超聲波輔助花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法的研究進(jìn)展

王長彪，杜建中，趙興華，劉 江，郝曜山，張歡歡，韓 斌，孫 毅

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031）

超聲波輔助花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法的研究進(jìn)展

王長彪，杜建中，趙興華，劉 江，郝曜山，張歡歡，韓 斌，孫 毅

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031）

超聲波輔助花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法是擁有國內(nèi)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的植物轉(zhuǎn)化手段，該方法在玉米、油菜、花生等作物上的轉(zhuǎn)化研究均取得積極進(jìn)展。為較詳盡了解國內(nèi)外應(yīng)用該方法進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化研究的現(xiàn)狀，針對(duì)該方法與其他植物轉(zhuǎn)化方法比較所體現(xiàn)出的優(yōu)勢(shì)以及存在的問題進(jìn)行了總結(jié)，以期為相關(guān)研究者提供一些參考資料，并為該方法的進(jìn)一步改進(jìn)完善提供依據(jù)。

植物；花粉介導(dǎo)；超聲波；轉(zhuǎn)化方法；進(jìn)展

植物基因工程的誕生是全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)史上的又一次革命，它的發(fā)展為農(nóng)業(yè)、農(nóng)村和農(nóng)民帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益。作為一個(gè)系統(tǒng)工程的植物基因工程，包括諸多內(nèi)容，就其轉(zhuǎn)化方法而言，世界上通用的、應(yīng)用范圍也較廣的植物轉(zhuǎn)化方法目前有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[1]、基因槍法[2]、花粉管通道法[3]，還有一些相對(duì)應(yīng)用較少的方法如PEG介導(dǎo)法[4]、電穿孔法[5]等，以及上述方法的改良衍生轉(zhuǎn)化體系，這些方法是植物基因工程領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)手段，為全球植物轉(zhuǎn)基因研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化作出了巨大貢獻(xiàn)。筆者要討論的是最近10多年新發(fā)展起來的一種有花植物轉(zhuǎn)化方法，超聲波輔助花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法的構(gòu)思和摸索起步于20世紀(jì)90年代，并于1999年第一次申請(qǐng)并獲得國家發(fā)明專利[6]，后因?qū)＠麜r(shí)效問題，于2011年再次申請(qǐng)國家發(fā)明專利并被授權(quán)[7]。該發(fā)明方法以植物花粉作為受體，以質(zhì)粒DNA或其他攜帶有調(diào)控目的基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止子的DNA作為供體，采集的花粉于最佳等滲溶液（5%～50%的蔗糖溶液）中進(jìn)行第1次超聲波處理，使花粉處于感受態(tài)，并使花粉粒上可能存在的核酸酶失活，避免這種核酸酶對(duì)其后加入的外源DNA的降解或破壞；然后在等滲液中加入目的DNA片段，進(jìn)行第2次超聲波處理，通過超聲波的輔助作用使目的基因進(jìn)入到感受態(tài)花粉中（整個(gè)處理過程花粉溶液都處在低溫冰浴內(nèi)）；接著把處理好的花粉授到植物柱頭上，并收獲其種子；來年將收獲的種子播種，在播前對(duì)萌發(fā)種子和幼苗進(jìn)行2次篩選，得到抗性苗；然后對(duì)成苗株取樣進(jìn)行PCR擴(kuò)增及Southern雜交檢測(cè)，確定轉(zhuǎn)化事件。該方法無需耗時(shí)冗長的組織培養(yǎng)過程，突破了物種及基因型依賴性。眾多研究表明，該方法的使用不僅節(jié)省了人力物力，縮短了轉(zhuǎn)基因育種年限，還提高了植物轉(zhuǎn)化效率。關(guān)于超聲波輔助花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法的推廣應(yīng)用，山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心自2009年起先后舉辦了6屆全國性的技術(shù)培訓(xùn)會(huì)議，起到了很好的宣傳推廣效果，也引發(fā)研究者對(duì)該轉(zhuǎn)化方法的廣泛關(guān)注和應(yīng)用。

1 超聲波輔助花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法的原理及其可行性驗(yàn)證

超聲波是物質(zhì)介質(zhì)中的一種彈性機(jī)械波，既是一種波動(dòng)形式，又是一種能量形式。這種能量形式在其達(dá)到一定劑量并在溶液或細(xì)胞內(nèi)傳播時(shí)，能引起溶液或細(xì)胞的功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即產(chǎn)生了超聲生物效應(yīng)。超聲波處理花粉主要是利用了超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)?？栈?yīng)是在超聲波處理時(shí)，溶液或花粉內(nèi)液形成空泡，空泡的震動(dòng)與其迅猛的閉合會(huì)產(chǎn)生出沖擊波，正是這種沖擊波，可使花粉萌發(fā)孔瞬間打開或花粉破裂；同時(shí)空化泡破裂時(shí)產(chǎn)生的數(shù)千度高溫和數(shù)百萬帕的高壓，可使溶液中水分子電離，產(chǎn)生OH－離子和H+，由此所誘發(fā)的氧化還原反應(yīng)可使花粉粒上一些酶類失活。超聲波機(jī)械效應(yīng)是指超聲波在傳播過程中引起介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)發(fā)生的壓力變化，這種變化能破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。

