和人肺癌細(xì)胞A549均由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部藥理實(shí)驗(yàn)室提供。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)昆明種小鼠，雌性，5～6 周齡，體重18～22 g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXH-（吉）2015-0067。

萬(wàn)能高速粉碎機(jī)（奧豪斯儀器（上海）有限公司）、 N-1200B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）、 A-1000S型循環(huán)水真空泵（上海愛(ài)朗儀器有限公司）、 DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、RY-2型顯微熔點(diǎn)檢測(cè)儀（天津市國(guó)銘醫(yī)藥設(shè)備有限公司）、 AUY電子分析天平（日本SHIMAOZU公司）、 WFH-308B手提式紫外分析儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）、SB-54原子吸收分光光度計(jì)（Avanta PN GBC，Australia）、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、甲醛（北京化工廠）、MCO-15AC型CO₂培養(yǎng)箱（SANYO）、A-5082酶標(biāo)儀（Sunrise）；新生牛血清（杭州四季青公司）；青霉素和鏈霉素（華北制藥有限公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基，MTT （Sigma），A-5082酶標(biāo)儀（Sunrise），RM2016型石蠟切片機(jī)（Leica），TGL-16C離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），高效切片石蠟（上海華永石蠟有限公司），HE染色材料（上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司），MDA，SOD， CAT，GSH-Px，IL-2，IL-4 試劑盒（南京建成生物制品有限公司）。

2 方法

2.1 化合物的提取、分離和純化

藥用擬層孔菌子實(shí)體陰干（5 kg），粉粹后置于提取罐中，利用冷凝回流法，依次使用石油醚（60～90 ℃）提取溫度 65 ℃、乙酸乙酯提取溫度80 ℃分別提取3次，減壓濃縮分別合并浸膏，得到石油醚層（150 g）和乙酸乙酯層浸膏（820 g），將2層提取物浸膏分別用適量80～100目硅膠拌樣，干樣上200～300目及300～400目硅膠柱多次，用石油醚-乙酸乙酯（200∶1～1∶1），石油醚-丙酮（30∶1～1∶1），二氯甲烷-甲醇（50∶1～1∶1）洗脫劑系統(tǒng)進(jìn)行多次梯度洗脫，從石油醚層得到化合物1（60 mg），乙酸乙酯層得到化合物2（1 146 mg）和3（2 582 mg）。紅緣擬層孔菌（5 kg）經(jīng)過(guò)同上方法，得到石油醚層（200 g）和乙酸乙酯層浸膏（790 g），從石油醚層中得到化合物4（400 mg），乙酸乙酯層中得到化合物4（1 164 mg）和5（1 132 mg），經(jīng)過(guò)高效液相制備得到化合物6（98 mg）和7（131 mg），通過(guò)重結(jié)晶等方法對(duì)得到的7個(gè)化合物進(jìn)行純化。

