多維液相色譜及其在活性肽分離純化研究中的應(yīng)用進(jìn)展

于志鵬,樊 玥,趙文竹,*,張 倩,丁 龍,劉 婧,勵建榮,*,劉靜波

(1.渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院,遼寧錦州 121013;2.吉林大學(xué)營養(yǎng)與功能食品研究室,吉林長春 130062;3.吉林(市)出入境檢驗檢疫局,吉林吉林 132013)

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多維液相色譜及其在活性肽分離純化研究中的應(yīng)用進(jìn)展

于志鵬1,樊 玥1,趙文竹1,*,張 倩1,丁 龍2,劉 婧3,勵建榮1,*,劉靜波2

(1.渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院,遼寧錦州 121013;2.吉林大學(xué)營養(yǎng)與功能食品研究室,吉林長春 130062;3.吉林(市)出入境檢驗檢疫局,吉林吉林 132013)

多維液相色譜分離技術(shù)以其高峰容量和高通量等優(yōu)勢成為活性肽分離純化研究的重要技術(shù),本文主要介紹了多維液相色譜分離技術(shù)的組合模式及其在混合物活性肽分離純化中的應(yīng)用,并對多維液相色譜技術(shù)在活性肽中的應(yīng)用前景進(jìn)行展望,旨在為從復(fù)雜體系中高效分離目標(biāo)活性肽提供參考。

多維液相色譜,分離純化,活性肽

蛋白質(zhì)是食品研究領(lǐng)域的重要組成部分,在體內(nèi)消化蛋白酶和體外工具酶的作用下,水解生成具有多種生理功能的活性肽。1986年,Jo C等以發(fā)現(xiàn)肽類生長因子而獲得諾貝爾生理學(xué)獎,生物活性肽逐漸發(fā)展成為獨立的專業(yè),涉及多個前沿學(xué)科[1]。至此,研究也不再局限于食物來源的蛋白質(zhì),活性肽逐漸成為研究的焦點[2-3]。目前可以通過體外酶解的手段從動物和植物中制備、分離純化具有類嗎啡樣活性、提高免疫和調(diào)節(jié)激素等功能的生物活性肽[4]。從這些酶解后形成的復(fù)雜線性、環(huán)形結(jié)構(gòu)的不同肽類中獲得所需組分,傳統(tǒng)的單一色譜分離技術(shù)存在諸多不足[5]:反相色譜(Reversed Phase Chromatography,RPC)中短鏈烷基和長鏈烷基反相填料在樣品的活性回收上有區(qū)別,烷基鏈越長,固定相疏水性越強(qiáng),因而為使樣品較快洗脫下來,需要增加流動相的有機(jī)成分,但過強(qiáng)的疏水性和過多的有機(jī)溶劑會導(dǎo)致樣品的不可逆吸附和生物活性的損失[6];體積排阻色譜(Size Exclusion Chromatography,SEC)又稱空間排阻色譜法,分為使用水溶劑的凝膠過濾色譜(GFC)和使用有機(jī)溶劑的凝膠滲透色譜(GPC),一般只用于原料液的初分離,僅獲得幾個分子量級組分,特別適用于對未知樣品的探索分離,多肽常用水溶液的凝膠過濾色譜分析;離子色譜法(Ion Chromatography,IC)中離子交換色譜(IEC)、離子排斥色譜(ICE)和流動離子色譜(MPIC)的分離機(jī)理各不相同,所適用的待測組分也各不相同,均存在局限性,所以需綜合利用多維色譜的優(yōu)化組合聯(lián)用方式進(jìn)行分離純化,更利于復(fù)雜樣品的分離。

1 多維液相色譜簡介

多維液相色譜(multidimensional liquid chromatography,MDLC)是將同種色譜不同選擇性分離柱或不同類型色譜分離技術(shù)組合,構(gòu)成聯(lián)用系統(tǒng),從而實現(xiàn)復(fù)雜樣品充分分離的一種技術(shù)。MDLC因其將兩種或兩種以上具有不同分離原理的液相色譜優(yōu)化組合的特性,成為活性肽的重要分離方法[7]。通過選擇適當(dāng)?shù)慕涌?實現(xiàn)對多種具有不同分離機(jī)理的高效液相色譜(HPLC),包括親水作用色譜(HILIC)、反相液相色譜(RPLC)、體積排阻色譜(SEC)、強(qiáng)陽離子交換色譜(SCX)、強(qiáng)陰離子交換色譜(SAX)等的耦聯(lián)?；旌想亩蔚姆蛛x原理是相互作用與影響的結(jié)果,樣品間物理化學(xué)性質(zhì)上有很大的區(qū)別,按照各個組分性質(zhì)上的差異進(jìn)行組分分離,其中樣品組分的性質(zhì)差別包括:相對分子量、分子大小、等電點、疏水性等,分離方法不止選擇一種性質(zhì)[8]。