超聲波輔助花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法的原理就是利用超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)所產(chǎn)生的強(qiáng)大沖擊力對(duì)花粉結(jié)構(gòu)引發(fā)的改變，使花粉萌發(fā)孔瞬間打開，并借助這種沖擊力使外源基因擁有能夠進(jìn)入花粉細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)力。

花粉是種子植物特有的結(jié)構(gòu)，相當(dāng)于一個(gè)小孢子和由它發(fā)育的前期雄配子體，攜帶有植物的全部遺傳信息?；ǚ凼诜鄣酵N植物柱頭上，完成授粉過程，孕育下一代植株的誕生，所以，花粉是有花植物遺傳和變異的重要器官?；ǚ凼怯猩模ǚ凵盍κ侵富ǚ劬哂写婊?、生長、萌發(fā)或發(fā)育的能力[8]，與花粉自身的遺傳特性和外界因素有著極其密切的關(guān)系[9]。田間自然狀態(tài)下，水稻花粉壽命只有10 min；玉米花粉僅為1 d；菊花花粉為1～2 d。即便都是新鮮花粉，不同物種花粉的生活力也不盡相同，據(jù)報(bào)道，在均為新鮮花粉前提下，僵麥草花粉的生活力為100%，節(jié)瓜花粉為90%[10]，杏花粉僅為80%[11]。

溫度、儲(chǔ)藏介質(zhì)、超聲波處理等因素對(duì)花粉生活力都有一定的影響，現(xiàn)敘述如下。

據(jù)報(bào)道，煙草花粉在-5℃可保存1 a，仍正常萌發(fā)[12]，蘋果-15℃可保存9個(gè)月，萌發(fā)率95%[13]，玉米5～10℃，可保存5 d，正常萌發(fā)[14]，水稻12℃可保存24 h[15]。溫度對(duì)不同物種花粉生活力的影響有明顯差異。對(duì)于超低溫的影響，1922年，KNOWLTON[16]研究表明，金魚草花粉在-180℃儲(chǔ)藏仍有活力；VISSER[17]的研究證明，番茄、西洋梨和杜鵑花的花粉在-196℃儲(chǔ)藏，花粉活力沒有明顯改變；WANG等[18]研究認(rèn)為，番茄花粉在4，-196℃可保存1～3 d，延長保存時(shí)間，花粉生活力會(huì)急劇下降。對(duì)于高溫的影響，BARROW[19]發(fā)現(xiàn)，高溫對(duì)棉花花粉生活力影響較大，43℃時(shí)所有花粉失去生活力；劉自剛[20]采用在不同溫度下干燥處理桔?；ǚ鄣姆绞?，研究處理后不同儲(chǔ)藏時(shí)間內(nèi)花粉的生活力，結(jié)果表明，30℃下花粉培養(yǎng)1.5 h是最佳條件。干燥箱、日曬、自然放置等不同干燥方式和處理時(shí)長，桔梗花粉萌發(fā)率和花粉管長度均有所下降，其中，45℃烘干1.5 h處理的花粉結(jié)實(shí)率下降速度最慢，保存5 d還能授粉結(jié)實(shí)。

花粉儲(chǔ)藏的介質(zhì)，多以水、無機(jī)溶液和有機(jī)溶液作為研究對(duì)象。王霞等[21]在對(duì)玉米花粉做EMS誘變處理時(shí)發(fā)現(xiàn)，配制EMS溶液的介質(zhì)不同，處理?xiàng)l件下玉米的結(jié)實(shí)率明顯不同，離體花粉在5%的蔗糖溶液處理效果最好，但處理時(shí)長超過30 min后，結(jié)實(shí)率下降，蒸餾水處理花粉的結(jié)實(shí)率幾乎為0，而使用石蠟油作為介質(zhì)，處理10～30 min效果最佳，處理時(shí)間延長，結(jié)實(shí)率下降；呂仲賢等[22]發(fā)現(xiàn)，通過擴(kuò)散和滲透，玉米花粉中的營養(yǎng)成分進(jìn)入介質(zhì)水中，且花粉泡水會(huì)對(duì)花粉壁造成傷害；曹敏建等[23]的研究證明，蔗糖濃度過高會(huì)造成原生質(zhì)脫水，抑制花粉萌發(fā)；劉雪蓮等[24]報(bào)道，花粉培養(yǎng)介質(zhì)中加入一定質(zhì)量濃度的硼酸，可促進(jìn)紫丁香花粉的萌發(fā)和花粉管生長，但不能過量，過量的硼酸會(huì)使花粉生活力下降[25]；張立磊等[26]研究蔗糖，硼酸，CaCl2，MgSO4，ZnSO4這5個(gè)因素不同濃度對(duì)豐花月季花粉生活力的影響，結(jié)果表明，按對(duì)花粉萌發(fā)的影響從大到小依次為蔗糖＞硼酸＞ZnSO4＞CaCl2＞MgSO4，前三者在一定濃度下對(duì)花粉的萌發(fā)有較大的促進(jìn)作用，蔗糖最佳濃度為100 g/L，但超過最佳濃度時(shí)會(huì)起抑制作用，在一定濃度范圍內(nèi)，ZnSO4濃度對(duì)花粉的萌發(fā)率影響是先降后升，MgSO4濃度變化對(duì)花粉活力無影響。鈣離子對(duì)花粉生活力的影響也很大，過少或過多的鈣都會(huì)限制花粉和花粉管的生長[27]。

