川麥冬高效液相色譜指紋圖譜研究

郭明里，張加余，王 冰，李 寧，，董婷霞，詹華強(qiáng)，屠鵬飛

（1．香港科技大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518057； 2．北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，北京 100029；3．上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，上海 201203； 4．北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

·實(shí)驗(yàn)研究·

川麥冬高效液相色譜指紋圖譜研究

郭明里1，張加余2，王 冰3，李 寧1，4，董婷霞1，詹華強(qiáng)1，屠鵬飛4

（1．香港科技大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518057； 2．北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，北京 100029；3．上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，上海 201203； 4．北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

目的建立一種新的川麥冬高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜分析方法。方法以HPLC法對10批川麥冬藥材的指紋圖譜進(jìn)行分析，采用8個(gè)對照品對部分共有峰進(jìn)行指認(rèn)，利用相似度分析、相對保留時(shí)間及相對峰面積分析進(jìn)一步對指紋圖譜進(jìn)行分析。結(jié)果10批川麥冬藥材的相似度均大于0．900，各批次藥材共有峰的相對峰面積在較寬范圍內(nèi)波動(dòng)，RSD＝7．1% ～71．9%(n＝10）。結(jié)論該方法簡便、實(shí)用，便于工業(yè)化生產(chǎn)，可用于麥冬藥材的質(zhì)量評價(jià)。

麥冬；高效液相色譜；指紋圖譜；質(zhì)量評價(jià)

麥冬為百合科（Liliaceae）沿階草屬（Ophiopogon）植物麥冬 Ophiopogon japonicus（L．f．）Ker－Gawl．的干燥塊根，具有養(yǎng)陰生津、潤肺清心之功效，用于肺燥干咳、陰虛癆嗽、喉痹咽痛、津傷口渴、內(nèi)熱消渴、心煩失眠、腸燥便秘等癥[1]。麥冬為常用中藥，用藥歷史悠久，《神農(nóng)本草經(jīng)》始載并將其列為上品，歷代重要本草均有記載，亦為《中國藥典》所收載。麥冬的傳統(tǒng)主產(chǎn)地為浙江和四川兩省，分別稱之為浙（杭）麥冬和川麥冬。浙（杭）麥冬主產(chǎn)于杭州東南慈溪、蕭山等地，生產(chǎn)周期通常為2～3年，栽培面積及產(chǎn)量隨市場行情波動(dòng)較大。川麥冬集中栽培于四川省綿陽市三臺縣等地，其栽培期僅1年，具有生長期短、產(chǎn)量高的特點(diǎn)，曾為我國最大的麥冬產(chǎn)地[2]。目前，川麥冬是市場主流的麥冬商品藥材。

麥冬含有甾體皂苷、高異黃酮、多糖及其他多種類型的化學(xué)成分[3]。有關(guān)川麥冬的質(zhì)量評價(jià)方法，近年來學(xué)者們從多成分含量測定[4－7]、指紋圖譜[8－9]、有害物質(zhì)檢測[4，10]等諸多方面開展了研究。前期研究報(bào)道，對川麥冬的化學(xué)成分進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，并從中分離鑒定了一系列甾體皂苷及高異黃酮類化合物[11－12]。在此基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜－紫外光－蒸發(fā)光散射器檢測（HPLC－UV－ELSD）法建立了一種麥冬化學(xué)指紋圖譜的分析方法，結(jié)合相似度分析、聚類分析、主成分分析等方法可實(shí)現(xiàn)川麥冬和浙（杭）麥冬的區(qū)分鑒別[9]。該方法側(cè)重于綜合運(yùn)用多種化學(xué)計(jì)量學(xué)算法，對不同產(chǎn)地藥材進(jìn)行真實(shí)性鑒定。