Giddings在1984年首次提出了多維色譜分離的概念。根據(jù)Gidiing[9]等建立的數(shù)學(xué)模型,MDLC分離系統(tǒng)中的每一維都應(yīng)該是正交的,具有獨立的分離原理。MDLC的總峰容量(N)應(yīng)為包含的各單維分離模式峰容量(Ni)的乘積,即N=N1×N2×N3×…。從理論可知,MDLC分離系統(tǒng)的峰容量比一維色譜更高,適用于復(fù)雜樣品,其組合必須滿足兩點[10]:各維色譜分離應(yīng)具有完全不同的分離機(jī)制;高維的分離速度應(yīng)快于低維的分離速度。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的聯(lián)用技術(shù)能有效分離高復(fù)雜程度的樣品,最廣泛使用的方法是離子交換色譜(IEX)和反相色譜(RP)的二維結(jié)合,用于肽段和蛋白質(zhì)混合物的預(yù)分離,極大提高復(fù)雜樣品的鑒定能力[11]。

Yates[12]首次提出了將強(qiáng)陽離子交換(strong cation exchange,SCX)色譜-反相色譜這種二維分離系統(tǒng)和質(zhì)譜耦聯(lián),成為蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)(multi-dimensional protein identification technology,MudPIT)的高自動化分析方法。在商業(yè)化的二維液相色譜分離系統(tǒng)中,大多數(shù)采用自動化技術(shù)發(fā)展成熟的強(qiáng)陽離子交換-反相色譜串聯(lián)的系統(tǒng),除了SCX色譜常擔(dān)任第一維分離之外,其他幾種不同原理的色譜類型也能隨著待研究樣品的特性被選擇為第一維分離。例如,肽段在發(fā)生磷酸化或糖基化修飾之后,親水性增強(qiáng),電性變化,可以使用親水作用色譜(hydrophilic interaction chromatography,HILIC)[13-14]或陰離子交換色譜(anion exchange,AX)分離[15]。

在線二維液相色譜的核心是二維液相色譜將經(jīng)過第一維分離的樣品組分有效地轉(zhuǎn)移到第二維中,根據(jù)一維洗脫產(chǎn)物的轉(zhuǎn)移方式可分為直接轉(zhuǎn)移(directly coupled -column)和間接轉(zhuǎn)移(column -switching)。直接轉(zhuǎn)移模式通用性差,選擇性和峰容量不高,其應(yīng)用僅限于SCX色譜和RPLC聯(lián)用;二維液相色譜更多采用間接轉(zhuǎn)移模式,通過一個特殊接口將第一維色譜柱和第二維色譜柱連接,接口收集第一維的洗脫產(chǎn)物,并將其轉(zhuǎn)移到第二維。同直接轉(zhuǎn)移模式二維液相色譜相比,間接轉(zhuǎn)移模式二維液相色譜的通用性強(qiáng),使用靈活,是二維液相色譜的主流技術(shù)[16]?；诙S液相色譜的理念,為了得到更高分離度樣品,近年來衍生出了分離能力更強(qiáng)的三維液相色譜分離系統(tǒng),并已在肽組學(xué)研究中得到了應(yīng)用[17]。

2 多維液相色譜組合模式

多維液相色譜在實際研究中雖然高效,但并沒有明確數(shù)據(jù)表明哪些色譜技術(shù)聯(lián)用更適合某種活性肽分離,研究者都是根據(jù)自己所要分離的活性肽的實際情況來判斷適合的多維色譜技術(shù),以便高效快速的分離純化目標(biāo)活性肽。國內(nèi)外的學(xué)者使用的多維液相色譜聯(lián)用組合形式各異,主要對幾種典型多維色譜方法進(jìn)行介紹。

2.1 2D-HILIC-RPLC分離系統(tǒng)