岳新麗等[28]用超聲波處理葡萄花粉，發(fā)現(xiàn)超聲波處理各參數(shù)對(duì)葡萄花粉有極顯著影響，超聲波處理參數(shù)以功率100～120 W，處理時(shí)間4～5 s，間隙時(shí)間2～6 s，處理6次的組合為最佳處理方法，既能保證花粉完整率和萌發(fā)率穩(wěn)定，又不破壞外源基因DNA片段，GUS活性組織定位檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化率為4‰。胡雪嬌等[29]采用溫差-超聲波結(jié)合的方法對(duì)核桃花粉進(jìn)行破壁處理，發(fā)現(xiàn)在料液比1∶15 g/mL、溫差110℃、冷凍時(shí)間18 h、超聲時(shí)間35 min、超聲功率720 W時(shí)，核桃花粉破壁率為83.79%，可見超聲波處理強(qiáng)度和時(shí)長對(duì)花粉生活力的影響有多大；崔貴梅等[30]研究發(fā)現(xiàn)，超聲波處理對(duì)花粉的生活力和萌發(fā)率都有影響，超聲波處理后，花粉生活力下降50%，萌發(fā)率下降更嚴(yán)重，因此，超聲波輔助的花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法結(jié)實(shí)率較低，空穗率達(dá)60%左右，結(jié)實(shí)穗也僅有幾粒種子，多者二三十粒，雖然結(jié)實(shí)率低，但本方法的實(shí)際轉(zhuǎn)化率卻最高達(dá)28%以上。

關(guān)于外源DNA導(dǎo)入花粉及導(dǎo)入外源DNA后花粉生活力的證據(jù)，這方面的嘗試最初是花粉粒與外源DNA混合培養(yǎng)，HESOLP-HARRISON[31]發(fā)現(xiàn)，外源DNA能透過水合花粉的內(nèi)壁；O'DRISCOLL等[32]認(rèn)為，外源DNA可通過花粉管尖端的胞吞作用進(jìn)入花粉內(nèi)，但HESOLP-HARRISON等[33]和KRANZ等[34]卻提出了相反的觀點(diǎn)；甚至LANGRIDGE等[35]還指出，通過花粉途徑進(jìn)行谷物轉(zhuǎn)化是很難的，他們甚至還證明了早期的一些研究成果大概有人為創(chuàng)造之嫌；不過類似研究并未種植，隨后的研究者又試圖用顯微注射法、電激法、基因槍法、激光微束法等解決外源基因?qū)牖ǚ哿栴}，如KRANZ等[34]通過玉米花粉萌發(fā)孔注射質(zhì)粒DNA獲得成功，隨后用電激法、基因槍法等也成功將外源DNA導(dǎo)入花粉粒，這些研究結(jié)果經(jīng)分子雜交實(shí)驗(yàn)、GUS組織化學(xué)分析、電鏡觀察和共聚焦激光掃描顯微鏡觀察等手段均得到證實(shí)；但是證明外源DNA能夠進(jìn)入花粉且能夠保證花粉具有一定的生活力還不夠，對(duì)這些攜帶外源基因的花粉的育性大小還需要詳細(xì)探討[36]；LEONNE等[37-38]將轉(zhuǎn)化的花粉授粉于原品種柱頭后發(fā)現(xiàn)可正常結(jié)實(shí)；2013年，李娜等[39]把綠色熒光蛋白基因GFP轉(zhuǎn)入玉米離體花粉中，對(duì)轉(zhuǎn)化花粉進(jìn)行體外培養(yǎng)和人工授粉，用熒光顯微鏡觀察GFP基因在花粉、花粉管以及胚中的表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化胚與非轉(zhuǎn)化胚均有強(qiáng)烈熒光，認(rèn)為以花粉粒熒光反應(yīng)作為花粉轉(zhuǎn)化依據(jù)不可靠；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化花粉人工授粉后，被授粉植株的花粉管和胚中均有GFP表達(dá)的熒光反應(yīng)，認(rèn)為后兩者可作為花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的證據(jù)，授粉植株的種子播種后得到轉(zhuǎn)化植株及后代。李娜等再次以充分證據(jù)證明花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法可將外源DNA導(dǎo)入花粉中，并能獲得轉(zhuǎn)基因植株。

