林木組培快繁技術(shù)中常見問題及對策

陳罡

(遼寧省林業(yè)科學(xué)研究院，遼寧 沈陽 110032)

林木組培快繁技術(shù)中常見問題及對策

陳罡

(遼寧省林業(yè)科學(xué)研究院，遼寧 沈陽 110032)

針對林木組培快繁過程中經(jīng)常出現(xiàn)的污染、褐化及玻璃化問題的產(chǎn)生原因和控制措施進行了綜述，為今后林木組培快繁研究提供技術(shù)參考，同時也為開展新品種苗木組培的科研和生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)和實踐指導(dǎo)。

林木；組織培養(yǎng)；污染；褐化；玻璃化

植物組培快繁技術(shù)是在植物細胞具有全能性的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的無性繁殖技術(shù)，該技術(shù)已有100多年的歷史，至今已日趨成熟[1]。其技術(shù)核心是通過無菌操作，將從植物體中分離出所需的細胞、組織、器官等在人工控制條件下進行培養(yǎng)并獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟價值產(chǎn)品的現(xiàn)代生物技術(shù)。目前，已在花卉、蔬菜、作物、經(jīng)濟植物及珍稀植物中的科研和生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，也是植物轉(zhuǎn)基因、遺傳育種、脫毒培養(yǎng)及種質(zhì)資源保護等研究中的重要技術(shù)手段。由于組培快繁技術(shù)不受地域、氣候等條件限制，一旦獲得植物材料便可進行繁殖等優(yōu)點，對于生長周期長，某些有性繁殖困難以及扦插成活率低的林木來說，更是具有巨大的應(yīng)用價值，目前已有200多種木本植物開展了組織培養(yǎng)、體細胞培養(yǎng)及工廠化育苗等研究。在進行林木組培快繁工作時，由于操作不當、林木一些自身生理特性及外界環(huán)境條件等原因，常會遇到污染、褐化和玻璃化等一系列難題，影響植物材料的正常發(fā)育，嚴重時，會給科研和生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失。因此，了解這些問題產(chǎn)生的原因、影響因素及解決方法，不僅可以節(jié)省技術(shù)成本，更是提高林木組織培養(yǎng)成功率的關(guān)鍵，同時為今后開展組培快繁新技術(shù)提供參考。

1 污染及對策

微生物污染問題始終出現(xiàn)并貫穿整個組培過程，如何避免和降低污染率是植物組培快繁技術(shù)的首要難題。微生物污染主要分為接種前污染、接種中污染和接種后污染3個階段。接種前污染即前期準備階段，主要由培養(yǎng)基、接種工具、接種環(huán)境滅菌和消毒不徹底引起的[2]；接種中污染即無菌操作階段，主要由超凈工作臺濾除菌超標、外植體消毒處理不當、無菌操作不規(guī)范造成操作過程中有交叉污染等引起的[3]；接種后污染即培養(yǎng)階段，主要由培養(yǎng)環(huán)境不潔凈以及由真菌和細菌引起的內(nèi)源菌污染等[4]。

對于避免接種前污染，要做到定期對接種環(huán)境進行通風(fēng)換氣和消毒，紫外線照射消毒，75%酒精噴霧消毒，培養(yǎng)基及接種器具力求徹底高壓滅菌消毒，培養(yǎng)基即配即用，對于剩余放置超過一周的培養(yǎng)基和器皿再次使用要進行二次消毒，避免非工作人員進出接種室，每次接種前要對超凈工作臺面和接種室進行紫外燈滅菌30 min。對于預(yù)防接種中污染，主要是外植體合理的選擇和適宜的處理[5]。首先要根據(jù)不同材料選擇合適的外植體，再根據(jù)外植體選擇與其相適宜的消毒劑和消毒方法，如一般常選用的消毒劑有乙醇、氯化汞、次氯酸鈉、過氧化氫等，先根據(jù)每種消毒劑的特性，對消毒劑濃度和時間進行預(yù)試驗后再確定最佳消毒體系，如有需要，也可以將消毒劑進行組合使用。