2.2 體外抗腫瘤活性研究

本研究采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率，將人乳腺癌細(xì)胞 MCF-7、人宮頸癌細(xì)胞Hela、人肝癌細(xì)胞 HepG2和人肺癌細(xì)胞A549的細(xì)胞保存管從液氮中取出，迅速轉(zhuǎn)移到37 ℃ 恒溫水域中，不斷振搖直至完全溶解，置于1 000 r·min^-1離心機(jī)中，離心10 min，無(wú)菌條件將細(xì)胞凍存液倒出，移入1 mL完全培養(yǎng)液，輕輕吹打使細(xì)胞懸浮，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，再向培養(yǎng)瓶中加入4 mL完全培養(yǎng)液，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，如有細(xì)胞團(tuán)快，輕輕吹打使細(xì)胞，使呈單個(gè)細(xì)胞分散狀態(tài)，瓶口半旋置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為 5% CO₂，37 ℃和飽和濕度；4種細(xì)胞均為貼壁細(xì)胞，每隔12 h將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部有80%的面積有細(xì)胞附著生長(zhǎng)時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗2次，棄去PBS緩沖液，加入2 mL胰酶，置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞變成圓粒形，輕輕敲打瓶壁，加入1 mL完全培養(yǎng)液，終止消化，并移入到無(wú)菌離心管中，1 000 r·min^-1離心5 min，倒去上清，用1 mL完全培養(yǎng)液輕輕吹懸，并移入到培養(yǎng)瓶中，向培養(yǎng)瓶繼續(xù)中加入4 mL完全培養(yǎng)液，輕輕吹打使細(xì)胞，使呈單個(gè)細(xì)胞分散狀態(tài)，瓶口半旋置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為同上；將傳夠3代的單個(gè)細(xì)胞懸液（6×10⁴個(gè)/mL）接種于96孔板上，每孔100 μL。在培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO₂）中培養(yǎng)24 h后分別加入化合物1～7的不同濃度待測(cè)樣品，終質(zhì)量濃度分別為1.56，3.13，6.25，12.50，25.00，50.00，100.00，200.00 mg·L^-1，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入20 μL的MTT 溶液（5 g·L^-1）。終止培養(yǎng)，吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在570 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值（A），記錄結(jié)果，采用 SPSS 19.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率及半數(shù)抑制濃度（IC₅₀）。

2.3 體內(nèi)抗腫瘤活性研究

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)接近生理?xiàng)l件更能反映出藥物對(duì)機(jī)體的綜合作用，萜類化合物發(fā)揮抗腫瘤的藥理作用基本途徑一般有3種：①抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)；②免疫調(diào)節(jié)；③對(duì)抗自由基。本研究選擇體外抑瘤作用較好的化合物2～5，檢測(cè)對(duì)H22荷瘤小鼠的影響，通過(guò)腫瘤的大小，腫瘤切片細(xì)胞的形態(tài)的變化，腫瘤勻漿液中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF 的含量，檢測(cè)4種單體化合物對(duì)實(shí)體腫瘤本身的影響；通過(guò)檢測(cè)荷瘤小鼠的免疫器官指標(biāo)及血清中免疫因子IL-2，IL-4，IFN-γ，TNF-α 含量的變化，探討4種化合物對(duì)荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響；通過(guò)檢測(cè)荷瘤小鼠肝臟組織勻漿液中MDA，SOD酶，CAT酶，GSH-Px酶含量水平的改變，初步探討4種化合物對(duì)荷瘤小鼠抗氧化功能方面的作用。

參照池夢(mèng)怡^[8]試驗(yàn)方法，建立小鼠H22腹水瘤模型，給藥體積為20 mL·kg^-1，陽(yáng)性組腹腔注射環(huán)磷酞胺（CTX），質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 mg·kg^-1，每48 h 1次；陰性組灌胃生理鹽水20 mL·kg^-1，每24 h 1次；供試組灌胃給藥化合物2～5，其中高劑量組為20 mg·kg^-1，中劑量組為10 mg·kg^-1，低劑量組為5 mg·kg^-1，每隔24 h 1次。連續(xù)10 d后禁食禁水12 h，第11天小鼠眼球靜脈取血靜置30 min，2 000 r·min^-1低溫離心15 min，取血清，利用ELISA法測(cè)免疫因子IL-2，IL-4，TNF-α，IFN-γ的含量，后處死小鼠，取脾臟、胸腺、瘤塊，稱重，計(jì)算胸腺指數(shù)、脾指數(shù)和抑瘤率；每組隨機(jī)選取5個(gè)瘤塊用4 %甲醛固定，待做腫瘤切片用，剩余瘤塊-80 ℃保存，待測(cè)瘤塊中的VEGF；取肝臟，待測(cè)肝臟中MDA，SOD酶，CAT酶，GSH - Px酶的含量，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

抑制率=1-給藥組瘤質(zhì)量模型組瘤質(zhì)量×100%

胸腺（脾）指數(shù)=1 000×胸腺（脾）質(zhì)量體重

3 結(jié)果與分析

3.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定和純度檢測(cè)