2 超聲波輔助花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法的研究進(jìn)展

超聲波輔助花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法（簡稱花粉介導(dǎo)法）的最早研究報(bào)道見于1997年。1999年，王景雪等[40-41]研究表明，于1997年采用花粉介導(dǎo)法將幾丁質(zhì)酶基因?qū)胗衩鬃越幌堤?101、綜31等材料，獲得轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化率高達(dá)42.9%，并認(rèn)為本法簡單、易操作、實(shí)用且省時(shí)；2002年，梁雪蓮等[42-43]采用注射法、花粉介導(dǎo)法和萌動(dòng)胚法轉(zhuǎn)化bar基因?qū)胗衩S糯、白糯、金黃96C等中，均獲得了轉(zhuǎn)化植株，但3種轉(zhuǎn)化方法結(jié)實(shí)率分別為1%，3%～4%，3%～4%，從轉(zhuǎn)化目的性看，后兩者也強(qiáng)于注射法，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，同種試驗(yàn)條件下，這3種方法的轉(zhuǎn)化率高于基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，且不需組培和再生過程，省時(shí)省力；同一年，陳定虎[44]研究表明，采用花粉介導(dǎo)法將攜帶PAP基因的植物轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入玉米材料中，獲得了32粒種子，播種得到9株植株，經(jīng)PCR檢測(cè)得到5株有目的基因存在的植株，再經(jīng)Southern，Western等雜交檢測(cè)得到1個(gè)轉(zhuǎn)化事件，對(duì)其后代的抗病鑒定發(fā)現(xiàn)，接種病毒后，非轉(zhuǎn)化株系7 d后發(fā)病，而轉(zhuǎn)化植株直到25 d時(shí)也未發(fā)病；解志紅[45]采用花粉介導(dǎo)法將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化棉花遠(yuǎn)緣雜交高代材料海208、海209，轉(zhuǎn)化率達(dá)到32%；2004年，王節(jié)之等[46]采用花粉介導(dǎo)法將幾丁質(zhì)酶基因?qū)牍茸悠贩N晉谷21號(hào)不育系，T1PCR檢測(cè)獲得7個(gè)陽性植株，T2株系先噴除草劑篩選，存活植株做抗病鑒定，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因谷子株系的黑穗病發(fā)病率明顯低于非轉(zhuǎn)化的對(duì)照株系，最終獲得了雙抗植株；杜春芳等[47-48]利用花粉介導(dǎo)法將GUS基因?qū)胗筒藭x油7號(hào)，GUS組織化學(xué)分析和活性檢測(cè)均證明，GUS基因?qū)牖ǚ哿Ｇ沂斋@到授粉植株的種子，進(jìn)一步檢測(cè)獲得6個(gè)轉(zhuǎn)化植株；2006年，梁雪蓮等[49]利用花粉介導(dǎo)法將抗蟲基因CpTI導(dǎo)入花生品種仲愷01號(hào)，就蔗糖濃度、超聲波處理等對(duì)花粉生活力的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，對(duì)于花生的花粉，蔗糖濃度以10%最佳，超聲波強(qiáng)度為100 W時(shí)，花粉無損傷，200 W時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，但細(xì)胞壁受損，300 W時(shí)，花粉解體，同時(shí)染色觀察結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，超聲波強(qiáng)度為200 W時(shí)，花粉仍具有生活力；2007年，WANG等[50]以花粉介導(dǎo)方法把帶有GUS基因和NPTII基因的質(zhì)粒DNA導(dǎo)入高粱雄性不育系A(chǔ)2V4A，經(jīng)GUS活性分析等檢測(cè)，證明獲得了轉(zhuǎn)基因材料；2008年，WANG等[51]將抗草甘膦基因aroA-M1用花粉介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入油菜品種雜71和雜74，經(jīng)PCR，Southern等分子檢測(cè)，證實(shí)獲得了抗草甘膦除草劑的轉(zhuǎn)基因植株；雷海英等[52]采用花粉介導(dǎo)法將玉米矮花葉病毒復(fù)制酶基因NIbT導(dǎo)入玉米自交系金黃96C，金黃96B，478，C649等材料中，獲得了轉(zhuǎn)化植株，田間接種病毒結(jié)果顯示，非轉(zhuǎn)化對(duì)照植株全部為病毒敏感或高敏感材料，而轉(zhuǎn)基因植株多為抗病毒或高抗病毒感染的材料；杜建中等[53]以花粉介導(dǎo)法將水稻幾丁質(zhì)酶基因?qū)胗衩鬃越幌岛?2-1中，獲得了5株轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)其后代株系進(jìn)行抗病鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系植株的抗病性比非轉(zhuǎn)化對(duì)照株系提高1～2級(jí)；2009年，魏玉杰等[54-55]以花粉介導(dǎo)法將蘿卜抗菌肽基因和卡那霉素抗性標(biāo)記基因轉(zhuǎn)入野罌粟花粉并給野罌粟授粉，PCR初步檢測(cè)得到4個(gè)PCR檢測(cè)陽性植株，并發(fā)現(xiàn)110 