外源性硫化氫對大鼠睪丸缺血再灌注損傷的保護作用

劉衛(wèi)華++++++鄧紅琴

[摘要] 目的 探討外源性硫化氫對大鼠睪丸缺血再灌注損傷的保護作用。 方法 選取成年雄性Wistar大鼠30只隨機分為3組，每組各10只：對照組（A組）、睪丸缺血再灌注損傷組（B組）、睪丸缺血再灌注損傷+硫化氫干預組（C組）。B組和C組大鼠建立睪丸扭轉(zhuǎn)復位模型，C組在再灌注前腹腔注射外源性硫化氫（100 μmol/kg）。HE染色觀察睪丸組織病理改變；測定丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）含量；采用原位缺口末端標記檢測細胞凋亡指數(shù)；免疫組化檢測睪丸組織中的Bax，Bcl-2和Caspase-3的表達情況。 結(jié)果 B組可見生精上皮排列紊亂，生精細胞廣泛脫落。與A組比較，B組中MDA含量和生精細胞凋亡指數(shù)明顯升高，SOD活性明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），B組中Bax/Bcl-2比值及Caspase-3表達明顯高于A組；C組明顯改善睪丸缺血再灌注損傷引起的變化，C組中MDA含量、SOD活性、生精細胞凋亡指數(shù)與B組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。 結(jié)論 外源性硫化氫可減輕氧化應(yīng)激水平和抑制生精細胞凋亡， 從而在睪丸組織在缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮保護作用。 [關(guān)鍵詞] 硫化氫；睪丸；缺血再灌注損傷；氧化應(yīng)激；凋亡

[中圖分類號] R563 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（b）-0025-04

[Abstract] Objective To investigate the protective effects of hydrogen sulfide （H2S） on the testicular ischemia-reperfusion injury in rats. Methods Thirty adult male Wistar rats were randomly divided into 3 groups， with 10 rats in each group， control group （group A）， testicular ischemia-reperfusion injury group （group B）， testicular ischemia reperfusion injury + H2S intervention group （group C）. The rats of group B and C underwent testicular torsion lasting 2 hours， H2S （100 μmol/kg） was injected intraperitoneally before reperfusion in group C. HE staining was used to observe the pathological changes of testis； Malondialdehyde （MDA） and superoxide dismutase （SOD） content were determined； cell apoptosis index was detected by dUTP nick end labeling； the expression of Bax， Bcl-2 and Caspase-3 in testis tissue were detected by immunohistochemistry. Results After ischemia-reperfusion injury， the left testicular tissue showed desquamation of epithelial cells in the lumen， disordered arrangement of spermatogenic cells. Compared with the group A， MDA content and the spermatogenic cell apoptosis index were significantly increased， and SOD activity significantly decreased in group B， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The expression of Bax/Bcl-2 ratio and Caspase-3 in group B were significantly higher than those in group A； the group C obviously improved the changes of testicular IRI， MDA content， SOD activity， the apoptosis index in group C were compared with group B， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion H2S reduces the level of oxidative stress and inhibits the apoptosis of spermatogenic cells， it plays a protective role in the process of ischemia-reperfusion injury.

[Key words] Hydrogen sulfide； Testis； Ischemia-reperfusion injury； Oxidative stress； Apoptosis

睪丸扭轉(zhuǎn)是泌尿外科中常見的急癥之一，多發(fā)生于新生兒和青少年時期[1]。一旦確診，應(yīng)盡早采取手法復位和手術(shù)治療方式恢復睪丸血流[2]。睪丸扭轉(zhuǎn)復位是一種典型的缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）過程[3]。硫化氫（H2S）作為一種新型的氣體信號分子，在多種器官的缺血再灌注損傷過程中，具有抗氧化、抗炎及抗凋亡等作用[4]。但是H2S對睪丸IRI的影響少見于報道，本研究通過建立大鼠睪丸IRI模型，觀察外源性H2S在大鼠睪丸IRI過程中的作用，為睪丸IRI的防治提供新的手段。

1 材料與方法

1.1 試劑及器材

NaHS（H2S外源性供體）（Sigma公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；原位細胞凋亡檢測試劑盒（德國羅氏生物技術(shù)有限公司）；Caspase-3，Bax、Bcl-2抗體（加拿大圣克魯斯公司）；免疫組化檢測試劑盒（福建邁新公司）。

