miR-125b在年齡相關性白內障患者晶狀體前囊膜中的表達及對人晶狀體上皮細胞凋亡的影響

王建民，袁祥文，劉杰慧，李建平

(1萊蕪市人民醫(yī)院，山東萊蕪271100；2山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院)

miR-125b在年齡相關性白內障患者晶狀體前囊膜中的表達及對人晶狀體上皮細胞凋亡的影響

王建民1，袁祥文1，劉杰慧2，李建平2

(1萊蕪市人民醫(yī)院，山東萊蕪271100；2山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院)

目的觀察miR-125b在年齡相關性白內障(ARC)患者晶狀體前囊膜中的表達變化，及miR-125b對晶狀體上皮細胞凋亡的影響。方法收集ARC患者術中獲取的晶狀體前囊膜標本40例份為ARC組，以正常人眼晶狀體前囊膜標本20例份為對照組，采用實時熒光定量PCR法檢測兩組的miR-125b。體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞(HLEC)-SRA01/04，將細胞分為實驗組、凋亡模型組和正常組，實驗組和凋亡模型組采用紫外線照射法制備晶狀體上皮細胞凋亡模型。采用實時熒光定量PCR法檢測凋亡模型組和正常組細胞中的miR-125b。分別將hsa-miR-125b mimics及陰性對照mimics-NC轉染實驗組和凋亡模型組細胞，轉染后48 h采用實時熒光定量PCR法檢測細胞中的miR-125b，用流式細胞儀測算細胞凋亡率，以ELISA法檢測細胞中Caspase3/7活性。結果ARC組與對照組晶狀體前囊膜中miR-125b相對表達量分別為0.37±0.08、1.02±0.04，兩組相比，P<0.01。凋亡模型組與正常組細胞中miR-125b的相對表達量分別為0.45±0.09、1.04±0.03，兩組相比，P<0.01。轉染后48 h實驗組與凋亡模型組細胞凋亡率分別為18.7%±1.89%、52.27%±3.14%，兩組相比，P<0.01。轉染后48 h實驗組與凋亡模型組Caspase-3/7活性分別為168.21±27.36、359.89±36.45，兩組相比，P<0.01。結論ARC患者晶狀體前囊膜中miR-125b呈低表達。過表達的miR-125b能夠抑制晶狀體上皮細胞凋亡，降低凋亡相關酶的活性。

微小RNA125b；白內障；年齡相關性白內障；晶狀體上皮細胞；細胞凋亡

年齡相關性白內障(ARC)是致盲性眼病，發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。ARC的發(fā)病機制目前尚未完全明確，老齡、紫外線、糖尿病、藥物、輻射等因素參與了ARC的發(fā)生發(fā)展。ARC尚無有效的藥物防治手段[2]，因此探討ARC發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制，可能為白內障的預防及治療提供新的思路。晶狀體上皮細胞位于晶狀體前囊膜及赤道部囊膜下，為單層立方上皮。研究[3]表明，晶狀體上皮細胞凋亡是除先天性白內障以外其他所有類型白內障形成的細胞學基礎。微小RNA(miRNA)是一類存在于生物體中能夠調控基因表達的內源性非編碼小分子RNA，可通過降解靶基因mRNA或阻止其蛋白翻譯從而對下游靶基因起到調節(jié)作用，廣泛參與機體細胞增殖、代謝、分化、凋亡等過程[4]。近年研究[5]發(fā)現(xiàn)miRNA表達在眼部呈細胞和組織特異性，在白內障的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的調控作用[6]。miR-125b是miRNAs家族成員之一，在多種組織中起調節(jié)細胞凋亡的作用[7,8]。目前有關miR-125b與ARC發(fā)病關系的研究甚少，為此，本研究觀察了miR-125b在ARC患者晶狀體前囊膜中的表達變化，及miR-125b對晶狀體上皮細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 收集2016年4～7月在山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院眼科住院治療的ARC患者超聲乳化白內障吸除術中獲取的晶狀體前囊膜標本40例份(40眼)作為ARC組，患者中男15例(15眼)、女25例(25眼)，年齡(59.8±12.7)歲。收集角膜移植術后正常供體眼球晶狀體前囊膜標本20例份(20眼)作為對照組，患者中男7例(7眼)、女13例(13眼)，年齡(54.0±10.4)歲。兩組標本來源患者性別、年齡等基線資料差異無統(tǒng)計學意義。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。人晶狀體上皮細胞(HLEC)-SRA01/04購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，細胞復蘇后接種至含10%新生胎牛血清、1%青鏈霉素的a-MEM基礎培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)期細胞進行后續(xù)實驗。hsa-miR-125b mimics及陰性對照mimics-NC均購自廣州銳博生物科技公司；TRIzol試劑和LipofectamineTM2000試劑均購自Invitrogen公司；RNA逆轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生生物工程公司；miR-125b和U6引物由上海吉凱生物制藥公司設計合成；Anexin-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司；po-ONE Homogeneous Caspase3/7檢測試劑盒購自Promega公司。

