高糖高脂、PAF對(duì)腎小球系膜細(xì)胞PKCβI mRNA表達(dá)的影響及阿托伐他汀干預(yù)作用觀察

肖艷華，何笑云，韓晴，胡小文，周素嫻

(1桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林541000；2桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

高糖高脂、PAF對(duì)腎小球系膜細(xì)胞PKCβI mRNA表達(dá)的影響及阿托伐他汀干預(yù)作用觀察

肖艷華1，何笑云1，韓晴1，胡小文1，周素嫻2

(1桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林541000；2桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

目的觀察阿托伐他汀對(duì)高糖高脂、血小板活化因子(PAF)誘導(dǎo)下蛋白激酶C-βI(PKCβI)mRNA表達(dá)的影響。方法取培養(yǎng)好的、分化成熟的人腎小球系膜細(xì)胞(HMCs)細(xì)胞分為A 正常對(duì)照組、B 高糖高脂+PAF組、C高糖高脂+PAF+PKCβI抑制劑LY333531組、D高糖高脂+PAF+阿托伐他汀組共4個(gè)組。A組加入5.5mmol/L的D-葡萄糖； B組加入30 mmol/L的D-葡糖糖、20 mg/L的溶血磷脂酰膽堿(LPC)和2×10-8mol/L的PAF C-16；C組經(jīng)2×10-7mol/L的LY333531預(yù)處理1 h后，加入30 mmol/L的D-葡萄糖、20 mg/L的LPC、2×10-8mol/L的PAF C-16；D組經(jīng)10 μmol/L的阿托伐他汀處理1 h后，加入30 mmol/L的D-葡萄糖、20 mg/L的LPC、2×10-8mol/L的PAF C-16。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，提取細(xì)胞RNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測細(xì)胞中的PKCβI mRNA。結(jié)果A、B、C、D組細(xì)胞中PKCβI mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、3.59±0.41、2.76±0.57、1.02±0.00。B組細(xì)胞中PKCβI mRNA相對(duì)表達(dá)量高于其余三組，D組PKCβI mRNA相對(duì)表達(dá)量低于B組和C組(P均<0.05)。結(jié)論高糖、高脂、PAF誘導(dǎo)下腎小球系膜細(xì)胞中PKCβI mRNA表達(dá)上調(diào)，阿托伐他汀作用后可抑制PKCβI mRNA表達(dá)。

腎小球系膜細(xì)胞；血小板活化因子；蛋白激酶C-βI；阿托伐他汀

有20%～40%的糖尿病患者并發(fā)糖尿病腎病(DN)[1]。系膜細(xì)胞是腎小球?yàn)V過屏障主要的組成部分，其形態(tài)或功能異常與腎功能損害密切相關(guān)[2]。蛋白激酶C(PKC)是一種能影響細(xì)胞多條信號(hào)通路的蛋白激酶[3]，與細(xì)胞生長、分化、凋亡、細(xì)胞因子活化及細(xì)胞外基質(zhì)合成密切相關(guān)[3]。前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)系膜細(xì)胞在高糖、高脂刺激下可大量分泌血小板活化因子(PAF)[4]，PAF通過激活PKCβI促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)分泌[5]，誘導(dǎo)腎小球硬化的發(fā)生。研究還發(fā)現(xiàn)HMG-CoA還原酶抑制劑阿托伐他汀不僅可下調(diào)高糖、高脂環(huán)境下系膜細(xì)胞中PAF的表達(dá)，還能有效抑制ECM的分泌，延緩腎小球硬化發(fā)展[5]。阿托伐他汀對(duì)腎臟的保護(hù)作用是否與其抑制PAF分泌、降低PKCβI表達(dá)、減少ECM分泌有關(guān)，目前尚未見報(bào)道。為此，本研究觀察了高糖、高脂、PAF誘導(dǎo)下腎小球系膜細(xì)胞中PKCβI mRNA的表達(dá)變化，及阿托伐他汀作用后PKCβI mRNA的表達(dá)變化，進(jìn)一步研究阿托伐他汀對(duì)腎臟的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 人腎小球系膜細(xì)胞(HMCs)由東南大學(xué)孫子林教授贈(zèng)予，復(fù)蘇后配制成細(xì)胞懸液，分種4個(gè)培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。D-葡萄糖購自Biomol公司，溶血卵磷脂購自Sigma公司，人Ⅳ型膠原ELISA試劑盒購自bluegene公司，人纖維連接蛋白ELISA試劑盒購自深圳晶美生物公司，PKCβI引物及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，GAPDH引物購自上海生工生物工程公司，小牛血清購自GIBCO公司。