中藥注射劑是在口服方劑基礎(chǔ)上發(fā)展起來的現(xiàn)代新劑型，它改變了傳統(tǒng)的給藥方式，有效成分經(jīng)提取精制后直接進(jìn)入人體，不僅保留了中醫(yī)藥傳統(tǒng)的治療特色，也具備化學(xué)藥生物利用度高、起效迅速的優(yōu)勢[13]。目前，麥冬已廣泛用于中藥注射劑的生產(chǎn)，代表性品種參麥注射液已列入國家基本藥物目錄。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年參麥注射液在全國城市公立醫(yī)院中成藥市場份額排名中位于第13位，在全國縣級公立醫(yī)院中成藥市場份額排名中居第7位，是臨床常用的中藥注射劑大品種[14－15]。隨著社會(huì)發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對麥冬相關(guān)的中藥注射液的安全性、有效性和可控性提出了更高要求。國家食品藥品監(jiān)督管理總局將參麥注射液列為中藥注射劑安全性再評價(jià)的首批評價(jià)品種[16]。中藥注射劑的質(zhì)量與藥材質(zhì)量密切相關(guān)，研究中藥成分從藥材到制劑的質(zhì)量傳遞規(guī)律，針對主要移行成分開發(fā)適用于工業(yè)生產(chǎn)的指紋圖譜分析方法，以此對藥材質(zhì)量進(jìn)行控制，對于提高制劑質(zhì)量具有重要意義。因此，在前期研究基礎(chǔ)上，本研究中對川麥冬的指紋圖譜進(jìn)行了進(jìn)一步研究，建立了新的分析方法。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

1200型高效液相色譜儀，配置四元泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器（美國Agilent公司）；BP221S型分析天平（德國Sartorius公司）；Sedere Sedex 75型蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD，法國Sedere公司）；R210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；Bransonic 2510E－MTH型超聲波清洗機(jī)（美國Branson公司）。

1．2 試藥

龍腦－2－O－β－D－呋喃芹糖基－（1→6）－β－D－吡喃葡萄糖苷（S－1），麥冬皂苷元 －3－O－α－L－吡喃鼠李糖基－（1→2）－[β－D－吡喃木糖基－（1→4）]－β－D－吡喃葡萄糖苷（S－2），麥冬皂苷元－3－O－α－L－吡喃鼠李糖基－（1→2）－β－D－吡喃葡萄糖苷（S－3）、偏諾皂苷元－3－O－α－L－吡喃鼠李糖基 －（1→2）－[β－D－吡喃木糖基－（1→4）]－β－D－吡喃葡萄糖苷（S－4），14－羥基薯蕷皂苷元－3－O－α－L－吡喃鼠李糖基－（1→2）－[β－D－吡喃木糖基－（1→4）]－β－D－吡喃葡萄糖苷（S－5），14－羥基薯蕷皂苷元－3－O－α－L－吡喃鼠李糖基－（1→2）－β－D－吡喃葡萄糖苷（S－6）、麥冬皂苷 D（S－7）和薯蕷皂苷元－3－O－α－L－吡喃鼠李糖基－（1→2）－[β－D－吡喃木糖基－（1→4）]－β－D－吡喃葡萄糖苷（S－8），共8個(gè)對照品均為自制，其結(jié)構(gòu)經(jīng)質(zhì)譜、1HNMR及13C－NMR確證，純度經(jīng)HPLC－ELSD峰面積歸一化法檢測不低于98%；乙腈（德國默克股份兩合公司）為色譜純；甲醇（德國默克股份兩合公司）為色譜純；試驗(yàn)用水為超純水；其余試劑均為分析純；C18固相萃取柱（500 mg／4 mL，Alltech公司）。10批麥冬藥材，編號分別為 OJ－1～OJ－10（產(chǎn)地均為四川省，2014年12月購于成都荷花池中藥材專業(yè)市場）。所有樣品均經(jīng)李寧博士鑒定，標(biāo)本保存于香港科技大學(xué)深圳研究院。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB－C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以乙腈－甲醇（3∶1）為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相 B，進(jìn)行梯度洗脫（0～10 min，30%A；10～25 min，30% ～48%A；25～45 min，48%A；45～50 min，48% ～55%A；50～65 min，55% ～65%A；65～85 min，65% ～100%A；85～100 min，100%A）；流速：1 mL／min；柱溫：30℃；蒸發(fā)光散射檢測器檢測漂移管溫度：40℃，氣體壓力：2．5 bar；進(jìn)樣量：20 μL。