親水色譜(Hydrophilic interactions chromatography,HILIC)是常用于生物大分子的色譜分離技術(shù),基于目標(biāo)分子與配基間有特異性,將其中一種結(jié)合在介質(zhì)上作為配基制成親和柱,含有可結(jié)合配基的物質(zhì)通過親和柱時被吸附保留在柱上,再用洗脫液洗脫下來,達(dá)到分離純化目的,其流動相使用的梯度與反相色譜模式(RPLC)相反,對反相液相色譜中難以保留的化合物進(jìn)行有效分離。在蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究中,磷酸化肽段和糖基化肽段較非修飾肽段具有更好的親水性,HILIC-HPLC聯(lián)用系統(tǒng)適用于翻譯后修飾蛋白質(zhì)組的分子樣品的分析[18],越來越多研究者將HILIC-RPLC聯(lián)用的模式用于活性肽的分離分析。Wang[19]等將TSK-GEL Amide-80和Acquity BEH C18柱聯(lián)用,構(gòu)建HILIC-HPLC二維液相色譜系統(tǒng)分離人參三萜皂苷類物質(zhì),峰容量為747,正交性達(dá)到56.6%,且在二維聯(lián)用系統(tǒng)中檢測到257個質(zhì)譜峰,是一維色譜的1.85倍,峰容量和正交性都優(yōu)于一維HILIC或HPLC的結(jié)果。

2.2 體積排阻色譜-反相分離系統(tǒng)

體積排阻色譜法是根據(jù)凝膠孔隙的孔徑大小與樣品分子尺寸的相對關(guān)系而對溶質(zhì)進(jìn)行分離,體積排阻色譜-反相分離聯(lián)用系統(tǒng)具有良好的正交性。Pan[20]等從條滸苔蛋白中提取ACE抑制肽,通過凝膠過濾色譜-半制備反相高效液相色譜聯(lián)用技術(shù),用HPLC-Q-TOF-MS鑒定活性肽序列,得到肽段PAFG,IC50值為35.9 μmol/L。Hu等[21]將強(qiáng)陽離子/體積排阻混合模式與納升級反相色譜-質(zhì)譜離線聯(lián)用,在人血清蛋白樣品中鑒定出1286種蛋白質(zhì)。Wu[22]等用堿性蛋白酶酶解甜高粱蛋白制備ACE抑制肽,通過離子交換色譜-凝膠過濾色譜-反相高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)得到氨基酸序列為TLS的肽段,IC50值為102.1 μmol/L。

2.3 二維反相-反相分離系統(tǒng)

反相色譜對混合物的分辨力、重現(xiàn)性都比較好[23],但在鳥槍法中只用一維的反相色譜也是有限的,通過二維反相-反相色譜聯(lián)用技術(shù),極大改善了一維的局限性,且流動相與質(zhì)譜檢測條件兼容性良好。Dowell等[24]研究人員以大腸桿菌提取蛋白質(zhì)來對比多維色譜分離模式,結(jié)果表明二維反相-反相色譜分離系統(tǒng)效果最好,鑒定出266種蛋白質(zhì)。二維液相色譜分離系統(tǒng)(Tow dimensional liquid chromatography,2DLC)結(jié)合了不同原理的兩種HPLC類型,先后對肽段混合物進(jìn)行2次分離,最常用的2DLC是離子交換色譜-反相色譜的二維串聯(lián)。Forghani[25]等從刺身中分離ACE抑制肽,通過RP-HPLC和等電位點分餾聯(lián)用系統(tǒng),并使用LC ESI-Q-TOF MS/MS鑒定肽序列,最終得到三段序列分別為EVSQGRP,CRQNTLGHNTQTSIAQ和VSRHFASYAN,其ACE抑制活性的IC50值分別為0.05、0.08、0.21 mmol/L。

2.4 強(qiáng)陽離子交換-反相聯(lián)用

離子交換色譜用于肽的分離主要是基于帶電分析物與帶電固定相之間的庫侖力相互作用[26-27],通過改變洗脫液的pH來中和或者轉(zhuǎn)換分析物或固定相的電性,主要為陽離子交換(CX)和陰離子交換(AX)。自陽離子交換材料被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用在肽段分離后[28-29],也嘗試把陽離子交換的步驟應(yīng)用于二維肽段分離[30]。離子交換-反相聯(lián)用成為活性肽多維分離最常用的方法。在強(qiáng)陽離子交換色譜中的官能團(tuán)強(qiáng)酸能使pH作用范圍增大。強(qiáng)陽離子分離主要是根據(jù)電荷,而反相液相色譜是根據(jù)疏水性,所以強(qiáng)陽離子交換-反相的二維技術(shù)具有高正交性,將強(qiáng)陽離子交換作為第一維度,反相液相色譜因其良好的兼容性作為第二維度[31]。