1.2 高糖高脂聯(lián)合PAF誘導(dǎo)及阿托伐他汀給藥方法 預(yù)實(shí)驗(yàn)已篩選最適高糖、高脂濃度、最適PAF濃度、PKCβI抑制劑LY333531最適濃度和阿托伐他汀最適濃度及最適處理時(shí)間。取培養(yǎng)好的、分化成熟的HMCs細(xì)胞分為A、B、C、D共4個(gè)組。A組加入5.5mmol/L的D-葡萄糖；B組加入30 mmol/L的D-葡糖糖、20 mg/L的溶血磷脂酰膽堿(LPC)和2×10-8mol/L的PAF C-16；C組經(jīng)2×10-7mol/L的LY333531預(yù)處理1 h后，加入30 mmol/L的D-葡萄糖、20 mg/L的LPC、2×10-7mol/L的PAF C-16；D組經(jīng)10 μmol/L的阿托伐他汀處理1 h后，加入30 mmol/L的D-葡萄糖、20 mg/L的LPC、2×10-7mol/L的PAF C-16。各組細(xì)胞再置于37℃、5%CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 系膜細(xì)胞中PKCβI mRNA檢測 將6孔板中的細(xì)胞收集于EP管中，溶解細(xì)胞后提取細(xì)胞總RNA，并依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PKCβI mRNA上游引物序列為5′-GGGGGCGACCTCATGTAT-3′，下游引物序列為5′-GCAATTTCTGCAGCGTAAAA-3′。內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′，下游引物序列為5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃、10 s，退火56 ℃、20 s，延伸72 ℃、15 s，重復(fù)40次。以2-ΔΔCt表示PKCβI mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

A、B、C、D組細(xì)胞中PKCβI mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、3.59±0.41、2.76±0.57、1.02±0.00。B組細(xì)胞中PKCβI mRNA相對(duì)表達(dá)量高于其余三組，D組PKCβI mRNA相對(duì)表達(dá)量低于B組和C組(P均<0.05)。

3 討論

DN為糖尿病患者慢性并發(fā)癥之一，且為不可逆性病變，隨著病情加重，將對(duì)患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。因此，研究延緩DN發(fā)病的藥物對(duì)糖尿病患者至關(guān)重要。糖尿病被認(rèn)為是一種慢性炎癥[6，7]，高糖高脂環(huán)境中ECM分泌量大大增加，而PAF作為重要的促炎癥因子可進(jìn)一步促進(jìn)ECM分泌。PKCβI是細(xì)胞質(zhì)中調(diào)控信號(hào)通路的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與細(xì)胞的分化、凋亡、促進(jìn)ECM合成等密切相關(guān)[8]。PKCβI作為促進(jìn)腎小球ECM形成通路中重要的一員[7]，其表達(dá)量的多少與DN進(jìn)展密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，高糖高脂聯(lián)合PAF處理可進(jìn)一步促進(jìn)PKCβI表達(dá)。既往體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高糖可誘導(dǎo)PKCβI表達(dá)[9]，激活PKCβI/TGF-β1途徑，進(jìn)而促進(jìn)腎小系膜細(xì)胞分泌纖黏連蛋白和Ⅳ型膠原蛋白等ECM[10]，同時(shí)活化的PKCβI通過阻斷胰島素PI3K通路中胰島素受體底物的自身磷酸化，導(dǎo)致胰島素抵抗及腎小球足細(xì)胞損傷[11]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的腎小球硬化SD大鼠糖尿病模型中PKCβI mRNA及蛋白表達(dá)也相應(yīng)增加，予PKC-β抑制劑LY333531治療后PKCβI表達(dá)顯著下降，同時(shí)觀察到該組大鼠24 h尿微量白蛋白水平明顯下降[12]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明PKCβI表達(dá)增加與腎功能損害密切相關(guān)。