木本植物木質(zhì)化程度高，盡量避免選取木質(zhì)化莖，而選取胚、幼嫩莖尖、當年新生枝條等為外植體，選取原則是污染少。如有條件，最好是能夠?qū)⒅参锘蛑l在室內(nèi)培養(yǎng)一段時間后再取。針對不同外植體選擇不同消毒劑類型、濃度和消毒時間，初次接種時，要根據(jù)不同植物品種對其進行試驗摸索，既能將消毒率達到最高，又對外植體的傷害降到最低。接種過程中操作人員要嚴格按照實驗室無菌操作流程進行，工具用一次消毒一次，培養(yǎng)器皿瓶口用70%酒精擦拭后在開蓋，以避免交叉污染。此外，要對超凈工作臺潔凈等級和工作狀態(tài)進行定期檢查。為防止培養(yǎng)階段污染，培養(yǎng)環(huán)境要潔凈，可根據(jù)需要在培養(yǎng)基中加入藥劑以抑制內(nèi)源污染菌，如抗生素、單寧酸等抑菌劑。在使用抑菌劑時要注意抑微生物污染的種類和使用濃度，要注意避免對培養(yǎng)的植物組織有不良影響。此外，如單獨使用抑菌劑效果不理想，也可在培養(yǎng)基中加兩種或兩種以上抑菌劑[6]。

2 褐化及對策

褐化現(xiàn)象是木本植物組織培養(yǎng)中的常見問題，即外植體在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)物變褐而最終導(dǎo)致培養(yǎng)物死亡的現(xiàn)象[7]，它能夠嚴重影響外植體再分化和脫分化進程。褐化與外植體內(nèi)酚類物質(zhì)的含量呈正相關(guān)，因此又稱酚污染[8]。由于酚類糖苷化合物的含量又與植物中的木質(zhì)素、單寧和色素含量相關(guān)，而在木本植物中三者的含量要比草本植物高，因此木本植物更容易發(fā)生褐化現(xiàn)象[9]，也是木本植物組培快繁能否取得成功的重要因素。已有研究表明，產(chǎn)生褐化的原因主要有兩個方面：一個是非酶促褐化，一個是酶促褐化[10]。非酶促褐化主要是由外界環(huán)境引起的程序化死亡[9]；酶促褐化是培養(yǎng)物組織中多酚氧化酶、過氧化物酶或苯丙氨酸解氨酶等被激活[11]，將多酚化合物氧化成褐色的醌類物質(zhì)，這些醌類物質(zhì)引起外植體中其他酶失活，導(dǎo)致代謝紊亂，生長受阻[12]。影響褐化發(fā)生的主要因素有三個方面：外植體的選擇(外植體年齡、大小、種類、和消毒等)、培養(yǎng)條件(溫度、光照和pH值等)和培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分、狀態(tài)、硬度和激素、添加劑等)[13]。

在實際培養(yǎng)過程中，外植體的褐化一般會受到以上多種因素的相互作用的影響，因此防止褐化發(fā)生也是多種多樣，然而每種方法都有一定適用性和局限性，因此，要根據(jù)具體實際情況，有選擇性的采取相應(yīng)措施抑制或減輕褐化現(xiàn)象的發(fā)生。首先要選擇適宜的外植體。在木本植物中，多年生、木質(zhì)化程度高的枝條褐化程度高，高度分化的組織易發(fā)生褐化[14]，在選取外植體時應(yīng)選擇幼齡枝條或當年生枝條，外植體采樣時間則盡量選在冬春季，處于休眠期的枝條酚類物質(zhì)含量較少，在對外植體進行消毒時，消毒時間不宜過長。其次，在接種前先將外植體遮光低溫一段時間，再用無菌水反復(fù)清洗可起到減輕外植體的褐化作用。祁翔等[15]對紅掌組培研究中發(fā)現(xiàn)在接種前培養(yǎng)基中添加抗氧化劑有助于減少外植體的褐化。適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境能夠很好地調(diào)控褐化現(xiàn)象。再次，要注意培養(yǎng)基成分、蔗糖濃度和生長調(diào)節(jié)劑水平的配比。一般來說，固體培養(yǎng)基的褐化率最高，而液體培養(yǎng)基褐化率低[16]。無機鹽和大量元素濃度偏高會使褐化率增高，微量元素偏多會使褐化率減低，細胞分裂素的濃度也不宜過高，較低的pH值可以抑制褐化的發(fā)生。在培養(yǎng)基中加入防褐劑(抗壞血酸、聚乙烯吡咯烷酮、硫代硫酸鈉、硝酸銀、檸檬酸)和吸附劑(活性炭)是目前常用的一種有效措施， 李萍等[17]研究了4種防褐劑對牡丹組培中褐化的控制作用及對組培苗的生長和增殖作用，較好地解決了牡丹組培快繁中的褐化問題。此外，還要注意調(diào)節(jié)光照、溫度和通風(fēng)。15 ℃～20 ℃、弱光或黑暗條件下培養(yǎng)可減輕培養(yǎng)物褐變的發(fā)生。