g/L蔗糖濃度為野罌粟花粉最佳處理介質(zhì)，蔗糖濃度與處理時(shí)間對(duì)處理花粉授粉后的結(jié)實(shí)率影響達(dá)顯著水平，后代植株在田間進(jìn)行卡那霉素涂抹試驗(yàn)，結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果相同，最突出的是野罌粟處理花粉授粉后的結(jié)實(shí)率達(dá)到80%；2010年，任小燕等[56-57]采用花粉介導(dǎo)法把山菠菜膽堿單加氧酶（AhCMO）基因?qū)胗衩鬃越幌掂?8中，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)化植株的第2代進(jìn)行耐鹽性鑒定，發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫濃度為250 mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)基因玉米植株的超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性及葉綠素含量分別比非轉(zhuǎn)基因玉米提高2%～208%，22%～65%和8%～61%，而丙二醛（MDA）含量比非轉(zhuǎn)基因玉米低3%～93%，生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果證明，轉(zhuǎn)化耐鹽基因CMO賦予了轉(zhuǎn)化植株的耐鹽性，轉(zhuǎn)化植株的耐鹽性比對(duì)照提高1～3級(jí)；2011年，韓凱[58]采用花粉介導(dǎo)法將EPSPS基因和谷氨酰胺合成酶基因（GSI）導(dǎo)入玉米玉美頭品種中，獲得了轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化率為4.17%，高于基因槍法的轉(zhuǎn)化率；王秀紅等[59]利用花粉介導(dǎo)法以玉米自交系鄭58、昌7-2和PH6WC為受體，把小麥耐低磷調(diào)控基因TaPHR1和GFP的融合蛋白基因TaPHR1∶∶GFP轉(zhuǎn)入受體中，獲得了轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化效果以鄭58為最佳，收獲種子發(fā)芽做GFP熒光觀察，發(fā)現(xiàn)目的基因已經(jīng)表達(dá)；張婷婷等[60]采用花粉介導(dǎo)法將抗逆性相關(guān)受體類蛋白基因（OsSIK1）轉(zhuǎn)入玉米自交系材料98-2-19、鄭58、昌7-2中，發(fā)現(xiàn)鄭58和昌7-2更適合用作本方法的轉(zhuǎn)化材料，收獲種子播種后取樣PCR檢測(cè)，昌7-2的PCR陽性結(jié)果率高達(dá)74%以上，證明花粉介導(dǎo)法的高效性；林春晶等[61]利用花粉介導(dǎo)法（有改良）將玉米植酸酶基因phy轉(zhuǎn)入玉米品種，經(jīng)PCR和RT-PCR檢測(cè)，證明得到轉(zhuǎn)化植株，目的基因也得到轉(zhuǎn)錄表達(dá)；2012年，宋鑒達(dá)等[62]利用經(jīng)過改良的超聲波處理花粉方法將植酸酶基因phy和bar基因轉(zhuǎn)化到玉米品種鄭單958中，經(jīng)分子檢測(cè)，獲得了轉(zhuǎn)化陽性植株，轉(zhuǎn)化受體中目的基因的表達(dá)和效能正在進(jìn)一步研究；同年，郝曜山等[63]以玉米自交系昌7-2及鄭58為受體，采用花粉介導(dǎo)法將雙價(jià)抗蟲基因BmkIT-Chitinase分別導(dǎo)入受體材料中。對(duì)獲得的T0代1 563粒種子，進(jìn)行卡那霉素初篩，并連續(xù)4代對(duì)轉(zhuǎn)化植株后代株系進(jìn)行分子檢測(cè)，最終獲得20個(gè)轉(zhuǎn)化株系，抗病鑒定獲得16個(gè)抗病株系，農(nóng)藝性狀的調(diào)查結(jié)果證明，轉(zhuǎn)化方法對(duì)受體植株其他農(nóng)藝性狀沒有太大影響；2013年，馬倩倩等[64]以黃花梨花粉為載體，將綠色熒光蛋白基因GFP導(dǎo)入黃花梨植株，獲得了轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化率為3%，通過對(duì)花粉等滲液、超聲波強(qiáng)度等參數(shù)的分析，建立了黃花梨遺傳轉(zhuǎn)化體系。