1.2 ARC患者晶狀體前囊膜中miR-125b表達觀察 采用實時熒光定量PCR法。用TRIzol試劑提取晶狀體前囊膜組織總RNA，測RNA濃度，以1 μg總RNA按逆轉錄試劑盒操作說明書進行反轉錄得到cDNA。配置實時熒光定量PCR體系，擴增條件為95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。實驗重復3次，以U6作為內參，miR-125b的相對表達量以2-ΔΔCt表示。

1.3 miR-125b對晶狀體上皮細胞凋亡的影響觀察

1.3.1 細胞分組及晶狀體上皮細胞凋亡模型制作 將HLEC-SRA01/04分為實驗組、凋亡模型組、正常組。實驗組和凋亡模型組參考文獻[9]方法制作晶狀體上皮細胞凋亡模型。取對數(shù)期的HLEC-SRA01/04，將培養(yǎng)液吸凈，PBS沖洗2次后置于紫外燈下照射25 min，強度360 μW/cm2，光譜280～320 nm，峰值312 nm。將各組細胞以不含EDTA的胰蛋白酶消化，離心收集細胞制成單細胞懸液，每組取細胞懸液5 mL置于流式管中，依次加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，避光反應15 min后加入300 μL的結合緩沖液后立即送流式細胞儀測算細胞凋亡率。凋亡模型組細胞凋亡率明顯高于正常組，表明晶狀體上皮細胞凋亡模型制作成功。

1.3.2 細胞凋亡模型中miR-125b檢測 采用實時熒光定量PCR法檢測凋亡模型組與正常組細胞中的miR-125b。方法同“1.2”。

1.3.3 hsa-miR-125b mimics轉染 將實驗組和凋亡模型組細胞接種于96孔板，當細胞密度為30%～50%時進行轉染。參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書，分別將hsa-miR-125b mimics及陰性對照mimics-NC轉染實驗組和凋亡模型組細胞。經實時熒光定量PCR檢測實驗組和凋亡模型組細胞中miR-125b相對表達量分別為5.78±0.31、1.02±0.04，實驗組細胞中miR-125b相對表達量高于凋亡模型組(P<0.01)，證明轉染成功。

1.3.4 各組細胞凋亡率測算 取轉染后48 h的細胞進行流式細胞術檢測，計算細胞凋亡率。方法同“1.3.1”。

1.3.5 Caspase-3/7活性檢測 取轉染后48 h的細胞，將底物與緩沖液按試劑盒說明書混合后，每孔加入100 μL的Caspase試劑混合液，搖床輕搖混勻30 s，室溫避光孵育2 h，采用ELISA平板計數(shù)器測定490 nm波長處的細胞熒光強度，代表Caspase-3/7活性。

2 結果

2.1 ARC組與對照組晶狀體組織中miR-125b表達比較 ARC組與對照組晶狀體前囊膜中miR-125b相對表達量分別為0.37±0.08、1.02±0.04，兩組相比，P<0.01。

2.2 凋亡模型組與正常組細胞中miR-125b表達比較 凋亡模型組與正常組細胞中miR-125b的相對表達量分別為0.45±0.09、1.04±0.03，兩組相比，P<0.01。

