清毒湯對(duì)重癥肝損傷大鼠腸道黏膜通透性的影響

羅佳佳 高連印 金雙 車念聰 張秋云 杜宇瓊 付修文

清毒湯對(duì)重癥肝損傷大鼠腸道黏膜通透性的影響

羅佳佳 高連印 金雙 車念聰 張秋云 杜宇瓊 付修文

目的 觀察清毒湯對(duì)重癥肝損傷大鼠腸道黏膜通透性的影響，探討該方治療慢性重型肝炎(chronic severe hepatitis,CSH)的作用機(jī)制。方法 建立硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)致重癥肝損傷大鼠模型，以清毒湯進(jìn)行干預(yù)治療，采用血液生化法、ELISA法、Western Blot法，觀察其對(duì)該模型大鼠肝功能的總膽紅素(total bilirubin,TBIL)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)和反映腸道黏膜通透性的二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)、閉鎖連接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)及腸組織白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6的影響。結(jié)果 (1)與模型組相比較，乳果糖組及清毒湯小、中劑量組大鼠中TBIL、AST、DAO含量顯著性下降(P<0.01)；ZO-1蛋白的表達(dá)水平在所有治療組中均有顯著性升高(P<0.01)；乳果糖組、清毒湯中劑量組IL-1β、IL-6的含量均顯著性降低(P<0.01)；(2)與乳果糖比較，清毒湯中劑量組TBIL、AST、DAO、IL-1β含量明顯下降(P<0.05)及ZO-1表達(dá)水平顯著性升高(P<0.01)；清毒湯小劑量組中IL-6呈明顯下降(P<0.05)；清毒湯大劑量組中AST、DAO有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。結(jié)論 清毒湯能降低重癥肝損傷大鼠腸道黏膜的通透性，從而改善肝功能，其作用機(jī)制可能是減少有害物質(zhì)穿過(guò)腸道黏膜屏障，進(jìn)而減少其通過(guò)肝腸循環(huán)途徑而加重肝損傷的發(fā)生機(jī)率。

腸道黏膜通透性； 重癥肝損傷； 清毒湯； 硫代乙酰胺

重癥肝損傷以大量肝細(xì)胞壞死為特征，屬于臨床急危重癥范疇。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究表明[1-2]，重癥肝損傷患者常伴有腸道黏膜通透性異常升高，導(dǎo)致腸內(nèi)有害物質(zhì)可以通過(guò)“腸肝軸”[3]進(jìn)一步加重肝損傷。清毒湯是王融冰教授采用“通腸治肝”方法治療重癥肝炎的經(jīng)驗(yàn)方，且臨床研究顯示[4]，該方治療慢性重型肝炎(chronic severe hepatitis,CSH)安全、有效。本研究通過(guò)觀察清毒湯對(duì)重癥肝損傷大鼠血清總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)和反映腸道黏膜通透性的二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)、閉鎖連接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)及腸組織白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6的表達(dá)水平變化，了解該方對(duì)此類模型大鼠腸道黏膜通透性的影響，進(jìn)而探討該方治療慢性重型肝炎的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量(190±10)g，清潔級(jí)，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司提供，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，明暗交替時(shí)間為12小時(shí),各組大鼠均自由飲水進(jìn)食。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

清毒湯藥物組成：大黃10 g、厚樸10 g、枳實(shí)10 g、茜草9 g、生地黃12 g，上述藥物均購(gòu)自北京同仁堂，由首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物室煎制，制備成生藥含量1.5 g/mL的水煎劑，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。硫代乙酰胺與乳果糖均購(gòu)自北京科奧科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)分別為S0646、ka0009454；IL-1β、IL-6ELISA試劑盒購(gòu)自MultiSciences，生產(chǎn)批號(hào)分別為20160315214、20163254158；ZO-1抗體購(gòu)自Santa cruz，生產(chǎn)批號(hào)：SC-8146；DAO購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

日立7600生化儀；Multiskan MK3酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific，USA)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH4000A，天津泰斯特)；高速冷凍離心機(jī)(XIANGYI)；Image Pro 6.0(Media Cybernetics公司)。

1.3 造模及給藥

所有大鼠在動(dòng)物房進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為正常組與造模組。本實(shí)驗(yàn)采用硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)誘導(dǎo)大鼠肝重度損傷模型[5]。前8周造模組予以TAA 12 mg/(kg·d)進(jìn)行灌胃，并在第8周末將所有造模組隨機(jī)分為模型組、乳果糖治療組、清毒湯治療組(小劑量、中劑量、大劑量組)。從第9～12周，除正常組外，所有組大鼠予以TAA的量增加至36 mg/(kg·d)，乳果糖組則給予3.5 mL/(kg·d)的乳果糖；清毒湯小、中、大劑量組給予清毒湯生藥制劑量分別為2.98 g/(kg·d)、5.95 g/(kg·d)、11.9 g/(kg·d)。造模及治療期間，正常組給予等容積的生理鹽水灌胃作為對(duì)照。所有動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)條件下自然飲食，在造模第12周末夜間禁食。