MS，¹H-NMR，¹³C-NMR結(jié)合COSY，HSQC，HMBC，ROESY譜圖化合物1～7分別為fomitopsin C^[9]，3-酮基-去氫硫色多孔菌酸^[10-11]，去氫齒孔酮酸，3-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯-21-酸^[12]，松苓酸A^[13]，栓菌酸^[12]，齒孔酸^[14]。經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)，7種純化后的單體化合物純度均在95%以上。

3.2 體外抗腫瘤活性研究

7種化合物對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人宮頸癌Hela細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞和人肺癌A549抑制細(xì)胞增殖的作用，見(jiàn)圖1?；衔?對(duì)4種瘤細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng)，化合物6和化合物7對(duì)4種細(xì)胞的抑制作用較弱。

采用SPSS 19.0軟件對(duì)不同濃度化合物抑瘤率曲線進(jìn)行擬合，見(jiàn)表1。

7種化合物對(duì)MCF-7細(xì)胞較為敏感，對(duì)MCF-7半數(shù)抑制濃度IC₅₀分別為化合物2<化合物5<化合物4<化合物1<化合物3<化合物6<化合物7。

3.3 體內(nèi)抗腫瘤活性研究

3.3.1 H22對(duì)荷瘤小鼠腫瘤的影響 腫瘤的大小可以直接反映出藥物的抑瘤效果，見(jiàn)表2，4種單體化合物對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤都有一定的抑制作用，并呈一定的量效關(guān)系，其中化合物2>化合物4>化合物5>化合物3，化合物2高劑量的抑瘤率達(dá)到了65.31%，化合物4高劑量的抑瘤率達(dá)到了59.75%，接近陽(yáng)性藥環(huán)磷酰胺的抑瘤率69.19%。

通過(guò)觀察HE染色的H22實(shí)體瘤組織切片細(xì)胞形態(tài)，可以從細(xì)胞水平反映藥物對(duì)腫瘤的影響，將腫塊石蠟包埋、切片、HE 染色后置于光鏡下觀察（×200）腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，結(jié)果見(jiàn)圖2，可知模型組小鼠腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞核大，排列緊密，細(xì)胞膜完整，壞死區(qū)少見(jiàn)；用藥組腫瘤細(xì)胞呈局灶性或大片狀壞死，可見(jiàn)大面積紅染的壞死區(qū)，腫瘤組織的排列疏松，腫瘤細(xì)胞失去常規(guī)形態(tài)，并且腫瘤壞死區(qū)的面積與劑量呈正相關(guān)。由此推斷，4種化合物可以使腫瘤細(xì)胞變形、壞死及生長(zhǎng)受到抑制。

利用面積檢測(cè)軟件Motic Images Advanced 3.2對(duì)切片中壞死區(qū)進(jìn)行面積檢測(cè)分析，結(jié)果見(jiàn)表3，綜合比較腫瘤壞死面積化合物2>化合物4>化合物5>化合物3，壞死面積大小與用藥劑量呈現(xiàn)正相關(guān)，與對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用結(jié)果相符。

癌癥的增長(zhǎng)、入侵和轉(zhuǎn)移與血管生成密不可分，VEGF家族參與了血管的形成過(guò)程，并且大多數(shù)的實(shí)體腫瘤都表現(xiàn)出血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的超表達(dá)^[15-17]，與模型組相比，4種化合物的高劑量組對(duì)小鼠腫瘤中VEGF有明顯的抑制作用，可以有效地降低VEGF的表達(dá)，化合物2和化合物4的抑制作用較好，高劑量組可以明顯降低小鼠腫瘤中VEGF的含量，并且存在一定的量效關(guān)系，由此推斷4種化合物抗腫瘤作用與抑制VEGF的表達(dá)相關(guān)，可能是通過(guò)干擾VEGF的表達(dá)這一途徑來(lái)影響血管的形成，從而達(dá)到抗腫瘤的目標(biāo)見(jiàn)表4。