2.3 實驗組與凋亡模型組細胞凋亡率比較 轉染后48 h實驗組與凋亡模型組細胞凋亡率分別為18.7%±1.89%、52.27%±3.14%，兩組相比，P<0.01。

2.4 實驗組與凋亡模型組Caspase-3/7活性比較 轉染后48 h實驗組與凋亡模型組Caspase-3/7活性分別為168.21±27.36、359.89±36.45，兩組相比，P<0.01。

3 討論

白內障是晶狀體衰老的一種表現(xiàn)，是多種因素作用共同作用的結果，如氧化損傷、長期紫外線照射、輻射等。晶狀體上皮細胞的活性狀態(tài)與晶狀體的透明性密切相關，晶狀體上皮細胞衰老凋亡使得其抗氧化能力下降，清除晶狀體內自由基的能力下降，進而使得晶狀體產生氧化損傷，導致晶狀體渾濁[10]。晶狀體上皮細胞凋亡在除先天性白內障之外的眾多類型白內障發(fā)生過程中占有重要地位[3]，但具體機制尚不完全明確。

近期研究[11]表明，miRNAs在眼部生長、發(fā)育、功能調節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。Kubo等[12]研究發(fā)現(xiàn)，白內障大鼠晶狀體中有100種miRNA表達水平異于正?！，F(xiàn)已證實多種miRNA在ARC的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。miRNA在晶狀體細胞增殖、分化、凋亡等過程中的調控作用對白內障發(fā)生發(fā)展的影響受到研究者的關注。Cvekl等[13]發(fā)現(xiàn)miR-204在促進黃斑區(qū)發(fā)育和維持晶狀體透明中發(fā)揮重要作用。Wu等[14]報道高表達的miR-184與維持人類晶狀體的透明性密切相關。Nishino等[15]發(fā)現(xiàn)高表達的let-7b可導致晶狀體上皮細胞凋亡，從而可能引發(fā)白內障。黎清蘭等[16]發(fā)現(xiàn)過表達miR-34a能夠促進HLEC衰老，可能與ARC的形成有關。miR-125b有調控多種腫瘤細胞凋亡的作用[7，8]，但其與晶狀體上皮細胞凋亡的關系尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，ARC患者晶狀體前囊膜標本中miR-125b表達水平低于正常，提示miR-125b在ARC的發(fā)生發(fā)展中可能起到一定作用。我們通過紫外線照射制備晶狀體上皮細胞凋亡模型，發(fā)現(xiàn)miR-125b在晶狀體上皮細胞凋亡模型中的表達水平較正常晶狀體上皮細胞明顯降低，提示miR-125b表達異?？赡芘c晶狀體上皮細胞凋亡有關。

為進一步研究miR-125b在晶狀體上皮細胞凋亡中的作用，我們將miR-125b mimics轉染HLEC凋亡模型，提高細胞中miR-125b的表達水平，流式細胞術檢測顯示轉染后細胞的凋亡率明顯下降，且細胞內凋亡相關酶活性下降，進一步證實miR-125b與HLEC的凋亡有關，miR-125b表達異常在白內障的發(fā)病過程中可能起重要作用。miR-125b有望成為ARC治療的新靶點。miR-125b調控晶狀體上皮細胞凋亡的具體分子生物學機制尚不明確。Le等[7]在人神經母細胞瘤和肺成纖維細胞實驗中發(fā)現(xiàn)miR-125b能夠通過下調p53表達從而抑制細胞凋亡。Shi等[8]對雄激素受體陽性的前列腺癌細胞進行研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b可通過下調促凋亡基因BAK1表達從而抑制腫瘤細胞凋亡。miR-125b在不同的組織細胞中有著不同的上游和下游調控網(wǎng)絡，miR-125b對晶狀體上皮細胞的促凋亡作用具體機制有待我們在以后實驗中進一步探索。

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