3 超聲波輔助花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法的優(yōu)缺點(diǎn)

花粉介導(dǎo)法能在植物轉(zhuǎn)基因研發(fā)實(shí)踐中被大量采用，就足顯本方法的適用性?；ǚ劢閷?dǎo)法的優(yōu)勢(shì)為：（1）方法簡單易操作，無需貴重精密儀器設(shè)備，如基因搶、組培間等，而且研發(fā)場(chǎng)地只要符合轉(zhuǎn)基因安全條例規(guī)定即可，所以，操作起來相對(duì)簡單；（2）適用范圍廣，只要是有花植物，理論上都可采用本方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究，不存在單子葉植物還是雙子葉植物之分，解決了一些難以組培再生植物的轉(zhuǎn)化難題；（3）節(jié)省時(shí)間和人力，不需要冗長的組織培養(yǎng)和再生過程，與農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法比較，能省時(shí)、省力；（4）轉(zhuǎn)化效率高，有資料顯示，相對(duì)于其他轉(zhuǎn)化方法（轉(zhuǎn)化率多為3%～5%或稍高），大部分植物采用此法的轉(zhuǎn)化效率都在15%以上；（5）便于常規(guī)育種專家的利用，因?yàn)榉椒ê唵我撞僮鳎Ｒ?guī)育種專家也能現(xiàn)學(xué)現(xiàn)用，有利于植物轉(zhuǎn)化方法的推廣應(yīng)用等。但花粉介導(dǎo)法也有其劣勢(shì)的一面，如轉(zhuǎn)化時(shí)期受植物生長季節(jié)的約束；對(duì)于花粉較少的或不易采取花粉的植物而言，此法有其局限性；如何提高處理花粉授粉后的結(jié)實(shí)率也是本方法需要攻關(guān)的難題等。

總之，花粉介導(dǎo)法的發(fā)明與推廣應(yīng)用業(yè)已產(chǎn)生了很好的效果。SUSAN[65]曾評(píng)論，發(fā)展非組培植物轉(zhuǎn)化方法是所有生物技術(shù)學(xué)家的夢(mèng)想，因?yàn)檫@種方法既能打破植物轉(zhuǎn)化的基因型壁壘，又能廉價(jià)、快速地得到轉(zhuǎn)化植物，所以，這種基因?qū)敕椒ū妒芷诖Ｓ筒?、高粱等作物的成功是谷物花粉轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的一次革新。

［1］MARTON L，WULLEMS GJ，MOLENDIJK L，etal.In vitro transformation of cultured cells from Nicotiana tobacum by Agrobacterium tumefaciens[J].Nature，1979，277：129-131.

［2］KLEINT M，WOLF E D，WUR，etal.Highly-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells[J].Nature，1987，327：70-73.

［3］周光宇.從生物化學(xué)的角度探討遠(yuǎn)緣雜交的理論 [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1978，11（2）：16-20.

［4］KRENS F A，MOLENDIJKL，WULLEMS GJ，etal.In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid [J].Nature，1982，296：72-74.

［5］ DEROLES.Transformation protocols for ornamantal plants[J]. Biotechnology in Agriculture Series，1997，16：10-12.

［6］孫毅，王景雪，崔貴梅.超聲波處理花粉介導(dǎo)植物基因轉(zhuǎn)化方法：中國，ZL99121152.9[P].2006-03-29.

［7］孫毅，崔貴梅，郝曜山，等.超聲波輔助花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法：中國，ZL201110041484.0[P].2012-06-06.

［8］田秀英，石孝均.定位施肥對(duì)小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的影響研究[J].西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003，28（2）：283-288.

［9］MAYER E，COTTABERGER G.Pollen viability in the genus Silene（Caryophyllaceae）and its evaluation by means ofdifferenttestprocedures[J].Flora，2000，195（4）：349-353.

［10］何曉明，謝大森，彭慶務(wù)，等.貯藏溫度和時(shí)間對(duì)節(jié)瓜花粉生活力影響的研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004（1）：21-22.

［11］MARTINEZ GOMEZ P，GRADZIEL T M，ORTEGA E.Low temperature storage of almond pollen[J].The American Society for HorticulturalScience，2002，37（4）：691-692.

［12］孫光玲，汪銀生.煙草花粉儲(chǔ)藏與活力測(cè)定[J].中國煙草，1994（1）：20-22.

［13］劉存宏，李華.蘋果花粉儲(chǔ)藏實(shí)驗(yàn)[J].山西果樹，1997（4）：7.

［14］任轉(zhuǎn)灘，洪德峰，馬毅.低溫環(huán)境下玉米花粉生活力保持時(shí)間的研究[J].玉米科學(xué)，2008，16（4）：199-200.

［15］李要民，陳良碧.不同溫度條件下儲(chǔ)藏的3種禾本科植物花粉活力變化[J].植物生理學(xué)通訊，1998，34（1）：35-37.

［16］KNOWLTON H E.Studies in pollen with special reference to longevity[M].New York：CornellUniversity，1922：747-749.

［17］VISSER T.Germination and storage of pollen[J].Meded LandbouwhogeschoolWageningen，1955，55（1）：1-68.

［18］WANGZR，ZHAOK，ZHANGYM，etal.Effects oflow temperature and ultra-low temperature on pollen viability oftomato（Lycopersicon esculentum Mill.）[J].Agricultural Science and Technology，2014，15（9）：1534-1537.

［19］BARROW J R.Comparisons among pollen viability measurement methods in cotton[J].Crop Science，1983，23（4）：734-736.

［20］劉自剛.不同脫水處理對(duì)桔梗花粉離體萌發(fā)及貯藏性能的影響[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2011，12（4）：651-656.

