CD80、CD86抗體對耗竭性T細(xì)胞效應(yīng)功能的影響

孫斌，楊曉珍，郭向華，2，周育森，孫世惠，王延軍，2

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院,北京100069；2北京市肝病研究所；3中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所)

CD80、CD86抗體對耗竭性T細(xì)胞效應(yīng)功能的影響

孫斌1，楊曉珍1，郭向華1，2，周育森3，孫世惠3，王延軍1，2

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院,北京100069；2北京市肝病研究所；3中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所)

目的以CD80、CD86抗體作為激動劑、脾細(xì)胞為研究對象，觀察CD80、CD86抗體對耗竭性T細(xì)胞效應(yīng)功能的影響。方法將42只8周齡雌性 HLA-A11DR1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為7組各6只，分別在8、11、14周齡時，A～F組臀部皮下接種磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)多肽，G組接種等體積無熱源PBS；A～E組在24周齡和F、G組在17周齡時脫頸處死，取脾臟并制成脾細(xì)胞懸液；A、B組分別滴加20、40 μg/mL 抗鼠CD80抗體和10 μg/mL GPC3多肽，C、D組分別滴加20、40 μg/mL 抗鼠CD86抗體和10 μg/mL GPC3多肽，E、F、G組僅滴加10 μg/mL GPC3多肽。孵育18 h后，采用酶聯(lián)斑點(diǎn)分析儀檢測干擾素γ(IFN-γ)，以此判斷T細(xì)胞效應(yīng)功能。結(jié)果A～G組脾細(xì)胞IFN-γ陽性斑點(diǎn)數(shù)分別為(80.61±48.91)、(207.67±60.41)、(1.67±0.97)、(1.33±0.49)、(2.33±1.53)、(38.17±5.18)、(2.33±1.53)個。其中，F(xiàn)組高于E、G組(P均<0.01)，E、G組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；A組>B組>C、D、E組(P均<0.01)，C、D、E組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而且，IFN-γ陽性斑點(diǎn)數(shù)隨著CD80抗體濃度升高而增加，二者呈正相關(guān)(r=0.760 5，P<0.01)。結(jié)論CD80抗體能夠刺激耗竭性T細(xì)胞恢復(fù)產(chǎn)生細(xì)胞因子，且呈劑量依賴的動力效應(yīng);而CD86抗體未能檢測到該功能。

CD80抗體；CD86抗體；磷脂酰肌醇蛋白聚糖3；多肽疫苗；T細(xì)胞耗竭；干擾素γ

脾細(xì)胞主要成分為T細(xì)胞和B細(xì)胞，T細(xì)胞受到肽刺激會產(chǎn)生干擾素γ(IFN-γ),而B細(xì)胞則不能。因此，動物免疫實(shí)驗(yàn)中常用肽刺激小鼠脾細(xì)胞并檢測IFN-γ的分泌情況，以分析T細(xì)胞功能。刺激CD8+T細(xì)胞活化并分化為效應(yīng)性T細(xì)胞，是免疫系統(tǒng)保護(hù)宿主、清除病原微生物或腫瘤抗原的關(guān)鍵。然而，在腫瘤微環(huán)境中，常由于T細(xì)胞疲勞耗竭，而致抗腫瘤應(yīng)答能力弱、效率低下，不能有效識別和清除腫瘤細(xì)胞[1]；T細(xì)胞耗竭的形成通常是由于抗原持續(xù)性存在，缺乏輔助性“幫助”信號引起，從而抑制有效免疫應(yīng)答的形成。通過治療性疫苗來增強(qiáng)原本微弱的抗腫瘤反應(yīng)，一直是科學(xué)家長期以來所尋求的治療癌癥目標(biāo)[2～4]。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)是在肝癌組織中高表達(dá)的癌胚抗原(72%～81%)[5, 6]，組織特異性強(qiáng)，且與預(yù)后不良相關(guān)[5]，是肝癌免疫治療的理想靶抗原[5,7～9]。2016年1～12月，我們以CD80、CD86抗體作為激動劑，刺激GPC3疫苗接種后期的耗竭性T細(xì)胞，觀察其恢復(fù)效應(yīng)性功能的效果。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡雌性 HLA-A11DR1轉(zhuǎn)基因小鼠48只，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院周育森教授研究組構(gòu)建，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心；抗鼠 CD80、CD86抗體均購自eBioscience公司，GPC3多肽由上海強(qiáng)耀生物公司合成；弗氏完全佐劑、不完全佐劑和植物凝集素(PHA)均購自Sigma 公司；Elispot小鼠IFN-γ檢測試劑盒、ACE顯色底物和Falcon細(xì)胞篩網(wǎng)均購自BD公司；細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清和無熱源PBS緩沖液均購自Gibco公司；酶聯(lián)斑點(diǎn)分析儀購自美國CTL公司。