3.3.2 H22對(duì)荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響 脾臟與胸腺是機(jī)體重要的免疫器官，參與調(diào)解機(jī)體的免疫反應(yīng)，見(jiàn)圖3，4，模型組與正常對(duì)照組相比，胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)指數(shù)明顯升高，有可能說(shuō)明小鼠在這階段正處于免疫亢進(jìn)狀態(tài)；而與模型組相比，化合物2和化合物3的高劑量組可使脾臟指數(shù)降低，低劑量組沒(méi)有使脾臟指數(shù)降低，反而明顯升高，由此可以初步推斷化合物2和化合物3為免疫增強(qiáng)劑，但達(dá)到一定的劑量時(shí)，可能有免疫抑制作用；化合物4的作用趨勢(shì)與陽(yáng)性藥相似，說(shuō)明化合物4可能為免疫抑制劑。

血清中的細(xì)胞因子IL-2，IL-4，IFN-γ和TNF-α在精密調(diào)節(jié)機(jī)體自身免疫功能過(guò)程中起主要作用，其中IL-4已經(jīng)被公認(rèn)為是負(fù)向免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，抑制其他炎性因子的長(zhǎng)生，與腫瘤免疫息息相關(guān)^[18]，IFN-γ能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展，并控制Th1 / Th2的平衡^[19]。

與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中的IL-4值升高，IFN-γ的值降低；與模型組相比，各給藥組的IL-4含量均有不同程度的下降，而化合物2，4，5的高劑量組IFN-γ含量有顯著性升高（P<0.01）；4種化合物對(duì)細(xì)胞因子IL-2和TNF-α的表達(dá)影響較小，見(jiàn)表5。

3.3.3 H22對(duì)荷瘤小鼠抗氧化功能的影響 氧化應(yīng)激反應(yīng)與腫瘤密切相關(guān)，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、預(yù)防和治療的各個(gè)階段^[20]，腫瘤患者機(jī)體中氧化還原酶系統(tǒng)（包含的酶有CAT，SOD，GSH-Px及GR等^[21-22]）不能對(duì)腫瘤細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生進(jìn)行正常的調(diào)控，而活性氧的增多可增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生有害的氧化產(chǎn)物，如MDA^[23]。本研究對(duì)4種化合物作用到H22荷瘤小鼠后，肝臟中CAT，SOD，GSH-Px 3種酶水平及MDA含量的進(jìn)行了檢測(cè)，見(jiàn)表6，與模型相比，各給藥組的MDA含量均有不同程度的下降，而各化合物高劑量組的MDA含量顯著性降低（P<0.05）；與模型組相比，各給藥組對(duì)SOD和CAT含量水平影響小，只有化合物2中劑量和化合物5高劑量組顯著性升高（P<0.05）；與模型組及環(huán)磷酰胺組相比，各給藥組GSH-Px含量均升高，各化合物的高劑量組GSH-Px的含量顯著性升高（P<0.05），結(jié)果顯示，4種化合物對(duì)CAT酶和SOD酶幾乎沒(méi)影響，僅高劑量組可以降低MDA含量，升高GSH-Px的水平，推斷4種化合物的抗腫瘤作用的機(jī)制與抗氧化作用關(guān)聯(lián)性較少。