2.5 三維色譜分離

為了對更復(fù)雜樣品或者達(dá)到純化水平的樣品,在現(xiàn)有的二維色譜之前,再增加一個分離手段能提高整體樣品的純度,通常三維分離手段可以分為基于肽段分離的三維平臺與基于蛋白質(zhì)分離的三維平臺。Wei等[33]使用了基于肽段分離的三維平臺,第一維和第三維是反相色譜,第二維使用分布鹽梯度通過離子交換色譜,通過反相液相色譜-離子交換-反相液相色譜的三維分離毛細(xì)管柱,分離鑒定酵母得到3019種蛋白質(zhì)。劉俊彥[33]以正常人肝樣品作為研究對象,建立了SEC-SCX-RPLC-MS/MS三維色譜分離質(zhì)譜鑒定平臺,使用體積排阻作為預(yù)分離模式,在體積排阻分離中對樣品分別進(jìn)行了蛋白水平預(yù)分離和肽水平預(yù)分離,結(jié)果表明蛋白水平預(yù)分離更有效。Alan[34]等利用凝膠滲透色譜-反相色譜-超高效液相色譜-二級質(zhì)譜(GP-HPLC-RP-HPLC-UPLC-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)從啤酒粕酶解物中分離純化ACE抑制肽,從12個合成肽段中,篩選出兩個潛在ACE活性最高的肽段IVY和ILDL,IC50值分別為(80.4±11.9)、(96.4±8.36) μmol/L。

2.6 多維色譜陣列系統(tǒng)

多維液相色譜陣列技術(shù)是通過在第二維分離中采用多根并行色譜同時進(jìn)行分離的方式,陣列系統(tǒng)能縮短整個多維系統(tǒng)的分離時間,來實現(xiàn)復(fù)雜樣品的高通量分離分析。Wagner等[35]采用離子交換-反相色譜分離,其中第二維用并行的兩根反相液相色譜柱構(gòu)建。劉俊彥[33]采用離子交換-反相色譜分離,其中第一維是離子交換系統(tǒng),第二維用18根平行的反相色譜柱構(gòu)建,以肝癌組織為研究對象,鑒定出1202種蛋白質(zhì),時間由傳統(tǒng)分離手段54 h縮短至3 h,分離通量提高8倍。

2.7 其他

高明霞[36]等通過對比“top-down”與“bottom-up”式的多維液相色譜技術(shù)路線,通過自行設(shè)計搭建的陣列式的多維高效液相色譜平臺,兼容了液相色譜和“top-down”技術(shù)保留蛋白質(zhì)分子信息的優(yōu)勢,克服系統(tǒng)通量問題,擁有更多的通道,能在線富集分離,實現(xiàn)高通量分離和高通量檢測相結(jié)合,為肽組學(xué)的分析檢測提供了新的思路。Roseanne[37]利用脯氨酰基內(nèi)切蛋白酶酶解牛中αs-酪蛋獲得ACE抑制肽,將獲的高活性生物活性肽通過UPLC-ESI-MS和MS/MS聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析得出,黑曲霉脯氨?；鶅?nèi)蛋白酶酶解物在C末端更容易分裂氨基酸Pro,而黑曲霉脯氨酰基內(nèi)蛋白酶在C末端更有能力分裂氨基酸Ala,Leu,Arg和His。

3 多維液相色譜在活性肽分離純化中的應(yīng)用

生物活性肽是氨基酸以不同組成和排列方式構(gòu)成的,從二肽到復(fù)雜的線性、環(huán)型結(jié)構(gòu)的不同肽類的總稱,肽分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間,是最易于人體吸收的物質(zhì)[38-39]。獲得高純度的生物活性肽是后續(xù)結(jié)構(gòu)鑒定及功能評價的基礎(chǔ),因此活性肽的色譜純化一直是本領(lǐng)域的研究難點和焦點之一。Rao[40]等利用超高效液相色譜和質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)聯(lián)用對已分離的雞蛋清溶菌酶酶解液組分進(jìn)行分離純化得到ACE抑制肽,鑒定其氨基酸序列為RGY,MKR,VAW三條肽段,其中RGY作為基底,MKR,VAM具有真正的ACE抑制活性。Puchalska[41]等采用高效液相色譜-電噴霧四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(HPLC-ESI-Q-ToF),分離得到三種玉米抗高血壓肽LSP,LQP和LRP,離子的質(zhì)荷比分別為316.1867,357.2132和385.2558。Zhao[42]等利用離子交換層析-薄層色譜-高效液相色譜聯(lián)用得到抗菌活性肽BL-A60,氨基酸序列為LYKLVKVVLNM,膽堿連接在N末端,細(xì)交鏈孢菌酮酸修飾C末端,樣品在HiTrap SP HP柱(5 mL)系統(tǒng),用緩沖液A(25 mmol/L MES-NaOH,pH6.2)清洗,0～1 mol/L NaCl線性洗脫,高活性組分在二氧化硅基底TLC(薄層色譜)盤上為用異丙醇∶正丁基∶氨水∶水(60∶20∶10∶20),所得樣品經(jīng)C18反相制備柱純化并經(jīng)餾分收集器收集,而后經(jīng)Triple TOF 5600 TOFMS檢測,掃描范圍250～2000 m/z。Sun[43]等利用離子交換層析-凝膠過濾層析-反相高效液相色譜聯(lián)用得到一種分子量為592.26 Da的抗氧化六肽LSGYGP,該肽段的羥自由基清除活性IC50值為22.47 μg/mL,Zhang[44]等通過凝膠過濾層析-離子交換層析-反相高效液相色譜分離從羅非魚皮明膠抗氧化肽,經(jīng)nano-LC-ESI質(zhì)譜鑒定得到兩個抗氧化肽氨基酸序列EGL和YGDEY,這兩個肽段的羥自由基清除活性IC50值分別為4.61、6.45 μg/mL。

