玄參內(nèi)生真菌分離、鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

伍曉麗+宋旭紅+楊宏國+劉飛+張雪+劉金亮+陳大霞+李隆云

[摘要]分別從武隆產(chǎn)區(qū)玄參根、主莖、側(cè)枝、葉片和重慶市區(qū)栽培玄參側(cè)枝中分離內(nèi)生真菌，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和26SrDNA D1/D2測序結(jié)果對其進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行了種群多樣性分析，對優(yōu)勢屬炭疽菌屬內(nèi)生真菌構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。試驗結(jié)果顯示：真菌種群多樣性指數(shù)，武隆玄參葉片>主莖=側(cè)枝>根，重慶玄參側(cè)枝>武隆玄參側(cè)枝。共計分離得到內(nèi)生真菌58株，絕大部分是各種植物病原菌，其優(yōu)勢屬為刺盤孢屬Colletotrichum，其中絕大多數(shù)是C. gloeosporioides和C. boninense。葉片和子芽可能是內(nèi)生菌侵染的主要途徑；內(nèi)生菌和病原菌可能相互轉(zhuǎn)化，受環(huán)境、基因型等多種因素影響。

[關(guān)鍵詞] 玄參； 內(nèi)生真菌； 鑒定； 系統(tǒng)發(fā)育分析

[Abstract] The endophytic fungi from root， main stem， branch and leaf of Scrophularia ningpoensis were isolated and identified from Wulong and Chongqing， and the population diversity analysis and phylogenetic analysis were followed. The result indicated that， as to population diversity index， S. ningpoensis from Wulong： leaf>main stem = branch>root， branch from Chongqing>branch from Wulong. Fifty-eight endophytic fungi were obtained， most of which were the pathogens of the plant. Colletotrichum was the prevailing genus， of which C. gloeosporioides and C. boninense were the prevailing strains. Leaf and seedlings might be the main path of infection. Endophytic fungi and pathogen might convert to each other， influenced by such factors as environment， genotype et al.

[Key word] Scrophularia ningpoensis； endophytic fungi； identification； phylogenetic analysis

玄參為玄參科玄參屬植物玄參Scrophularia ningpoensis的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性微寒，味甘、苦、咸，具有涼血滋陰、瀉火解毒的功效，主治熱病傷陰諸證，如骨蒸、癆咳、津傷便秘、溫毒發(fā)斑，及目赤、咽痛、臃腫等^[1]。玄參是我國大宗藥材品種，市場需求巨大。目前玄參栽培以施用化肥為主，多年連續(xù)施用影響藥材品質(zhì)，損害土壤肥力，破壞生態(tài)環(huán)境。而很多植物內(nèi)生菌對宿主具有明顯的促生作用。內(nèi)生菌（endophyte） 廣泛存在于植物各器官、組織細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間隙，其種類隨宿主植物種類、植株器官、地域、季節(jié)氣候而變化，具有豐富的多樣性，國內(nèi)外相關(guān)研究報道很多[2-5]。有研究表明，內(nèi)生菌及其代謝產(chǎn)物具有拮抗、促生長、抗腫瘤等多種活性，可廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥領(lǐng)域^[6-9]。玄參內(nèi)生菌方面的研究極少，僅見文獻(xiàn)報道了玄參塊根內(nèi)生菌產(chǎn)哈巴俄苷的相關(guān)研究，且未明確鑒定出內(nèi)生菌的種類^[10]。本研究對玄參內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離和鑒定，并對優(yōu)勢屬炭疽菌屬內(nèi)生真菌進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，旨在為篩選對玄參具有促生長作用的內(nèi)生真菌，研發(fā)微生物肥料，減少化肥施用奠定基礎(chǔ)。同時也揭示了玄參內(nèi)生真菌的分布規(guī)律，為進(jìn)一步研究玄參化學(xué)成分與內(nèi)生菌的相關(guān)性，篩選活性物質(zhì)提供前期基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試驗材料采集