2．2 溶液制備

對照品溶液：稱取對照品S－1、S－2、S－3、S－4、S－5、S－6、S－7、S－8適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL分別含上述對照品 0．10，0．05，0．10，0．05，0．10，0．05，0．05，0．05 mg的混合對照品溶液，即得。

供試品溶液：取麥冬藥材粉末約2．0 g，精密稱定，置100 mL三角瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，搖勻，密封，超聲提取30 min（功率100 W，頻率40 kHz），濾過，濾液50℃減壓蒸干。殘?jiān)? mL水溶解，過固相萃取柱，依次用水、40%甲醇、甲醇各5 mL洗脫，收集甲醇洗脫部分，50℃減壓濃縮，轉(zhuǎn)移至1 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0．45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2．3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取同一批（批號為OJ－5）樣品，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2．1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定6次，將所得色譜圖輸入國家藥典委員會(huì)推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012．130723版，以下簡稱相似度評價(jià)軟件）進(jìn)行相似度比較，采用中位數(shù)法生成參照指紋圖譜，以參照指紋圖譜計(jì)算各色譜圖的相似度。結(jié)果各色譜圖的相似度均大于0．980，且RSD＜0．5%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號為OJ－5）樣品，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按2．1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，將所得色譜圖輸入相似度評價(jià)軟件進(jìn)行相似度比較，采用中位數(shù)法生成參照指紋圖譜，以參照指紋圖譜計(jì)算各色譜圖的相似度。結(jié)果各色譜圖的相似度均大于0．980，且 RSD＜0．5%(n＝6)，表明該方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號為OJ－5）樣品，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備后0，3，6，9，12，24 h時(shí)按2．1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，將所得色譜圖輸入相似度評價(jià)軟件進(jìn)行相似度比較，采用中位數(shù)法生成參照指紋圖譜，以參照指紋圖譜計(jì)算各色譜圖的相似度。結(jié)果各色譜圖的相似度均大于 0．980，且 RSD＜0．5%(n＝6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2．4 分析與評價(jià)

2．4．1 川麥冬藥材樣品指紋圖譜的測定

取10批川麥冬樣品（批號為OJ－1～OJ－ 10），按 2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 2．1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，得10批川麥冬藥材指紋圖譜(圖1)。

圖1 10批川麥冬藥材的指紋圖譜

圖2 10批川麥冬藥材指紋圖譜的共有模式

圖3 對照品溶液色譜圖

2．4．2 共有模式指紋圖譜的建立與共有峰指認(rèn)

將所得的10批川麥冬藥材色譜圖導(dǎo)入相似度評價(jià)軟件，采用中位數(shù)法生成共有模式，得到的共有模式（圖2）包含共有峰40個(gè)。通過與對照品溶液色譜圖（圖3）對照保留時(shí)間，指認(rèn)了其中8個(gè)色譜峰，峰4，13，14， 15，16，18，28和29分別為化合物S－1，S－2，S－3，S－4，S－5，S－6，S－7和S－8。

2．4．3 指紋圖譜的相似度分析

因川麥冬藥材色譜圖中保留時(shí)間8 min之前的色譜峰及38號峰占總峰面積比例較大，對整體相似度影響過大。所有色譜圖剪除8 min之前的色譜峰及38號峰重新生成共有模式，以該共有模式為參照，計(jì)算各色譜圖的相似度。10批川麥冬藥材的指紋圖譜相似度按批號 OJ－1～OJ－10的順序分別為 0．950，0．971，0．954，0．974，0．981，0．968，0．943，0．946，0．934，0．951。

表1 共有模式各色譜峰的保留時(shí)間、相對保留時(shí)間及10批藥材各共有峰的相對峰面積

2．4．4 指紋圖譜相對保留時(shí)間及相對峰面積分析

以28號峰麥冬皂苷D為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。10批藥材共有峰的相對保留時(shí)間較固定，與共有模式對應(yīng)峰的相對保留時(shí)間非常接近（RSD＜0．5%）。共有模式各色譜峰的相對保留時(shí)間及10批藥材共有峰的相對峰面積見表1。