1.4 標(biāo)本制備

上述各組大鼠在第12周末禁食12小時(shí)后，采用10%的水合氯醛以3.5 mL/100g的給藥量進(jìn)行腹腔注射麻醉。于腹主動(dòng)脈無(wú)菌取血，3000 rpm，4℃，離心10分鐘，取其上清液分裝，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。肝、腸組織分裝于凍存管內(nèi)，用液氮進(jìn)行速凍，隨后將組織移至-80℃冰箱存放。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

血清中TBIL、AST、DAO含量采用日立7600生化儀進(jìn)行測(cè)定。結(jié)腸組織中ZO-1采用Westen Blot法；IL-1β、IL-6采用ELISA法檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 血清TBIL、AST、DAO的變化情況

與正常組相比較，模型組血清中TBIL、AST和DAO的含量均呈顯著性增高(P<0.01)；與模型組相比較，乳果糖組與清毒湯小、中劑量組大鼠中TBIL、AST、DAO含量顯著性下降(P<0.01)；與乳果糖比較，清毒湯中劑量組TBIL、AST、DAO含量明顯下降(P<0.05)，但小劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、表2。

DAO屬于血清檢測(cè)指標(biāo)之一，由于同一批動(dòng)物的血清要用于測(cè)多個(gè)不同的指標(biāo)，所以在檢測(cè)時(shí)可以根據(jù)具體需要自行分配，并且血清指標(biāo)只需要每組大于或等于6只即有統(tǒng)計(jì)可行性，所以此組實(shí)驗(yàn)為8只。

表1 各組大鼠血清TBIL、AST的變化情況比較

注： 與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01；與乳果糖組相比，dP<0.05，eP<0.01。

表2 各組大鼠血清DAO的變化情況比較±s)

注： 與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.01；與乳果糖組相比，cP<0.05，dP<0.01.

2.2 結(jié)腸組織ZO-1蛋白的表達(dá)水平

與正常組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織中ZO-1蛋白的表達(dá)量呈顯著性降低(P<0.01)；與模型組比較，ZO-1蛋白的表達(dá)水平在所有治療組中均有顯著性升高(P<0.01)；與乳果糖組比較，清毒湯中劑量組的ZO-1含量顯著性升高(P<0.01)。見圖1、表3。

Western Blot法在外文文獻(xiàn)中只需要滿足每組大于或等于3只即可，而在中文文獻(xiàn)中要求滿足每組大于或等于5只即可，所以此組為5只。

注：A:正常組；B：模型組；C：乳果糖組；D：清毒湯小劑量組； E：清毒湯中劑量組；F：清毒湯大劑量組

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織ZO-1蛋白的表達(dá)

注： 與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.01；與乳果糖組相比，cP<0.01。

2.3 結(jié)腸組織白細(xì)胞介素IL-1β、IL-6的表達(dá)水平

與正常相比較，模型組結(jié)腸組織白細(xì)胞介素IL-1β、IL-6的表達(dá)水平均呈顯著性增高(P<0.01)；與模型組相比較，乳果糖組、清毒湯中劑量組IL-1β、IL-6的含量均呈顯著性降低(P<0.01)；與乳果糖組比較，清毒湯中劑量組的IL-1β及小劑量組的IL-6呈明顯下降(P<0.05)，但大劑量組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

若為血清指標(biāo)，那么需要每組大于或等于6只才有統(tǒng)計(jì)可行性。組織指標(biāo)每組只數(shù)的選定要求則沒(méi)有血指標(biāo)高，所以該結(jié)腸組織白細(xì)胞介素IL-1β、IL-6每組的只數(shù)為6只。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織IL-1β、IL-6的表達(dá)水平