2015年8月，在玄參生長盛期，分別采取重慶市中藥研究院植物園（以下簡稱植物園，海拔400 m，北緯29.35°，東經(jīng)106.33°）人工栽培玄參的側(cè)枝和重慶武隆仙女山楊柳村玄參基地（海拔1 350 m，北緯 29.43°，東經(jīng) 107.77°）人工栽培玄參全株（葉、主莖、側(cè)枝、根），采回后立即進(jìn)行內(nèi)生真菌分離。

1.2 試劑與儀器

Takara9164和RR178試劑盒購自寶生物公司。DYY-6C水平電泳儀，PTC-100 型 PCR儀，Gel Doc XR凝膠成像儀。

1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：土豆200 g，切碎塊，煮汁過濾，加葡萄糖20 g，瓊脂粉7 g，定容至1 L。

2 方法

2.1 內(nèi)生真菌分離與純化

植物園栽培玄參植株上部、中部、下部健壯無病蟲害側(cè)枝各取3～5枝，全部混合后剪3 cm長小段。仙女山玄參植株分解為塊根、主莖、側(cè)枝、葉片。塊根洗去泥土，輕輕刮去表面薄皮，洗凈，切小塊；植株主莖上部、中部、下部各取一段（約15～20 cm長）后混合，剪3 cm長小段；植株上部、中部、下部健壯無病蟲害側(cè)枝各取3～5枝，全部混合后剪3 cm長小段；植株上部、中部、下部健壯無病蟲害葉片各取4～6片后全部混合，剪3～4 cm²小塊。以上材料用洗衣粉水洗滌2 min，流水沖洗40 min，75%乙醇洗滌1 min，0.1%升汞消毒5 min，無菌水洗滌4次，取最后一次洗滌的洗液數(shù)滴于PDA涂布，共接種3皿，作為對照。材料用無菌濾紙吸干后，再次將根塊分為1 cm²小薄片，莖段剪0.5～1 cm長小段，葉片切0.5～1 cm²小片，接種PDA。對照和材料均置于25 ℃培養(yǎng)箱，黑暗，培養(yǎng)5～10 d后，挑取組織周圍長出的菌絲轉(zhuǎn)接入 PDA平板中純化，直到得到純凈無污染的菌落。

2.2 內(nèi)生真菌鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察 觀察培養(yǎng)的內(nèi)生真菌菌落形態(tài)，對照《真菌鑒定手冊》[11]，根據(jù)菌落以及菌絲體和孢子的形態(tài)特征進(jìn)行鑒定。

2.2.2 分子鑒定 采用Takara9164和RR178試劑盒對分離出的內(nèi)生真菌進(jìn)行基因組 DNA 提取及26S rDNA D1/D2區(qū)域序列 PCR擴(kuò)增。

真菌基因組DNA提?。禾羧∩倭烤z體于1.5 mL EP管，加入Takara 9164 真菌裂解液50 μL，80 ℃水浴15 min，4 000 r·min^-1離心，取上清液作為PCR模板。

PCR（50 μL） 體系：ddH₂O 20 μL；PCR premix（Takara） 25 μL；真菌DNA模板 4 μL；D1/D2 Forward Primer和D1/D2 Reverse Primer（Takara）各0.5 μL PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次，72 ℃延伸 10 min。 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送華大基因公司測序。

2.3 種群多樣性分析

定義 ITS-rDNA 序列同源性大于97%，同屬菌株作為同一分類單元^[12]，計算Shannon-Wiener 指數(shù)（H）^[13]。H=-∑（P_i）（log₂P_i），P_i為樣品中屬于第i種的個體的比例。

2.4 DNA 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

登陸NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）利用 BLAST將測序獲得的各菌株26S rDNA D1/D2區(qū)域序列與GenBank中的已知序列進(jìn)行比對，查找相似性最高的菌種，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定分離菌株的分類地位。并用MEGA6.0 軟件按照鄰接法（Neighbour-Joining，N-J），自展數(shù)（bootstrap）為 1 000，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 玄參內(nèi)生真菌的分離

