禽流感與雞新城疫的血凝和血凝抑制試驗操作要點及注意事項

董長遠 欒偉麗 （山東省淄博市張店區(qū)動物疫病預防控制中心 255000）

禽流感與雞新城疫的血凝和血凝抑制試驗操作要點及注意事項

董長遠 欒偉麗 （山東省淄博市張店區(qū)動物疫病預防控制中心 255000）

血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗是科學評估和分析禽流感與雞新城疫疫病流行狀況及免疫效果的一個重要手段和方法。雖然方法簡單，但如果操作不規(guī)范極易導致試驗結(jié)果偏差，本文著重對禽流感與雞新城疫的HA和HI試驗的操作要點及注意事項進行闡述和分析，對正確掌握試驗方法，提高試驗準確性，避免或減少試驗誤差具有重要的指導意義。

血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗是禽流感與雞新城疫疫病監(jiān)測和免疫抗體檢測中最常用的一種血清學監(jiān)測方法，因所需儀器設備少，操作簡單，一般獸醫(yī)實驗室都具備開展該項工作的條件。雖然HA、HI試驗要求條件不高，但如果實驗室人員操作不規(guī)范、使用標準不準確，試驗耗材和試驗環(huán)境條件達不到要求，檢測結(jié)果也會出現(xiàn)偏離現(xiàn)象。

1 操作要點

1.1 1%紅細胞制備 HA與HI試驗前需要先制備1%紅細胞懸液。由于不同個體雞只紅細胞對病毒的敏感性不同從而影響HI效價，所以一般需要采取3只以上無禽流感和新城疫等抗體的健康成年公雞血液，在洗滌紅細胞的過程中，每次離心后，須用吸管吸去上清液和白細胞層。若是采用免疫過的公雞需要充分洗去血清,可洗滌5～6次。紅細胞的洗滌程度應保證上清液呈清澈透明狀為準。紅細胞經(jīng)過反復離心洗滌后用PBS液配成體積分數(shù)為1%紅細胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 HA效價判定 病毒抗原效價在血凝抑制試驗中至關重要，所以每次試驗前必須對抗原效價進行測定?？乖r測定不準確對試驗結(jié)果有一定影響。在PBS對照孔出現(xiàn)正確結(jié)果的情況下(紅細胞完全沉淀)，將反應板傾斜(不大于60°)觀察紅細胞是否完全凝集，以能使紅細胞完全凝集(不流淌)的抗原最高稀釋倍數(shù)，作為抗原的凝集效價，即按這個比例稀釋的抗原就是1單位的血凝抗原(HAU)。為了測出準確的抗原效價，建議試驗中同時進行3～4排測定，取抗原效價值中一致性大的作為本次試驗的HA效價。舉例說明，如果3排病毒抗原的HA效價分別為1：512、1：512和1：256，則此次HA試驗的HA效價可判為1：512。HA試驗判定時間以紅細胞對照孔完全沉淀為標準，一般在室溫條件下30～40min出結(jié)果。

1.3 4單位抗原(4HAU)配制與回歸試驗 血凝滴度除以4即為含4HAU抗原的稀釋倍數(shù)。4HAU抗原要現(xiàn)用現(xiàn)配，配好的4HAU抗原應在2h內(nèi)用完。為了保證4單位抗原的準確，建議4單位抗原配好后進行回歸試驗。具體做法是如下：在微量反應板的1～4排的1～4孔內(nèi)各加入0.025ml PBS液。取已配好的4HAu抗原混勻液0.025ml加入反應板的第1孔內(nèi)，混勻后吸取0.025ml加入第2孔，依次倍比稀釋至第4孔，從第4孔內(nèi)吸取0.025ml棄掉。每孔內(nèi)加入0.025ml l%紅細胞懸混液，振蕩混勻，20～25℃靜置20min后觀察結(jié)果。若l孔、2孔紅細胞完全凝集，而3孔、4孔不凝集，則說明4個HAU配制準確。如果前3孔完全凝集，說明所配4HAU抗原實際是8個血凝單位，需等量稀釋病毒抗原，如果只有前1孔完全凝集，說明所配4HAU抗原實際是2個血凝單位，病毒抗原量需加倍。如果所配抗原濃度過低，則所測定的血清抗體效價偏高；如果抗原濃度過高，則所測定的血清抗體效價偏低。

1.4 HI結(jié)果判定 每次HI試驗必須設定陽性血清對照和陰性血清對照，以保證試驗條件成立。同時，抗原對照孔必須完全凝集，稀釋液對照孔必須完全沉淀。否則試驗不成立。在對照完全正確情況下，將反應板傾斜(不大于60°)，從背面觀察紅細胞是否呈現(xiàn)淚滴狀流淌，可參考稀釋液對照孔進行比對，與稀釋液對照孔淚滴長度相同的孔判為HI效價。淚滴長度會隨時間變化，所以判斷時應迅速。HI判定時間，以抗原對照孔出現(xiàn)完全凝集，稀釋液對照孔出現(xiàn)完全沉淀為標準。一般在室溫條件下30～40min出結(jié)果。

2 注意的問題

2.1 禽流感與雞新城疫執(zhí)行標準不同 在HA、HI試驗中，雖然禽流感與雞新城疫的血凝和血凝抑制試驗原理相同、操作方法相同，但執(zhí)行標準不相同。禽流感執(zhí)行《高致病性禽流感診斷技術》(GB/T18936-2003)，雞新城疫執(zhí)行《新城疫診斷技術》(GB/T16550-2008)。這兩個診斷技術中，1%雞紅細胞懸液制備和PBS液配制方法均不同，試驗中不能混用。