他汀類藥廣泛應(yīng)用于臨床，具有降低血脂、抗炎[13]、抗氧化[14]、內(nèi)皮修復(fù)等多效性。目前關(guān)于阿托伐他汀對(duì)DN腎臟的保護(hù)機(jī)制尚未明確。Han等[15]研究顯示使用阿托伐他汀可顯著延緩DN患者GRF的下降速度。既往研究表明阿托伐他汀通過降低高糖、高脂環(huán)境下系膜細(xì)胞中PAF表達(dá)及ECM分泌，從而延緩腎小球硬化[16，17]。李文桐等[18]通過誘導(dǎo)大鼠2型糖尿病的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可降低大鼠心肌細(xì)胞及主動(dòng)脈中PKCβI的表達(dá)，認(rèn)為阿托伐他汀具有保護(hù)血管內(nèi)皮的作用。另有研究[19]表明阿托伐他汀可通過抑制PKC的表達(dá)以減輕內(nèi)皮細(xì)胞在高糖誘導(dǎo)下的氧化應(yīng)激反應(yīng)。上述研究均闡明阿托伐他汀保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用與抑制PKCβ表達(dá)有關(guān)。我們前期實(shí)驗(yàn)已得知PAF、高糖、高脂通過激活PKCβI促進(jìn)ECM分泌，導(dǎo)致腎小球硬化的發(fā)生；而LY333531則通過抑制PAF表達(dá)及高糖高脂誘導(dǎo)下PKCβI的表達(dá)，對(duì)DN具有保護(hù)作用[20]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)阿托伐他汀預(yù)處理(D組)后的系膜細(xì)胞中PKCβI mRNA表達(dá)量較除A組外的其他各組均顯著降低，提示阿托伐他汀對(duì)系膜細(xì)胞的保護(hù)作用可能與抑制PKCβI表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，高糖高脂聯(lián)合PAF誘導(dǎo)下腎小球系膜細(xì)胞中PKCβI mRNA表達(dá)上調(diào)，阿托伐他汀作用后可抑制PKCβI mRNA表達(dá)，從而發(fā)揮對(duì)腎小球系膜細(xì)胞的保護(hù)作用。然而目前臨床糖尿病患者多應(yīng)用他汀類藥物降脂，阿托伐他汀對(duì)延緩DN發(fā)生是否具有積極意義仍需進(jìn)一步探索和研究。

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EffectsofhighglucoseandlysophosphatidylcholineandPAFonPKCβImRNAexpressionofglomerularmesangialcellsandtheinterventioneffectofatorvastatin

XIAOYanhua1,HEXiaoyun,HANQing,HUXiaowen,ZHOUSuxian

(1GuilinMedicalUniversity,Guilin541000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of atorvastatin on the PKCβI mRNA expression of high glucose and lysophosphatidylcholine (LPC) and platelet activating factor (PAF)-induced mesangial cells.MethodsHuman glomerular mesangial cells (HMCs) were divided into four groups: the normal control group (group A), high glucose and LPC+PAF group (group B), high glucose and LPC+PAF+LY333531 group (group C), and high glucose and high LPC + PAF+ atorvastatin group (group D). We added 5.5 mmol/L D-glucose to group A; group B was treated with 30 mmol/L D-glucose, 20 mg/L LPC, and 2×10-8mol/L PAF C-16; group C was pretreated with 2×10-7mol/L LY333531 for 1 h, and then was added with 30 mmol/L D-glucose, 20 mg/L LPC, and 2×10-8mol/L PAF C-16; group D was pretreated with 10 μmol/L atorvastatin for 1 h, and then was added with 30 mmol/L D-glucose, 20 mg/L LPC, 2×10-8mol/L PAF C-16. At 24 h after culture, RNA was extracted. The expression of PKCβI mRNA in the mesangial cells was detected by real-time fluorescence quantitative PCR.ResultsThe relative expression of PKCβI-mRNA in the groups A, B, C, and D was 1.00±0.00, 3.59±0.41, 2.76±0.57, and 1.02±0.00, respectively. The expression of PKCβI-mRNA in the group B group was higher than that of the other three groups, and the expression of PKCβI-mRNA in the group D was significantly lower than that of the groups B and C (allP<0.05).ConclusionsThe expression of PKCβI mRNA in high glucose and LPC and PAF-induced glomerular mesangial cells is up-regulated, and atorvastatin can inhibit the PKCβI expression.

glomerular mesangial cells; platelet-activating factor; protein kinase C-βI; atorvastatin

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.39.007

R692.6

A

1002-266X(2017)39-0027-03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81560148，81260134)。

肖艷華(1991-)女，碩士，主要研究方向?yàn)樘悄虿∧I病。E-mail: 770400919@qq.com

周素嫻(1976-)，女，碩士，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)樘悄虿∧I病。E-mail: zoe_doctor@163.com

2017-06-03)