內(nèi)生真菌分離結(jié)果見表1，對照平板沒有菌生長。內(nèi)生真菌含量葉片>側(cè)枝>主莖>根。植物園玄參側(cè)枝>武隆玄參側(cè)枝。研究中還發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌的分離效果還受到培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度等因素影響。但總體來說，根部內(nèi)生菌含量不如莖、葉高。

3.2 玄參內(nèi)生真菌鑒定

玄參內(nèi)生真菌菌落形態(tài)及分子鑒定結(jié)果見表2。分離出的內(nèi)生菌形態(tài)多種多樣，見圖1。

從表2可見，武隆基地玄參內(nèi)生真菌從種類來看，在所有鑒定出的41株菌株中，炭疽菌屬Colletotrichum有24株，占總數(shù)的58.54%；其次是枝穗霉屬Clonostachys 6株和莖點霉屬Phoma 5株，分別占14.63%，12.2%。在24株炭疽菌屬菌株中，有41.67%是膠孢炭疽菌C. gloeosporioides，29.17%是博寧炭疽菌C. boninense。可見炭疽菌屬Colletotrichum是武隆玄參內(nèi)生真菌的優(yōu)勢屬，而其中膠孢炭疽菌C. gloeosporioides和博寧炭疽菌C. boninense是優(yōu)勢種。

從分布部位看，葉片中Colletotrichum占絕對優(yōu)勢，占葉片內(nèi)生真菌總量的71.43%，且以C. gloeosporioides和C. boninense為主；側(cè)枝中Colletotrichum也占絕對優(yōu)勢，占側(cè)枝內(nèi)生真菌總量的77.78%，仍然以C. gloeosporioides和C. boninense為主；主莖中Clonostachys sp.和Phoma sp.各占30%，Colletotrichum數(shù)量上占相對弱勢；根中的內(nèi)生真菌僅2種。

各部位橫向比較，側(cè)枝和葉片中真菌種類接近，均以C. gloeosporioides，C. boninense為主，兼有Clonostachys sp.，Glomerella fioriniae，即側(cè)枝中77.78%的真菌與葉片中真菌一致；而主莖中只有55.56%的真菌在葉片中存在；主莖和側(cè)枝共有的真菌不多，僅有C. gloeosporioides，Clonostachys sp.這2種菌在葉片中也存在；主莖、葉片和根均有Phoma sp.。

植物園的玄參莖部內(nèi)生菌，從種類看，50%是Colletotrichum，其中以C. gloeosporioides為主?？梢姾臀渎⌒?cè)枝一樣，Colletotrichum是優(yōu)勢種屬，C. gloeosporioides是優(yōu)勢種。

將植物園的玄參側(cè)枝內(nèi)生真菌和武隆基地玄參側(cè)枝內(nèi)生真菌橫向比較，C. gloeosporioides 是二者共有的菌，且是相同菌株，均是C. gloeosporioides strain CMT53 和C. gloeosporioides strain HC-73，不過植物園玄參側(cè)枝中的C. gloeosporioides isolate IA11在武隆玄參側(cè)枝中未分離到。

以上真菌，有14株僅鑒定到屬，主要是Phoma sp.，Clonostachys sp.，Penicillium sp.，Phomopsis sp.，說明這14株可能包含尚未發(fā)現(xiàn)的新種。

3.3 玄參內(nèi)生真菌種群多樣性分析

計算多樣性指數(shù)結(jié)果如下：武隆玄參葉片3.268，主莖2.725，側(cè)枝2.725，根1.000，植物園側(cè)枝3.379。以葉片中真菌多樣性最高，其次是主莖和側(cè)枝，根部最低。植物園玄參側(cè)枝內(nèi)生真菌多樣性高于武隆基地玄參植株的側(cè)枝。