2.2 反應板的選擇 應使用90°有機血凝板，勿使用110°有機血凝板。使用有機血凝板，在試驗結(jié)束后要按程序清洗干凈。目前，實驗室多使用一次性優(yōu)質(zhì)V型塑料反應板，使用后不用清洗。試驗中，要避免因反應板質(zhì)量問題而造成試驗結(jié)果偏離。

2.3 稀釋液的選擇 生理鹽水和磷酸鹽緩沖液是實驗室最為常用的兩種稀釋溶液。在HA和HI試驗中，為減少稀釋液對試驗結(jié)果的影響，選擇對酸堿具有一定緩沖能力的PBS液要比生理鹽水的試驗效果好。建議檢測時使用符合標準要求的pH7.2、0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS液)，不要因怕配制PBS液麻煩而使用生理鹽水代替。

2.4 血清的處理 （1）冷凍血清處理：凍結(jié)血清融化后，會出現(xiàn)蛋白質(zhì)局部濃縮、分布不均的現(xiàn)象。在檢測前應充分混勻，混勻時切記劇烈振蕩，可采用上下顛倒幾次的方式混勻。（2）水禽血清處理：除雞外，有些禽的血清可能對雞紅細胞產(chǎn)生非特異性的凝集。用雞紅細胞檢測水禽血清時，需要除去存在于血清中的非特異凝集素。方法是在每0.5ml的血清中加入0.025ml的雞紅細胞輕搖后靜置至少30min，800r/min離心2～5min，收集上清液即為處理后的血清。亦可用被檢禽種的紅細胞。

2.5 抗原和1%紅細胞懸液的保存 抗原開封溶解后，置-15～-18℃冷凍保存，反復凍融應不超過20次，若2～8℃保存應不超過3個月。若當天試驗任務未完成，可將病毒抗原冷凍或冷藏保存。第2天繼續(xù)開展試驗時，需要重新測定禽流感病毒抗原HA效價。1%紅細胞懸液在4℃條件下可保存5d左右。試驗開始前，將配好的紅細胞懸液混勻，根據(jù)當日或本次檢測任務量，將本次檢測所需紅細胞懸液倒入燒杯或錐形瓶留用，剩余紅細胞懸液繼續(xù)4℃條件保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 移液器使用和加樣操作中注意事項 （1）取樣時，移液器只需按到第1檔停點，排樣時需按到第2檔停點，才能徹底排出，以達到準確的取樣量。（2）吸取液體時要緩慢平穩(wěn)地松開拇指，切記不能過快。同時，將吸頭沿器壁滑出容器，以除去吸頭外多余的液體。（3）加樣時注意吸頭勿碰觸到V板孔，以免發(fā)生交叉污染。（4）倍比稀釋時，拇指要慢按、慢松移液器按鈕，以避免產(chǎn)生過多的泡沫，引起移液量不準，混合不均，從而影響檢測結(jié)果的準確性。（5）紅細胞懸液和病毒懸液在使用前要搖勻，紅細胞懸液更應隨用隨搖，保證每一孔中加入的紅細胞懸液和病毒懸液濃度一致。否則，加入時濃度高低不一，會造成人為誤差。（6）實際檢測工作中，有時需要在一定時間內(nèi)對一批血清進行禽流感幾種毒株或亞型的檢測，如同時測定H5亞型Re-6、Re-8株、H7亞型抗體水平，為避免幾種抗原液混淆，必須在盛放抗原液的加樣槽上作標記。由于一次試驗需用多塊反應板，反應板也應編號區(qū)別。

2.7 環(huán)境溫度和孵育時間的控制 《高致病性禽流感診斷技術》和《新城疫診斷技術》中要求HA和HI試驗的環(huán)境溫度控制在20～25℃。在環(huán)境溫度20～25℃時，經(jīng)過30～40min即可讀出抗原滴度和血清抗體效價。HI試驗的反應時間與試驗環(huán)境溫度成正比，即環(huán)境溫度升高所需反應時間縮短。當溫度過低如低于15℃時，出現(xiàn)結(jié)果就會變慢，往往需要超過40min才能判定結(jié)果。HI判定時間，以抗原對照孔出現(xiàn)完全凝集，稀釋液對照孔完全沉淀為標準。一般在室溫條件下30～40min出結(jié)果。一塊反應板從開始加樣到判定結(jié)果大致需要70min，當環(huán)境溫度不在20～25℃范圍內(nèi)，用空調(diào)進行室溫調(diào)節(jié)時，為防止反應板內(nèi)液體蒸發(fā)，應避免在空調(diào)排風口下操作，也可在加完樣后用A4復印紙蓋住反應板。

3 小結(jié)

禽流感與雞新城疫HA和HI試驗影響因素甚多，結(jié)果準確與否，與試驗中各個影響要素的綜合作用密切相關。試驗中應嚴格控制試驗條件，準確控制紅細胞懸液和抗原工作濃度，同時嚴格控制試驗溫度和作用時間，盡可能把各種影響降至最低。特別是要規(guī)范操作，努力減少人為因素的影響。另外，要確保HA與HI試驗結(jié)果的準確性，還需要在試驗實踐的基礎反復練習才能達到預期的目的。

S852.4+5

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1007-1733(2017)12-0053-02

2017-08-04）