［21］王霞，高樹仁，孫麗芳.不同溶液EMS試劑處理花粉對(duì)玉米結(jié)實(shí)率的影響[J].種子，2015，34（9）：80-82.

［22］呂仲賢，楊樟法，胡萃.玉米花粉對(duì)螟長距繭蜂成蟲壽命的影響[J].華東昆蟲學(xué)報(bào)，1995，4（2）：61-64．

［23］曹敏建，孫國娟.玉米高產(chǎn)栽培的鉀素生理作用[J].玉米科學(xué)，1998，6（1）：66-68．

［24］劉雪蓮，李慶玲，秦佳梅，等.不同培養(yǎng)基對(duì)紫丁香花粉離體萌發(fā)的影響[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，38（7）：61-63.

［25］RIHOVA L，HRABETOVA L，TUPY J.Optimization of conditions forin vitro pollen germination and tube growth in potatoes[J].InternationalJournalofPlantScience，1996，157（5）：561-566.

［26］張立磊，李桂榮，婁騰雪，等.不同處理對(duì)“豐花月季”花粉生活力的影響[J].北方園藝，2015（16）：72-75.

［27］ZHAO J，YU F L，LIANG S P，etal.Changes ofcalcium distribution in egg cells，zygotes and two celled proembryos of rice（Oryza sativa L.）[J].SexualPlantReproduction，2002，14（6）：331-337.

［28］岳新麗，曹秋芬，季蘭，等.葡萄花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因超聲波處理參數(shù)的選擇[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2006，21（1）：10-13.

［29］胡雪嬌，陳永浩，郝艷賓，等.溫差-超聲波復(fù)合法對(duì)核桃花粉破壁率的影響[J].食品科技，2015，40（8）：50-53.

［30］崔貴梅，孫毅，郝曜山，等.玉米花粉體外萌發(fā)方法改進(jìn)及其對(duì)花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的作用[J].植物學(xué)報(bào)，2012，47（2）：155-161.

［31］HESLOP-HARRISON J.Aspects of the structure，cytochemistry and germination ofthe pollen ofrye[J].Ann Bot，1979，44（S1）：1-47.

［32］O'DRISCOLL D，HANNC，READS M，etal.Endocytotic uptake of fluorescentdextrans by pollen tubes grown in vitro[J].Protoplasma，1993，175（3）：126-130.

［33］HESLOP-HARRISON J，HESLOP-HARRISON Y.Some permeability properties ofangiosperm pollen grains，pollen tube and generative cell[J].Sex PlantReprod，1988，1（2）：65-73.

［34］KRANZ E，L?RZ H.Micromanipulation and in vitro fertilization with single pollen grains of maize[J].Sex Plant Reprod，1990，3（3）：160-169.

［35］ LANGRIDGE P，BRETTSCHNEIDER R，LAZZERI P，et al. Transformation of cereals via Agrobacterium and the pollen tube pathway：a criticalassessment[J].PlantJ，1992，2（4）：631-638.

［36］ATLAGICJ.Pollen fertility in some Helianthus L.species and their F1hybrids with the cultivated sunflower[J].Hella，1990，13（13）：41-47.

［37］LEONNE M VAN DER LEEDE-PLEGT，BERNADETTE C E VAN DE VEN，et al.Development of a pollen mediated transformation method for Nicotiana glutinosa[J].Transgenic Research，1995，4（2）：77-86.

［38］DENG DEWANG.Advance in pollen-mediated transformation[J]. Developmentand Reproductive Biology，1996，6（2）：120-125.

［39］李娜，孫毅，楊利艷.基于GFP觀察的花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法的細(xì)胞學(xué)研究[J].植物學(xué)報(bào)，2013，48（6）：616-622.

［40］王景雪，孫毅，胡晶晶，等.花粉介導(dǎo)法獲得玉米轉(zhuǎn)基因植株[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1999，21（S3）：83.

［41］王景雪，孫毅，崔貴梅，等.花粉介導(dǎo)法獲得玉米轉(zhuǎn)基因植株[J].植物學(xué)報(bào)（英文版），2001，43（3）：275-279.

［42］梁雪蓮.農(nóng)桿菌組培及三種非組培法在小麥和玉米上轉(zhuǎn)化外源bar基因研究[D].太谷：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002：47-62.

［43］梁雪蓮，郭平毅，孫毅，等.玉米3種非組培轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)化外源bar基因研究[J].作物學(xué)報(bào)，2005，31（12）：1648-1653.

［44］陳定虎.美洲商陸抗病毒蛋白基因克隆、表達(dá)和遺傳轉(zhuǎn)化研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2002：74-80.

［45］解志紅.花粉介導(dǎo)的幾丁質(zhì)酶基因及gus基因?qū)γ藁ㄟz傳轉(zhuǎn)化的研究[D].太谷：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002：15-28.

［46］王節(jié)之，郝曉芬，鄭向陽，等.谷子花粉介導(dǎo)法轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因的研究[J].生物技術(shù)，2004，14（5）：5-6.