多維液相色譜技術(shù)在活性肽的分離純化中應(yīng)用越來越廣泛,其組合體系無論在鑒定樣品數(shù)量上還是可信程度上都優(yōu)于單一色譜技術(shù),可作為復(fù)雜樣品活性肽制備過程中的重點選擇方法和手段。

4 展望

生物活性肽的生理生化特性研究逐漸深入,但蛋白酶解液中活性肽組分復(fù)雜,并且不同來源的生物活性肽所用的分離純化方法各有異同。多維液相色譜在生物活性肽的分離純化中綜合各種分離手段的優(yōu)缺點,彌補(bǔ)單一分離手段的不足。聯(lián)用技術(shù)雖然能夠改善單一色譜技術(shù)的缺點,但是也不能完全消除樣品制備過程中所帶來的誤差,需要通過不斷地探索和實踐來改善現(xiàn)有技術(shù)的缺點,不斷組合創(chuàng)新以期減小誤差。多維液相色譜還處于發(fā)展階段,如何高效、快速、準(zhǔn)確的分離純化生物活性肽,還面臨著巨大的挑戰(zhàn)。多維液相色譜在食源性活性肽的研究將主要集中在:探索在經(jīng)典的二維液相色譜分離的基礎(chǔ)上增加一維肽水平的預(yù)分離,建立肽段水平上的三維液相色譜分離系統(tǒng),實現(xiàn)有效提高活性肽分離程度和提升鑒定數(shù)量和可信度的分離目的;建立基于反相色譜、體積排阻色譜和離子交換色譜的蛋白預(yù)分離色譜的多維液相色譜分離體系,協(xié)同基于肽段水平的三維液相色譜分離手段增加活性肽鑒定的深度;綜合利用定向酶切、肽質(zhì)量分析及數(shù)據(jù)庫分析等手段,主要通過LC-ESI-TOF-MS以及Mascot database search等蛋白質(zhì)組學(xué)工具對活性肽的多維色譜純化組分進(jìn)行表征,構(gòu)建肽質(zhì)量指紋圖譜。

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Recent advances of bioactive peptides separation by multidimensional liquid chromatography for proteome analysis

YU Zhi-peng1,FAN Yue1,ZHAO Wen-zhu1,*,ZHANG Qian1, DING Long2,LIU Jing3,LI Jian-rong1,*,LIU Jing-bo2

(1.College of Chemistry,Chemical Engineering and Food Safety,Bohai University,Jinzhou 121013,China; 2.Lab of Nutrition and Functional Food,Jilin University,Changchun 130062,China; 3.Ji Lin(City)Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Jilin 132013,China)

Multidimensional liquid chromatography plays an important role in bioactive peptides with peak capacity and high flux,becoming one of the most interesting fields of peptides purification. The review mainly focused on the combination model of multidimensional liquid chromatography separation technology and its application in the separation of bioactive peptides,aimed to build the efficient separation methods of bioactive peptides,and prospects for application of multidimensional liquid chromatography in bioactive peptides were addressed,in order to build the efficient separation methods of bioactive peptides.

multidimensional liquid chromatography;purification;bioactive peptides

2016-11-01

于志鵬(1984-)，男，博士，講師，研究方向：蛋白質(zhì)及活性肽的功能研究與產(chǎn)品開發(fā)，E-mail：yuzhipeng20086@sina.com。

*通訊作者:趙文竹(1986-)，女，博士，講師，研究方向：果蔬加工，E-mail：zhaowenzhu777@163.com。 勵建榮(1964-)，男，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)品加工，E-mail：lijr6491@163.com。

國家自然科學(xué)基金青年項目(31601479)；遼寧省科學(xué)事業(yè)公益研究基金項目(2016004004);渤海大學(xué)博士啟動項目(0515bs079)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)11-0369-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.063