3 玻璃化及對策

玻璃化也是在草本和木本植物組織培養(yǎng)過程中經(jīng)常遇到的不良現(xiàn)象，是指在培養(yǎng)過程中，組培苗生長異常，呈半透明鮮綠水漬狀[1]。葉片縱向卷曲或腫脹，且脆弱易碎。玻璃化苗內(nèi)體含水量高、營養(yǎng)物質(zhì)含量少、光合能力差、酶活性低，其繼代培養(yǎng)分化能力低，生根培養(yǎng)困難，移栽后不易成活[18]。

在林木組培過程中有許多因素會產(chǎn)生玻璃化苗，主要包括外植體材料本身、培養(yǎng)基條件和培養(yǎng)環(huán)境幾個方面。外植體的種類和類型會影響玻璃化的產(chǎn)生，選取幼小外植體容易發(fā)生玻璃化現(xiàn)象[13]。從培養(yǎng)基狀況來看，產(chǎn)生玻璃化苗的因素包括培養(yǎng)基中pH值、激素水平、蔗糖、瓊脂以及NH4+的濃度等；培養(yǎng)條件也是產(chǎn)生玻璃化的關(guān)鍵因素。培養(yǎng)環(huán)境中的溫濕度和光照等均在不同程度上影響著玻璃化苗的發(fā)生率。因此為防止玻璃化苗的出現(xiàn)，應(yīng)從以上因素著手解決，尤其是在培養(yǎng)基條件和培養(yǎng)環(huán)境上?？梢允褂霉腆w培養(yǎng)基，適當增加瓊脂和蔗糖濃度降低培養(yǎng)基滲透勢或使用滲透劑[1]，以及酸性條件培養(yǎng)等來降低玻璃化程度。楊雪等[19]對紅葉石楠組培苗玻璃化影響因子及其克服技術(shù)進行了研究，結(jié)果表明，培養(yǎng)基離子濃度或細胞分裂素增高玻璃化苗增多，降低溫度或提高培養(yǎng)基硬度可使玻璃化苗減少，卡拉膠比瓊脂更容易導(dǎo)致玻璃化。鄒恩強等[20]研究表明，在培養(yǎng)中適當降低外源細胞分裂素(BA)和NH4+的濃度，可有效降低玻璃化的發(fā)生。

胡淑英等[21]在對濱梅組培苗玻璃化成因及克服技術(shù)研究中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)溫度和光照時間是玻璃化的重要影響因子，因此要注意對培養(yǎng)溫度的控制，避免環(huán)境溫度過高，必要時還要進行低溫處理來消除玻璃化。還應(yīng)注意對光照時間和光照強度的控制，培養(yǎng)初期可適當進行弱光培養(yǎng)或暗培養(yǎng)，分化階段再進行強光培養(yǎng)，適當增加自然光照，自然光中的紫外線可以促進組培苗成熟，抑制玻璃化的產(chǎn)生[13]。此外還要注意培養(yǎng)容器的通風(fēng)，通氣性差的封口膜可提高玻璃化苗的發(fā)生率，因此，要選擇通透性好的透氣膜以促進氣體交換，降低培養(yǎng)容器內(nèi)的相對濕度以減少玻璃化的出現(xiàn)。

4 展望

開展林木組培快繁技術(shù)研究，對促進林木良種選育、保護珍優(yōu)林木品種、推廣種植優(yōu)良樹種以及滿足苗木市場需求等方面具有十分重要意義。但在進行林木組培快繁研究和生產(chǎn)中，不可避免地會受到污染、褐化以及玻璃化現(xiàn)象的影響，這不僅費時費工提高研究和生產(chǎn)成本，更會影響林木種苗的技術(shù)推廣及工廠化生產(chǎn)的實施與進度。因此，如何更好地避免和解決三大問題，是林木組培研究急需解決的問題，使其在科研和生產(chǎn)上得以廣泛應(yīng)用。本文闡述了這些問題的產(chǎn)生原因以及解決方法，既可以預(yù)防和控制其發(fā)生，對于已發(fā)生問題的組培苗，又可通過以上解決措施進行二次處理后重新培養(yǎng)，以免造成更大損失。隨著科學(xué)水平的持續(xù)發(fā)展，基礎(chǔ)理論的不斷深入、組培新技術(shù)[22](開放式組培、光自養(yǎng)組培)的不斷更新以及技術(shù)設(shè)備的日益完備，組織培養(yǎng)中三大難題的控制措施，尤其是褐化與玻璃化機制研究將會取得更大的進展。

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2017-03-12

陳罡(1980-)，男，遼寧沈陽人，碩士，高級工程師，主要從事林木生物技術(shù)研究，Email：chengang1625@163.com

S821.3

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10.13601/j.issn.1005-5215.2017.04.038