3.4 玄參炭疽菌屬內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果

根據(jù)前述分子鑒定結(jié)果，選取20個近緣種的菌株，與分離所得炭疽菌屬菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。

從圖2可見， 13株與C. gloeosporioides的不同株系聚到一起；12株與C. boninense的不同株系聚到一起；2株與C. crassipes聚為一枝；各有1株分別與C. abscissum，C. destructivum，C. kahawae，C. fructicola聚為一枝。C. gloeosporioides組可分為4個亞組，以C. gloeosporioides strain HC-73亞組菌株數(shù)最多；C. boninense組也可分為4個亞組，以C. boninense CMT17亞組的菌株數(shù)最多。

4 討論

4.1 內(nèi)生真菌的普遍性和多樣性

內(nèi)生菌在植物體中的分布具有普遍性、多樣性的特點。在目前研究過的所有植物中均發(fā)現(xiàn)有內(nèi)生菌^[14-15]。各植物體中存在的內(nèi)生菌的數(shù)量、種類受植物的種類、組織、生存環(huán)境、生長階段、營養(yǎng)供給及兩者的基因型等多種因素影響^[16]。本研究結(jié)果再一次證明了同一植株，不同器官的內(nèi)生真菌組成不同；同樣的器官和取材季節(jié)，不同取材地點的玄參側(cè)枝內(nèi)生真菌組成不同。武隆玄參側(cè)枝內(nèi)生真菌多樣性就遠(yuǎn)小于植物園玄參側(cè)枝，推測是由于植物園海拔低（400 m左右），氣溫較高，環(huán)境中真菌種類繁多。而武隆基地海拔高（1 400 m左右），氣溫低，環(huán)境中真菌種類較少。

4.2 玄參內(nèi)生真菌入侵途徑分析

內(nèi)生菌可通過多種途徑對宿主植物進(jìn)行侵染?？蓮闹参锶~片的外表皮滲入，也可以通過分解植物表皮細(xì)胞壁或通過各種自然開口（包括側(cè)根發(fā)生處、氣孔、水孔等）或傷口等傳播途經(jīng)進(jìn)入植物^[17-21]。就玄參而言，內(nèi)生真菌浸染植株可以通過幾個途徑：塊根浸染，子芽帶菌，莖部侵染，葉部侵染。前述真菌多樣性分析結(jié)果和分子鑒定的結(jié)果表明，側(cè)枝中77.78%的真菌與葉片中真菌一致；而主莖中只有55.56%的真菌在葉片中存在；主莖和側(cè)枝共有的真菌僅有C. gloeosporioides，Clonostachys sp.，這2種菌在葉片中也存在；主莖、葉片和根均有Phoma sp.。分析玄參各部位的特性：根部表皮較致密，除了土壤或昆蟲造成的微小傷口，其余部位不利于真菌入侵，且根部組織致密不透氣，水分較多，不利于多數(shù)真菌定殖；葉片表皮細(xì)胞柔軟，有大量氣孔，適合真菌入侵，且葉片內(nèi)部組織疏松透氣，有一定弱光，水分適宜，適合很多真菌定殖；莖部表皮較硬，不適合真菌入侵，但內(nèi)部疏松透氣，水分適宜，適合真菌定殖；此外，筆者曾分離子芽內(nèi)生真菌，得到多達(dá)7個菌，和主莖、側(cè)枝帶菌量相近。根據(jù)以上分析推測，玄參中大多數(shù)內(nèi)生真菌是從葉片（氣孔、傷口等）入侵，經(jīng)側(cè)枝到主莖，最后進(jìn)入根部。其次是子芽本身內(nèi)部帶菌以及褶皺帶菌侵入幼莖。而根部、主莖、側(cè)枝也可以由微小傷口侵染少量內(nèi)生真菌。即葉片是玄參內(nèi)生真菌侵入的主要途徑，子芽帶菌是次要途徑。由此也可以推測，大多數(shù)玄參病原真菌也是由葉片和子芽侵入植株。因此，預(yù)防玄參病害，應(yīng)該主要在葉面噴施藥劑，其次，應(yīng)該選擇健壯無病子芽以及對子芽進(jìn)行殺菌藥劑浸泡。