1.2 實驗動物和分組

30只成年雄性Wistar大鼠，年齡約10周，體重250～300 g，購于湖北省疾病預防與控制中心。隨機分為3組，每組各10只。實驗前，所有大鼠飼養(yǎng)在恒定溫度的房間（22±2）℃，給予相同的食物和水。所有大鼠經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉。對照組（A組）：左側(cè)睪丸行陰囊切口后縫合切口，不給予任何干預措施，8 h后麻醉取材；睪丸IRI組（B組）：左側(cè)陰囊切口，720°順時針扭轉(zhuǎn)睪丸，5-0絲線固定于陰囊皮膚，扭轉(zhuǎn)2 h后睪丸恢復自然位置，再灌注6 h后麻醉取材；睪丸IRI+H2S干預組（C組）：在B組基礎(chǔ)上，再灌注前腹腔注射外源性H2S（100 μmol/kg ），再灌注6 h后麻醉取材。

1.3 取材及標本制備

再灌注后6 h，快速脫頸椎法處死所有大鼠，快速采集左側(cè)睪丸標本。仔細剪除附著的脂肪組織和筋膜，生理鹽水沖洗后以濾紙拭干用于隨后的實驗。

1.4 HE染色

在相對無菌的條件下，用生理鹽水將睪丸組織沖洗干凈后，置于4%的甲醛溶液中固定24 h，然后行石蠟包埋。5 μm厚切片，脫蠟，水化后并進行HE染色，光鏡下觀察睪丸組織的形態(tài)學改變。

1.5 MDA和SOD測定

MDA和SOD是氧化應(yīng)激的指標。冷凍的睪丸組織勻漿、離心（3000 r/min，10 min），然后收集上清液。MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定，SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法，操作按照說明書指示進行。于吸光度在532 nm處測定MDA水平，單位為 nmol/g蛋白。在吸光度550 nm處檢測SOD活性，單位為U/mg蛋白。

1.6 生精細胞凋亡檢測

生精細胞凋亡檢測采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）法，細胞核染成棕色者為TUNEL陽性細胞，光鏡下（200×）每張切片選取10個視野，計數(shù)500個細胞。生精細胞的凋亡指數(shù)（AI）= 陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.7 免疫組化

Bax，Bcl-2和Caspase-3的表達采用免疫組化染色分析，所有的步驟按說明書指示進行，顯微鏡下棕褐色為陽性染色。采用Image-Pro Plus 6.0進行免疫組化的圖片分析，每張切片隨機選定5個視野，設(shè)定基線標準染色強度的判定標準后，測定5個視野下的平均光密度值，其值越大，染色越深，反映細胞內(nèi)蛋白表達量越高。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2 結(jié)果

2.1 睪丸組織的病理學改變

A組可見曲精小管內(nèi)各級生精細胞排列有序，管腔有大量精子，未見明顯損傷；B組可見生精上皮排列稀疏、紊亂，間質(zhì)水腫，生精細胞廣泛脫落；C組可見生精細胞排列正?；蜉p度紊亂，少數(shù)腔內(nèi)可見脫落的生精細胞（圖1，封四）。

2.2 睪丸組織中MDA、SOD含量的變化

B組中MDA含量明顯高于A組（P < 0.05）；經(jīng)H2S處理后，C組中MDA含量較B組顯著降低（P < 0.05）。B組SOD活性明顯低于A組（P < 0.05）； H2S干預后，C組睪丸SOD活性明顯較B組增高（P < 0.05）。見表1。

2.3 睪丸組織生精細胞凋亡情況

A組可見較少的、散在的生精細胞凋亡；B組中生精凋亡細胞較A組顯著增加，染色陽性細胞主要分布在各級生精細胞，與A組比較差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；C組生精細胞凋亡較B組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖2（封四）、表2。

2.4 睪丸組織中Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達情況

免疫組化染色檢測睪丸組織Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達，結(jié)果顯示Bax、Caspase-3在A組僅可見生精細胞細胞質(zhì)和細胞核中散在的陽性表達；B組中，其陽性表達較A組明顯增多，表現(xiàn)為細胞質(zhì)和細胞核呈現(xiàn)為黃色或棕黃色；與B組比較，C組中陽性表達明顯減少。Bcl-2在A組中可見生精細胞細胞質(zhì)中大量表達；B組和C組中陽性表達較A組明顯減少。見圖3（封四）。