［47］杜春芳.花粉介導(dǎo)法在油菜轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用研究 [D].太谷：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004：16-34.

［48］杜春芳，劉惠民，李朋波，等.花粉介導(dǎo)法獲得油菜轉(zhuǎn)基因植株研究[J].作物學(xué)報(bào)，2006，32（5）：749-754.

［49］梁雪蓮，鄭奕雄，莊東宏，等.花生CpTI基因轉(zhuǎn)化——花粉介導(dǎo)法[J].花生學(xué)報(bào)，2006，35（4）：1-5.

［50］WANG W Q，WANG J X，YANG C P，et al.Pollen-mediated transformation of Sorghum bicolor plants[J].Biotechnol Appl Biochem，2007，48（2）：79-83.

［51］WANG J X，LI Y H，LIANG C.Recovery of transgenic plants by pollen-mediated transformation in Brassica juncea[J].Transgenic Rep，2008，17（3）：417-424.

［52］雷海英，孫毅，王志軍，等.病毒復(fù)制酶基因介導(dǎo)玉米抗矮花葉病的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，23（5）：114-117.

［53］杜建中，孫毅，王景雪，等.基于花粉介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化的玉米自交系抗病植株的獲得[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24（5）：79-82.

［54］魏玉杰，張梅秀，常英，等.野罌粟花粉介導(dǎo)法轉(zhuǎn)蘿卜抗菌肽基因方法研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)科技，2009（11）：6-7.

［55］魏玉杰，張全文，何慶祥.花粉介導(dǎo)法將蘿卜抗菌肽基因?qū)胍袄浰诘挠绊懸蛩匮芯?[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（15）：32-37.

［56］任小燕.花粉介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)耐鹽基因AhCMO玉米植株的研究[D].太原：山西大學(xué)，2010：24-47.

［57］任小燕，杜建中，孫毅.轉(zhuǎn)AhCMO基因玉米后代的獲得及耐鹽性鑒定[J].分子植物育種，2013，11（3）：332-338.

［58］韓凱.超聲波輔助細(xì)胞穿透多肽介導(dǎo)的花粉遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2011：30-41.

［59］王秀紅，白建榮，孫毅，等.花粉介導(dǎo)法將TaPHR1∶∶GFP融合蛋白基因?qū)胗衩?[J].西北植物學(xué)報(bào)，2011，31（9）：1732-1737.

［60］張婷婷，王銘，杜建中，等.花粉介導(dǎo)法將水稻OsSIK1基因?qū)胗衩鬃越幌档难芯?[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（5）：395-399.

［61］林春晶，韋正乙，宋鑒達(dá)，等.利用超聲波處理花粉轉(zhuǎn)化法獲得玉米轉(zhuǎn)基因新材料 [C]//中國作物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集.北京：中國作物學(xué)會(huì)，2011：56.

［62］宋鑒達(dá)，林春晶，韋正乙，等.利用超聲波處理花粉轉(zhuǎn)化法獲得玉米轉(zhuǎn)基因新材料[J].玉米科學(xué)，2012，20（2）：48-51，55.

［63］郝曜山，孫毅，杜建中，等.轉(zhuǎn)雙價(jià)抗蟲基因BmkIT-Chitinase玉米株系的獲得[J].分子植物育種，2012，10（2）：147-154.

［64］馬倩倩，宋躍，孫毅，等.超聲波處理花粉介導(dǎo)黃花梨遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].果樹學(xué)報(bào)，2013，30（4）：537-542.

［65］SUSANEAPEN.Pollen grains as a targetfor introduction offoreign genes into plants：an assessment[J].Physiol Mol Biol Plants，2011，17（1）：1-8.

Research Progress of the Ultrasonic Assisted Pollen-mediated Transgene Method

WANGChangbiao，DUJianzhong，ZHAOXinghua，LIUJiang，HAOYaoshan，ZHANGHuanhuan，HANBin，SUNYi

（Research CenterofBiotechnology，ShanxiAcademy ofAgriculturalSciences，Taiyuan 030031，China）

Ultrasonic assisted pollen-mediated planttransgene method is a planttransformation means with domestic independent intellectualproperty rights.Ithas made some positive progress during using to transfer maize,rape,peanut plants and other crops.To understand status quo ofthis means used in planttransformation research athome and abroad in more detail,and its possible application prospect,to knowmore aboutthe application status and research progress ofthe method，this papermakes a briefsummary ofthe research on this method at home and abroad,hoping to provide some reference for the related researchers,and to provide the basis for future improving the method.

plant;pollen-mediated;ultrasonic wave;transformation method;progress

Q943.2

：A

：1002-2481（2017）09-1571-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.09.41

2017-07-31

山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（201603D221025-2）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種業(yè)發(fā)展專項(xiàng)（2016ZYZX50）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（YGG1624）；國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2014ZX08003001-002-003，2016ZX08003001-002-003）

王長彪（1975-），男，山西祁縣人，助理研究員，碩士，主要從事分子育種研究工作。孫 毅為通信作者。