3 討論

前期研究結(jié)果顯示，已對供試品溶液的制備方法及色譜條件進(jìn)行過大量的調(diào)整優(yōu)化[9]。本研究中在前期研究的基礎(chǔ)上建立了川麥冬藥材指紋圖譜新的分析方法，具有如下特點(diǎn)。

藥材提取溶劑：由甲醇變?yōu)?0%甲醇，使指紋圖譜包含了更多大極性成分的信息（如峰1～12）。對于部分麥冬相關(guān)的制劑，特別是麥冬相關(guān)的注射劑，這些成分因水溶性較好，往往伴隨工藝過程轉(zhuǎn)移至最終產(chǎn)品。此外，本研究中對流動(dòng)相梯度進(jìn)行了調(diào)整，使指紋圖譜同時(shí)包含了更多小極性成分的信息（如峰36～40）。這些成分占總峰面積的比例相對較大，含量較高，可轉(zhuǎn)移至最終制劑，其物質(zhì)基礎(chǔ)有待進(jìn)一步研究明確。對于保留時(shí)間8 min之前的色譜峰，因極性過大，保留時(shí)間過短，建議采取其他技術(shù)和方法建立多張指紋圖譜，以綜合評價(jià)藥材質(zhì)量。

檢測器：由UV－ELSD串聯(lián)變?yōu)閱蜤LSD。UV檢測器主要針對川麥冬中的高異黃酮類化合物。對于部分麥冬相關(guān)制劑，特別是麥冬相關(guān)的注射劑，高異黃酮類化合物因極性小、水溶性低，轉(zhuǎn)移率往往較低。因此，本研究中采用單ELSD檢測，降低儀器要求，減少分析測試成本。此外，本研究中采用國家藥典委員會(huì)推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，方法相對簡便，不涉及復(fù)雜的化學(xué)計(jì)量學(xué)算法及特殊的軟件。本研究中建立的分析方法具有較強(qiáng)的實(shí)用性，有利于醫(yī)藥工業(yè)行業(yè)實(shí)際應(yīng)用。

評價(jià)：本研究中采用相似度分析和相對保留時(shí)間及相對峰面積分析對指紋圖譜進(jìn)行了評價(jià)。10批川麥冬藥材的相似度均大于0．900，表明指紋圖譜整體有良好的相似性。川麥冬藥材有悠久的藥用及栽培歷史，良好的相似性顯示藥材質(zhì)量相對穩(wěn)定。相對峰面積反映了各色譜峰的比例關(guān)系，進(jìn)而更加細(xì)致地反映藥材的內(nèi)在質(zhì)量。在本研究中，各批次藥材共有峰的相對峰面積在較寬的范圍內(nèi)波動(dòng)（RSD＝7．1% ～71．9%），客觀反映了不同批次藥材成分比例的差異。因此，建議針對制劑的具體情況，利用本研究建立的分析方法研究各色譜峰從藥材到制劑的質(zhì)量傳遞規(guī)律，對主要移行成分和關(guān)鍵色譜峰的相對峰面積進(jìn)行規(guī)定，制訂合理的上下限。

[1]國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典（一部）[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：155－156．

[2]余伯陽，徐國鈞 ．中藥麥冬的資源利用研究[J]．中草藥，1995，26（4）：205－210．

[3]Chen MH，Chen XJ，Wang M，et al．Ophiopogon japonicus— A phytochemical，ethnomedicinal and pharmacological review[J]．J Ethnopharmacol，2016，181：193－213．

[4]吳發(fā)明，楊海燕，楊瑞山，等．四川麥冬質(zhì)量評價(jià)研究[J]．中藥材，2016，39（8）：1804－1809．

[5]吳發(fā)明，張思荻，曾 俊，等．HPLC－ELSD法測定不同產(chǎn)地麥冬中4種代表性成分的含量[J]．藥物分析雜志，2016，36（8）：1370－1376．