4.3 內(nèi)生菌和病原菌的關(guān)系探討

目前，植物內(nèi)生菌較被公認(rèn)的定義是指那些在其生活史的一定階段或者全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的真菌或者細(xì)菌，被感染的宿主植物（至少是暫時）不表現(xiàn)出外在癥狀^[22]。它們不僅包括了互惠共利的和中性的內(nèi)生共生微生物，也包括了那些潛伏在宿主體內(nèi)的病原微生物。根據(jù)這個概念，內(nèi)生菌和病原菌的界限就比較模糊。有的內(nèi)生菌對宿主具有一定毒性，在雙方的各種力量處于均衡狀態(tài)，寄主不會產(chǎn)生明顯的病癥。如果這種均衡被破壞，比如在宿主植物衰老或受環(huán)境條件脅迫導(dǎo)致抵抗能力減弱，則內(nèi)生菌有可能使宿主致病或抑制宿主植物生長^[23-24]，即轉(zhuǎn)化為了病原菌。如Faeth^[25]發(fā)現(xiàn)，在貧瘠的土地上感染Festuca arizonica的植物明顯比沒有感染的植株生長慢，而在營養(yǎng)豐富條件下生長的植株則不存在這種現(xiàn)象。此外，曹理想等^[26]發(fā)現(xiàn)健康香蕉葉中的內(nèi)生真菌主要為C. gloeosporioides，占60.7%；而曾大興^[27]的研究文獻(xiàn)提到，C. gloeosporioides和引起香蕉果實腐爛的香蕉炭疽病菌C. musae在分子水平其實差異很小，至今C. musae是獨立的一個種還是屬于C. gloeosporioides仍然存在很大爭議。這從一個側(cè)面佐證了內(nèi)生菌和病原菌其實可能相互轉(zhuǎn)化。

可見，同一植物中，對有的內(nèi)生真菌而言，是作為內(nèi)生菌促進(jìn)宿主生長、對宿主無影響還是作為病原真菌導(dǎo)致宿主病害，受地理位置、季節(jié)、外界小環(huán)境變化、宿主基因型及生理狀態(tài)、真菌自身基因型及活性等多種因素影響。這反映了自然界真菌與植物關(guān)系極其豐富的多樣性、可變性以及動態(tài)平衡。可以據(jù)此推斷，不少病原菌初期就是以內(nèi)生菌方式潛伏于宿主細(xì)胞中。內(nèi)生真菌與宿主植物的關(guān)系見圖3。絕大多數(shù)玄參內(nèi)生真菌是各種植物的病原菌，Phoma sp.還是玄參葉斑病病原，見表3。玄參大田病害比較嚴(yán)重，推測分離出的內(nèi)生真菌中可能有一些是玄參的病原菌，在條件不適宜爆發(fā)時，它們以內(nèi)生菌的形態(tài)潛伏于玄參植株內(nèi)，當(dāng)條件合適，即導(dǎo)致玄參病害。

既然在外界條件適宜時，內(nèi)生菌和致病菌是能夠相互轉(zhuǎn)換的，因此，在防治植物病害時，不能一味被動地在病害爆發(fā)后施用藥劑，而應(yīng)在充分研究發(fā)病條件的基礎(chǔ)上，通過選擇和培育壯苗、選育抗病品種、改變田間通風(fēng)透光條件、選擇栽培適合的地塊等農(nóng)藝措施預(yù)防病害，或在病害發(fā)生后通過這些措施促使致病菌向內(nèi)生菌方向轉(zhuǎn)換，從而治療病害。

下一步筆者擬分別開展分離所得內(nèi)生真菌對玄參的促生長作用和致病性研究，以篩選促生真菌，同時進(jìn)一步研究內(nèi)生菌和病原菌的內(nèi)在聯(lián)系。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]