3.4 構(gòu)效關(guān)系分析

本研究對(duì)分離的7種羊毛甾烷型三萜類化合物進(jìn)行了初步的構(gòu)效關(guān)系討論，化合物1，4～7結(jié)構(gòu)中8，9位碳是雙鍵，化合物2，3母核結(jié)構(gòu)中的雙鍵位置是7，9（11）共軛結(jié)構(gòu)，2類物質(zhì)的IC₅₀沒(méi)有特別明顯的差異，故在體外抑瘤作用中，母核上雙鍵的位置對(duì)抗人肝癌HepG2功效影響較小。化合物2在結(jié)構(gòu)上比化合物3在15位多了1個(gè)羥基，而化合物2，3的抗腫瘤活性差別較大，說(shuō)明C-15位置上的羥基有助于化合物抗腫瘤活性的增強(qiáng)?；衔?在3位有乙酰氧基，IC₅₀較小，說(shuō)明3位酯基取代能增強(qiáng)抗腫瘤活性?；衔?的13位羥基與26位羧基發(fā)生分子內(nèi)酯化，在13位形成聚酮結(jié)構(gòu)，化合物1的IC₅₀較大，分子間酯化對(duì)抗腫瘤作用的影響還有待進(jìn)一步研究?；衔?與化合物3相比較，結(jié)構(gòu)上僅在15位多1個(gè)羥基，化合物4與化合物5相比較，結(jié)構(gòu)上僅是3位取代基不同，體內(nèi)抗腫瘤構(gòu)效研究表明，在腫瘤抑制率、抑制VEGF表達(dá)方面，3位是乙酰氧基，C環(huán)中15位連有羥基可以增強(qiáng)抑制腫瘤的效果?；衔?與化合物3對(duì)免疫器官的影響趨勢(shì)相似，化合物2和化合物3母核結(jié)構(gòu)中的雙鍵位置是7，9（11）共軛結(jié)構(gòu)，并且側(cè)鏈雙鍵為24與31位碳形成的雙鍵，故在體內(nèi)抑瘤作用中，結(jié)構(gòu)上雙鍵的位置可能影響著荷瘤小鼠的免疫調(diào)節(jié)功能。

4 討論

關(guān)于羊毛甾烷型三萜的抗腫瘤構(gòu)效關(guān)系及機(jī)制研究目前還處于初期階段，本研究采用MTT法測(cè)試了7種羊毛甾烷型三萜類化合物對(duì)MCF-7細(xì)胞、Hela細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和A549細(xì)胞增殖的影響，對(duì)其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了分析，并選取了體外活性較好的單體化合物2～5，以移植實(shí)體瘤、免疫器官、細(xì)胞因子和肝臟酶系作為考察指標(biāo)，研究4種化合物對(duì)H22荷瘤小鼠的整體影響，初步探索了4種化合物在體內(nèi)抗腫瘤方面與結(jié)構(gòu)是否存在一定的關(guān)聯(lián)性以及抗腫瘤的作用機(jī)制。結(jié)果表明，7種化合物對(duì)MCF-7細(xì)胞較為敏感，化合物2～5可以使腫瘤細(xì)胞變形、壞死及生長(zhǎng)受到抑制，對(duì)細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ表達(dá)的影響較大，其抗腫瘤作用與抑制VEGF表達(dá)和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)，可能是通過(guò)干擾VEGF的表達(dá)及免疫調(diào)節(jié)這一途徑，來(lái)影響血管的形成和提高機(jī)體的免疫力，從而達(dá)到抗腫瘤的目標(biāo)，抗腫瘤作用的機(jī)制與抗氧化作用關(guān)聯(lián)性較少。體內(nèi)抗腫瘤構(gòu)效研究表明，在腫瘤抑制率和抑制VEGF表達(dá)方面，3位是乙酰氧基，C環(huán)中15位連有羥基可以增強(qiáng)抑制效果，與體外抗腫瘤構(gòu)效關(guān)系相近；另外，在調(diào)節(jié)脾臟指數(shù)方面，母核為7，9（11）共軛結(jié)構(gòu)，側(cè)鏈為24（31）-烯-21酸的化合物表現(xiàn)出構(gòu)效關(guān)系傾向。綜合研究結(jié)果表明，其中3位羥基被酮基或乙?；〈c15位連有羥基可以增強(qiáng)抑瘤作用，這一構(gòu)效關(guān)系在體內(nèi)外抗腫瘤方面均成立，其中化合物2和化合物4的體外體內(nèi)抗腫瘤活性好，有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和研究的價(jià)值。本研究為多孔菌的研究開(kāi)發(fā)和羊毛甾烷型三萜作為天然抗腫瘤藥物等研究奠定了基礎(chǔ)，為4種化合物在抗腫瘤作用方面的繼續(xù)研究提供一定的研究基礎(chǔ)，為羊毛甾烷型三萜化合物及其衍生物藥理活性和構(gòu)效關(guān)系的研究提供了參考。

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