注： 與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01；與乳果糖組相比，dP<0.05。

3 討論

肝臟是人體的主要解毒器官，正常情況下，肝臟發(fā)揮免疫監(jiān)視與調(diào)控的作用，可清除來(lái)自腸道的包括內(nèi)毒素、氨、酚類在內(nèi)的各種成分，并使之成為無(wú)毒或溶解度較大的物質(zhì)，隨膽汁或尿液排出體外。當(dāng)肝臟功能由于病毒性、酒精性、藥物性等致病因素而受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，肝臟解毒、滅活能力下降，導(dǎo)致排泄到腸道的毒物增加，致使腸腔黏膜下毛細(xì)血管及靜脈擴(kuò)張瘀血，進(jìn)而出現(xiàn)腸黏膜充血、水腫、糜爛，腸道微生態(tài)系統(tǒng)失衡，腸道黏膜屏障功能遭到破壞，造成腸道通透性增加，進(jìn)而引發(fā)腸腔內(nèi)的革蘭氏陰性細(xì)菌大量增殖、移位及大量?jī)?nèi)毒素釋放入血，當(dāng)血中的內(nèi)毒素含量超過(guò)機(jī)體清除能力則形成腸源性內(nèi)毒素血癥。來(lái)自腸道的內(nèi)毒素又會(huì)對(duì)肝臟造成“第二次打擊”，加重肝損傷[6-7]，如此形成惡性循環(huán)，增加了重癥肝損傷類疾病的治療難度。因此，減少腸道黏膜損傷，降低其通透性對(duì)預(yù)防內(nèi)毒素血癥的產(chǎn)生，從而減輕肝臟損傷的方面具有極其重要的作用。尚有學(xué)者認(rèn)為腸道黏膜屏障是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定的第一道防線[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清TBIL、AST、DAO及其結(jié)腸組織IL-1β、IL-6的含量顯著性升高(P<0.01)，其結(jié)腸ZO-1蛋白的表達(dá)水平呈顯著性降低(P<0.01)；與模型組相比較，所有治療組(乳果糖組及清毒湯小、中、大劑量組)在血清TBIL、AST、DAO及結(jié)腸ZO-1蛋白的表達(dá)水平方面均有不同程度的改善；與乳果糖組相比較，在本次檢驗(yàn)的所有指標(biāo)中，清毒湯中劑量組改善效果尤為明顯。故據(jù)此推測(cè)具有滋陰通腑、涼血化瘀功效的清毒湯可能是從通過(guò)針對(duì)重癥肝損傷病機(jī)[10]的方面入手，改善腸道環(huán)境、保護(hù)腸道黏膜屏障，降低腸道黏膜通透性，從而減少內(nèi)毒素的產(chǎn)生、吸收和促進(jìn)內(nèi)毒素的清除，進(jìn)而減少其通過(guò)肝腸循環(huán)途徑加重肝損傷的發(fā)生機(jī)率而達(dá)到改善肝功能的作用。

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(本文編輯： 禹佳)

Effect ofQingdudecoction on intestinal mucosal permeability in rats with severe liver injury

LUOJiajia，GAOLianyin，JINShuang，etal.

DepartmentofTraditionalChineseMedicineclinicalbasis,CollegeofTCM,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069，China

Correspondingauthor:GAOLianyin，E-mail：gly066@126.com

Objective To observe the effect ofQingdudecoction on intestinal mucosal permeability in rats with severe liver injury, and to explore the mechanism of it to treat chronic severe hepatitis (CSH). Methods Severe liver injury model was establish by thioacetamide (TAA), andQingdudecoction was used to treat them, then blood biochemical method, ELISA, Western Blot was used to observe the effect of total bilirubin(TBIL), aspartate aminotransferase (AST) which reflect liver function, and diamine oxidase (DAO), blocking binding protein-1 (ZO-1) and interleukin of intestinal tissue (IL-1,IL-6) which reflect intestinal mucosal permeability of this model rats.Results (1)Compared with the model group, the level of TBIL, AST, DAO in the lactulose group, the low and medium dose groups ofQingdudecoction were significantly decreased (P<0.01); the expression level of ZO-1 protein in all treatment groups were significantly increased(P<0.01); the level of IL-1β and IL-6 in lactulose group and theQingdudecoction medium dose group were significantly decreased (P<0.01);(2)Compared with the lactulose group, the level of TBIL, AST, DAO, IL-1β in theQingdudecoction medium dose group was decreased obviously(P<0.05), the expression level of ZO-1 was increased significantly (P<0.01); IL-6 in theQingdudecoction low dose group was decreased obviously (P<0.05);AST,DAO in theQingdudecoction high dose group had significantly statistical difference(P<0.01).ConclusionsQingdudecoction can improve the function of liver by reducing permeability of intestinal mucosa of severe liver injury rats. The mechanism may be related to reduce harmful substances passing through intestinal mucosal barrier and enterohepatic circulation which can increase the incidences of hepatic injury.

Intestinal mucosal permeability; Severe liver injury;Qingdudecoction; Thioacetamide

北京市自然科學(xué)基金(7142023)；北京市教委首都中醫(yī)藥研究專項(xiàng)(16ZY01)

100069 北京，首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)學(xué)系[羅佳佳(碩士研究生)、高連印、金雙、車念聰、張秋云、杜宇瓊、付修文],中醫(yī)絡(luò)病研究北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[羅佳佳(碩士研究生)、高連印、金雙、車念聰、張秋云、杜宇瓊、付修文]

羅佳佳(1988- )，女，2014級(jí)在讀碩士研究生。研究方向：中醫(yī)藥防治慢性肝病內(nèi)毒素血癥機(jī)制研究。E-mail：ljj9199@163.com

高連印(1966- )，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中醫(yī)藥防治慢性肝病內(nèi)毒素血癥機(jī)制研究。E-mail：gly066@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.03.002

2016-07-12)