抑制EphA4受體活性對少突膠質(zhì)前體細(xì)胞發(fā)育影響的研究

辛伽倫++++++黃冬++++++夏冬東++++++劉之榮

[摘要] 目的 探討抑制EphA4受體活性對少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPC）發(fā)育的影響。 方法 將分離純化的OPC隨機(jī)分為正常組、EphA4受體抑制劑處理組（EphA4-FC組）。EphA4-FC組加入250 nmol/L EphA4-FC，培養(yǎng)至第2天。免疫細(xì)胞化學(xué)染色法觀察正常組OPC特異性標(biāo)志物NG2與EphA4受體的共表達(dá)情況；通過細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察兩組OPC數(shù)量變化情況；通過Western blot檢測兩組細(xì)胞蛋白樣品中OPC特異性蛋白血小板源性生長因子α受體（PDGFαR）的表達(dá)變化情況。 結(jié)果 免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，正常體外培養(yǎng)OPC高表達(dá)EphA4受體；與正常組比較，EphA4-FC組的NG2+陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多（P < 0.05）。Western blot顯示，與正常組比較，EphA4-FC組細(xì)胞蛋白中PDGFαR的表達(dá)顯著增高（P < 0.05）。 結(jié)論 培養(yǎng)的OPC上高表達(dá)EphA4受體，通過抑制EphA4受體可以促進(jìn)OPC的增殖。

[關(guān)鍵詞] EphA4受體；少突膠質(zhì)前體細(xì)胞；慢性腦缺血；腦白質(zhì)損傷

[中圖分類號] R743.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（b）-0013-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of inhibit EphA4 receptor on oligodendrocyte progenitor cell （OPC）. Methods The purified OPC was randomly divided into normal group and EphA4-FC group （250 nmol/L， 2 d）. Immunofluorescence staining was used to observe the co-expression of NG2 （a marker for OPC） and EphA4 receptor. Cell counting was used to observe the change of OPC. Western blot was used to examine the expression of platelet-derived growth factor α receptor （PDGFαR， a marker for OPC） in two groups. Results Immunofluorescence staining showed that the high expression of EphA4 receptor on OPCs in vitro， and compared with normal group， more NG2+ cells were observed in the EphA4-FC group （P < 0.05）. Western blot showed that PDGFαR expression was significantly increased， compared with normal group （P < 0.05）. Conclusion EphA4 receptor is express highly on OPC in vitro， and inhibition of EphA4 receptor can promote OPC proliferation.

[Key words] EphA4 receptor； Oligodendrocyte progenitor cell； Chronic cerebral ischemia； White matter lesion

隨著人口老齡化進(jìn)程發(fā)展，超過一半的老年人有不同程度的腦白質(zhì)損傷（WML）[1]，慢性腦灌注不足是導(dǎo)致WML的主要原因[2-3]。腦白質(zhì)的組成成分少突膠質(zhì)細(xì)胞（OLs）、軸突和髓鞘對缺血高度易損，OLs的死亡丟失、軸突的變性壞死及髓鞘的脫失是WML的主要病理改變[4]。OLs來源于腦白質(zhì)原位的OPC以及室管膜下區(qū)的多潛能神經(jīng)干細(xì)胞[5-6]，腦白質(zhì)脫髓鞘損傷后，損傷原位的OPC可通過增殖分化補(bǔ)充死亡丟失的OLs[7]。研究表明，Eph-Ephrin信號通路可影響OLs系的發(fā)育，如脊髓損傷后OPC和OLs上均有Eph受體表達(dá)[8]；OPC與軸突間可通過Eph-Ephrin相互作用進(jìn)行遷移[9]；阻滯EphA4可促進(jìn)小鼠脊髓損傷后軸突再生[10]；阻滯EphA4信號通路，可改善阿爾茲海默病小鼠模型中海馬的突觸功能障礙[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)WML過程中存在OLs系的減少，同時(shí)伴隨EphA4表達(dá)變化，兩者呈負(fù)相關(guān)[12]。為此，設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)探討抑制EphA4受體是否對OPC發(fā)育有影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料

SD仔鼠[新生3 d，SPF級，40只，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號：SCXK（軍）2012-0007；遵循第四軍醫(yī)大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用的指南，并經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行]。EphA4受體抑制劑EphA4-FC（R&D Systems），小鼠源性抗NG2抗體（Abcam），兔源性抗EphA4抗體（Abcam），兔源性抗PDGFαR抗體（Abcam），小鼠源性抗GAPDH抗體（康為世紀(jì)）。