[6]童菊華，龐小存，王 威，等．杭麥冬與川麥冬中高異黃酮類成分和抗氧化活性的比較[J]．中草藥，2015，46（20）：3091－3095．

[7]劉 雪，楊會(huì)芳，李德坤，等．HPLC－ELSD法測定不同產(chǎn)地麥冬及山麥冬中的果糖[J]．中成藥，2016，38（4）：850－853．

[8]王 進(jìn)，劉漢清，劉 霖，等．HPLC定量指紋圖譜法評價(jià)川麥冬質(zhì)量研究[J]．中藥材，2013，36（5）：721－725．

[9]李 寧，車彥云，張 梁，等．HPLC－UV－ELSD結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法研究麥冬的指紋圖譜（英文）[J]．中國藥學(xué)：英文版，2013，22（1）：55－63．

[10]吳發(fā)明，張德林，陳 輝，等 ．川麥冬藥材中二氧化硫來源及殘留積累動(dòng)態(tài)分析[J]．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22（9）：12－15．

[11]Li N，Zhang L，Zeng KW，et al．Cytotoxic steroidal saponins from Ophiopogon japonicus[J]．Steroids，2013，78（1）：1－7．

[12]Li N，Zhang JY，Zeng KW，et al．Anti－inflammatory homoisoflavonoids from the tuberous roots of Ophiopogon japonicus[J]．Fitoterapia，2012，83（6）：1042－1045．

[13]聶黎行，石上梅，翟為民，等．指紋圖譜技術(shù)在中藥注射劑標(biāo)準(zhǔn)提高中的應(yīng)用[J]．中成藥，2015，37（3）：607－611．

[14]米內(nèi)網(wǎng)．2015年度中國醫(yī)藥市場發(fā)展藍(lán)皮書——公立醫(yī)院終端市場部分（Ⅱ）[J]．藥學(xué)進(jìn)展，2015，39（7）：501－513．

[15]米內(nèi)網(wǎng)．2015年度中國醫(yī)藥市場發(fā)展藍(lán)皮書——公立醫(yī)院終端市場部分（Ⅲ）[J]．藥學(xué)進(jìn)展，2015，39（8）：608－622．

[16]李鴻彬，李認(rèn)書．對上市中成藥再評價(jià)制度的回顧與思考[J]．中草藥，2015，46（2）：293－296．

HPLC Fingerprint Analysis of Ophiopogonis Radix Cultivated in Sichuan

Guo Mingli1，Zhang Jiayu2，Wang Bing3，Li Ning1，4，Dong Tingxia1，Zhan Huaqiang1，Tu Pengfei4
（1．HKUST Shenzhen Research Institute，Shenzhen，Guangdong，China 518057； 2．Center of Scientific Experiment，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing，China 100029； 3．Experiment Center for Teaching and Learning，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai，China 201203；4．State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs，School of Pharmaceutical Sciences，Peking University Health Science Center，Beijing，China 100191）

Objective To develop a new HPLC method to generate the fingerprint of OphiopogonisRadix cultivated in Sichuan province．M ethods A total of 10 batches ofOphiopogonis Radix samples were analyzed by HPLC，and 8 reference substances were used forthe identification of the common peaks．The fingerprint was further analyzed by similarityanalysis，relativeretention time analysis and relative peak area analysis．Results The similarities of all the samples tested were higher than 0．900．The relative peak areas of the common peaks varied in a relatively wide range（RSD＝7．1% －71．9%，n＝10）．Conclusion The method is simple，practical，suitable for industrial application，and could be used for the quality evaluation of Ophiopogonis Radix．

Ophiopogonis Radix；HPLC；fingerprint；quality evaluation

R282．71；R284．1

A

1006－4931(2017)04－0001－05

2016－11－09)

10．3969／j．issn．1006－4931．2017．04．001

國家自然科學(xué)基金[81303189，81303206]。

郭明里（1991－），女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)樗帉W(xué)與藥物分析，（電子信箱）gml53252811473272＠163．com。

李寧（1982－），男，博士研究生，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘钚猿煞峙c質(zhì)量評價(jià)，（電子信箱）mailtolining＠gmail．com。