1.2 動物分組與免疫接種 將42只小鼠隨機(jī)分為7組各6只，A～F組接種GPC3多肽，G組接種等體積無熱源PBS，免疫途徑和方法相同。具體方法：將100 μg GPC3多肽與50 μL弗氏完全佐劑按照1∶1的體積比混合(總體積100 μL)，并用組織勻漿機(jī)乳化，使之達(dá)到油包水的效果；分別在8、11、14周齡時，于小鼠臀部皮下注射GPC3多肽100 μL/只。

1.3 脾細(xì)胞制備與刺激處理 A～E組在24周齡和F、G組在17周齡時，將小鼠頸椎脫臼處死并取脾臟，經(jīng)細(xì)胞篩網(wǎng)組織碾磨后獲得脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至2×106/mL。將各組細(xì)接種在96孔板，2×105/孔。A、B組分別滴加20、40 μg/mL 抗鼠CD80抗體和10 μg/mL GPC3多肽，C、D組分別滴加20、40 μg/mL 抗鼠CD86抗體和10 μg/mL GPC3，E、F、G組僅滴加10 μg/mL GPC3多肽。每孔總體積100 μL，陽性對照孔中加入5 μg/mL PHA。

1.4 T細(xì)胞效應(yīng)功能觀察 采用酶聯(lián)斑點(diǎn)分析法。取各組孵育18 h的細(xì)胞，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IFN-γ二抗，室溫放置3 h；每孔加入100 μL TMB底物溶液，室溫顯色10～15 min，陽性對照孔出現(xiàn)深紫色斑點(diǎn)即可停止顯色。采用酶聯(lián)斑點(diǎn)分析儀讀取IFN-γ陽性免疫斑點(diǎn)數(shù)，斑點(diǎn)數(shù)越多表明T細(xì)胞效應(yīng)功能越強(qiáng)。

2 結(jié)果

孵育18 h后，A～G組脾細(xì)胞IFN-γ陽性免疫斑點(diǎn)數(shù)分別為(80.61±48.91)、(207.67±60.41)、(1.67±0.97)、(1.33±0.49)、(2.33±1.53)、(38.17±5.18)、(2.33±1.53)個。其中F組高于E、G組(P均<0.01)，E、G組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明免疫接種小鼠在免疫應(yīng)答后期可能出現(xiàn)了T細(xì)胞耗竭。A組>B組>C、D、E組(P均<0.01)，C、D、E組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而且，IFN-γ陽性免疫斑點(diǎn)數(shù)隨著CD80抗體濃度升高而增加，二者呈正相關(guān)(r=0.760 5，P<0.01)。

3 討論

誘導(dǎo)產(chǎn)生持續(xù)性腫瘤抗原特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，是保障治療性癌癥疫苗效應(yīng)的基本要素。大量研究表明，CD8+T細(xì)胞必須受到活化的專職抗原提呈細(xì)胞(pAPCs)所產(chǎn)生的輔助信號刺激，才能激活并分化為效應(yīng)性T細(xì)胞[9]。GPC3是肝癌免疫治療的理想靶抗原，其多肽疫苗在HLA-A11陽性人群中具有良好的免疫反應(yīng)性。本研究將GPC3多肽疫苗免疫接種HLA-A11DR1轉(zhuǎn)基因小鼠，在17周齡時可誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著的GPC3特異性T細(xì)胞應(yīng)答，而在24周齡時特異性T細(xì)胞應(yīng)答明顯減弱，表現(xiàn)為特征性的T 細(xì)胞耗竭狀態(tài)，可能是由于輔助信號缺失引起。