1.2 方法

1.2.1 OPC細(xì)胞培養(yǎng) 采用本課題組前期研究的改良法培養(yǎng)OPC[13]，將其接種至事先包被過的含玻片的24孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)雙標(biāo)記染色 取出放置于24孔板內(nèi)的細(xì)胞爬片，4%PFA固定20 min；PBS沖洗5 min×3次；一抗孵育（NG2=1∶500；EphA4=1∶250），4℃冰箱內(nèi)孵育過夜；次日，PBS沖洗5 min×3次；二抗孵育（Rb-biotin=1∶250；Ms-cy3=1∶250），室溫下避光孵育1 h；PBS沖洗5 min×3次；三抗孵育（avidin-cy2=1∶250），室溫下避光孵育1 h；PBS沖洗5 min×3次，甘油封片、采圖。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色后細(xì)胞計(jì)數(shù) 將放置有細(xì)胞爬片的24孔板隨機(jī)分成兩組：正常組、EphA4-FC組。抑制劑處理組加入250 nmol/L EphA4-FC，培養(yǎng)至第2天后處理。染色方法同前，做3次以上進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，每次實(shí)驗(yàn)每組細(xì)胞至少選取3張細(xì)胞爬片，每張爬片不少于20個(gè)視野，用來觀察并計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)NG2/Hoechst+細(xì)胞，計(jì)數(shù)按雙盲原則進(jìn)行。

1.2.4 Western blot 將培養(yǎng)有OPC的培養(yǎng)皿隨機(jī)分為兩組：正常組、EphA4-FC組。抑制劑處理組加入250 nmol/L EphA4-FC，培養(yǎng)至第2天后處理。用細(xì)胞膜蛋白提取試劑盒（碧云天生物技術(shù)）提取各組細(xì)胞膜蛋白；測定蛋白濃度后制備蛋白樣品；然后依次進(jìn)行制膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉；孵育一抗（PDGFαR=1∶500，GAPDH=1∶3000），4℃過夜；孵育二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG=1∶10 000，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG=1∶10 000，康為世紀(jì)）室溫1 h；洗膜后放入化學(xué)發(fā)光儀中顯影、采圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)OPC上EphA4受體表達(dá)情況

免疫細(xì)胞化學(xué)雙標(biāo)記染色法觀察培養(yǎng)OPC中EphA4受體的表達(dá)結(jié)果，見圖1。在正常培養(yǎng)的OPC細(xì)胞中，可見NG2+（紅色）細(xì)胞與EphA4+（綠色）細(xì)胞共存。Merge結(jié)果顯示，NG2+標(biāo)記OPC細(xì)胞上大量表達(dá)EphA4受體，共標(biāo)完全。

2.2 抑制EphA4受體活性對OPC增殖的影響

免疫細(xì)胞化學(xué)染色后通過細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察EphA4-FC對OPC增殖的影響結(jié)果，見圖2。與正常組比較，EphA4-FC組的NG2+/Hoechst+雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多（P < 0.05）。

2.3 抑制EphA4受體活性對OPC標(biāo)記蛋白PDGFαR表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果見圖3。與正常組比較，EphA4-FC組的PDGFαR蛋白表達(dá)量明顯升高（P < 0.05）。

3 討論

研究表明，防治WML的關(guān)鍵是補(bǔ)充死亡丟失的OLs[14]。OLs主要來源于SVZ區(qū)的Type-B細(xì)胞，其分化產(chǎn)生OPC，OPC繼續(xù)增殖后遷移至各白質(zhì)區(qū)域，然后分化為成熟的OLs[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，Eph受體家族成員EphA4在脊髓損傷修復(fù)中扮演了重要角色，可影響脊髓白質(zhì)損傷修復(fù)及軸突再生過程[16]。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，WML存在OPC及EphA4受體表達(dá)變化[12]。為此本研究通過EphA4-FC抑制OPC上EphA4受體活性，觀察EphA4受體活性改變對OPC發(fā)育的影響。通過上述研究結(jié)果可以看出，正常培養(yǎng)的OPC細(xì)胞上有大量EphA4受體表達(dá)。對培養(yǎng)的OPC給予EphA4抑制劑處理后發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，EphA4-FC組OPC細(xì)胞數(shù)量明顯增多；同時(shí)，OPC特異性標(biāo)志蛋白PDGFαR表達(dá)量的增多也反映了OPC細(xì)胞數(shù)量增多。由此表明，抑制OPC上的EphA4受體活性可以促進(jìn)其增殖。雖然本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EphA4受體對OPC發(fā)育有影響，但其作用機(jī)制尚不明確，通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，Eph受體下游信號通路有ERK/MAPK、Rho-GTP等[17-18]。有研究表明，ERK/MAPK是調(diào)控細(xì)胞增殖分化的重要信號通路[19]；而RhoA信號通路是神經(jīng)細(xì)胞軸突再生、導(dǎo)向，細(xì)胞骨架重塑等的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[20]。Eph-Ephrin信號通路的激活可抑制ERK/MAPK，但激活RhoA[21]。由此可作出推測，OPC上存在的EphA4受體可通過Eph-Ephrin信號通路激活下游的RhoA并抑制ERK，最終發(fā)揮影響OPC發(fā)育的作用，這一過程還有待進(jìn)一步探討闡釋。現(xiàn)有研究階段表明，抑制EphA4受體活性可促進(jìn)OPC的增殖，從而補(bǔ)充死亡丟失的OLs，達(dá)到防治WML的目的，這為WML的防治提供了新的理論依據(jù)。

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