3 討論

睪丸扭轉(zhuǎn)復位是IRI主要的病理生理過程，可引起睪丸結(jié)構(gòu)功能的改變、氧化應(yīng)激水平升高以及生精細胞的異常凋亡[5-7]。H2S是繼內(nèi)源性一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后的第三種氣體信號分子，其無色，有臭雞蛋氣味，可溶于水及脂溶性溶劑，在體內(nèi)以H2S/NaHS的形式保持動態(tài)平衡[8]。研究顯示，H2S在多種器官的缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮作用[8]。Yong等[9]發(fā)現(xiàn)一定濃度的外源性H2S可明顯降低IRI后心肌梗死面積，對大鼠心肌產(chǎn)生保護作用；Hosgood等[10]使用無心跳供體的豬腎移植模型觀察外源性H2S對腎缺血再灌注損傷的作用發(fā)現(xiàn)，使用H2S可明顯降低血肌酐并能改善再灌注后肌酐清除率。Kimura等[11]報道了H2S可明顯減少氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的生成，從而抑制大鼠神經(jīng)細胞線粒體中的氧化應(yīng)激水平；本實驗采用HE染色觀察睪丸IRI對大鼠睪丸組織學變化的影響，結(jié)果顯示：IRI組出現(xiàn)生精上皮排列紊亂，生精細胞廣泛脫落等表現(xiàn)，嚴重影響了睪丸結(jié)構(gòu)及生精功能；外源性H2S治療后明顯改善了睪丸缺血再灌注引起的組織學損傷。

氧化應(yīng)激是ROS過量產(chǎn)生或細胞內(nèi)抗氧化機制障礙導致的活性氧自由基大量積累的結(jié)果。過量的活性氧可以氧化細胞膜蛋白、脂質(zhì)和DNA，導致一系列細胞功能障礙或死亡[12-13]。IRI過程中伴有氧自由基的產(chǎn)生，而后者促進了IRI的進一步發(fā)展。MDA是脂質(zhì)過氧化分解產(chǎn)生最終產(chǎn)物，通?？勺鳛檠趸瘧?yīng)激水平的標志物。SOD是細胞生長、分化過程中的重要組成部分[14]， 其抗氧化能力可改善睪丸IRI的損傷[15-16]。在本研究中，經(jīng)H2S處理后，可明顯減輕IRI睪丸組織的脂質(zhì)氧化，同時可降低MDA含量，提高SOD水平。這表明外源性H2S對睪丸IRI引起的氧化應(yīng)激產(chǎn)生了保護作用。

細胞凋亡是一種正常的生理現(xiàn)象， 也是一種基于遺傳學機制的細胞死亡模式，通過誘導一系列形態(tài)和生化的改變導致細胞死亡的過程，在維持精子發(fā)生的動態(tài)平衡中起著重要的作用，凋亡過程的改變會使生精細胞發(fā)生異常凋亡[17。Hadziselimovic等[17]研究發(fā)現(xiàn)，睪丸IRI可使同側(cè)睪丸細胞凋亡的發(fā)生率升高，且細胞凋亡的程度與缺血時間有關(guān)。Bcl-2是一組家族蛋白，其中包含促凋亡因子（如Bax）和抗凋亡因子（如Bcl-2），它們是近年來發(fā)現(xiàn)的一對關(guān)系密切的凋亡基因，在細胞凋亡調(diào)控過程中起著重要作用[18]。在人類凋亡通路級聯(lián)反應(yīng)中，Caspase是細胞凋亡機制中必不可少的組成部分，在多種發(fā)病機制中起著重要的作用。其中，Caspase-3是介導細胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)酶，是凋亡執(zhí)行的關(guān)鍵效應(yīng)分子，也是多種凋亡刺激信號傳遞的匯聚點，它的活化是細胞凋亡進入不可逆階段的標志[19-20]。Bos等[20]發(fā)現(xiàn)外源性H2S可防止Caspase-3的激活，且通過H2S預處理也能防止IRI，從而肯定了H2S可通過抑制Caspase-3產(chǎn)生抗凋亡的作用。在本實驗IRI組（B組）中，Bax/Bcl-2比值及Caspase-3表達明顯高于對照組（A組）（P < 0.05）， 其生精細胞凋亡指數(shù)顯著升高；經(jīng)H2S干預后（C組），Bax/Bcl-2，Caspase-3的表達以及生精細胞凋亡指數(shù)較IRI組明顯降低（P < 0.05）。以上實驗結(jié)果證明H2S在睪丸缺血再灌注中具有抗凋亡作用。

綜上所述，外源性H2S可減輕氧化應(yīng)激水平和抑制生精細胞凋亡， 從而在睪丸組織IRI發(fā)揮保護作用，其作用機制還需要深入研究。以上這些發(fā)現(xiàn)為更好地理解新型氣體信號分子H2S對泌尿生殖系統(tǒng)的作用提供了依據(jù)，無疑將為未來治療睪丸IRI提供新的思路。

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