B7家族分子CD80和CD86均是T細(xì)胞表面協(xié)同刺激分子CD28的配體，二者具有高度同源性，與CD28結(jié)合后產(chǎn)生T細(xì)胞活化所需的輔助信號，刺激T細(xì)胞增殖分化并發(fā)揮效應(yīng)功能。CTLA-4分子是T細(xì)胞表面協(xié)同刺激分子CD28的結(jié)構(gòu)同源體，二者均能與B7家族分子CD80和CD86功能性結(jié)合，但CTLA-4是T細(xì)胞表面的抑制性受體；CTLA-4與B7分子的親合力大大強(qiáng)于CD28，故一旦CTLA-4表達(dá)在活化T細(xì)胞表面，它將降低T細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌[14]。腫瘤微環(huán)境中的特異性效應(yīng)T細(xì)胞功能耗竭[14]，往往與T細(xì)胞表面抑制性受體過度表達(dá)有關(guān)[15]。本研究中將CD80抗體與功能耗竭的T細(xì)胞共孵育后，細(xì)胞因子分泌顯著增加，而且呈劑量依賴的動力效應(yīng)。這表明CD80抗體阻斷CD80分子與抑制性受體CTLA-4結(jié)合，抑制性信號減少，T細(xì)胞功能得以恢復(fù)。因此，CD80抗體可作為激動劑，刺激耗竭性T細(xì)胞恢復(fù)效應(yīng)性功能。然而，CD86雖同為B7家族分子，其抗體與功能耗竭的T細(xì)胞共孵育后，未檢測到細(xì)胞因子分泌功能的變化，其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

迄今，已有足夠多的研究表明肝癌患者的腫瘤特異性T細(xì)胞功能低下[10～12]，而近95%的成年急性乙肝病毒(HBV)感染者則表現(xiàn)出強(qiáng)勁的HBV特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。腫瘤患者T細(xì)胞功能損害與內(nèi)源性免疫抑制調(diào)節(jié)機(jī)制，即免疫檢查點(diǎn)(IC)活化[11, 13]有關(guān)；由于CTLA-4是免疫檢查點(diǎn)的關(guān)鍵分子，它已成為克服免疫應(yīng)答抑制性調(diào)節(jié)的理想靶點(diǎn)[15]。然而，CTLA-4組織分布廣泛，其表達(dá)無腫瘤特異性(除某些骨髓瘤和淋巴瘤外)。阻斷CTLA-4可能導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制機(jī)制缺失，免疫失衡紊亂，繼而引發(fā)劇烈致死性自身免疫??；CTLA-4敲除鼠的超免疫表型也表明，阻斷該受體易導(dǎo)致強(qiáng)烈的免疫毒性副作用，此類研究結(jié)果使得封閉CTLA-4的治療策略不斷受到質(zhì)疑[13,15]。

在我們的研究中，CD80抗體能夠使耗竭性T細(xì)胞恢復(fù)產(chǎn)生細(xì)胞因子，而且呈劑量依賴性。相較于CTLA-4抗體，CD80抗體僅部分阻斷CTLA-4信號；CD86分子仍然可以與CTLA-4受體相結(jié)合，產(chǎn)生抑制性信號，維持免疫系統(tǒng)平衡穩(wěn)定，從避免了完全阻斷該受體引起的劇烈自身免疫病。這些突出顯示了選擇性靶向CD80分子，部分阻斷CTLA-4抑制性信號，恢復(fù)T細(xì)胞功能，在腫瘤免疫治療中的潛在優(yōu)勢。

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Influence of CD80 and CD86 antibody on effector function of exhausted T cells

SUNBin1,YANGXiaozhen,GUOXianghua,ZHOUYusen,SUNShihui,WANGYanjun1,2*

(1BeijingYouanHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

ObjectiveTo investigate the effects of CD80 and CD86 antibody on the effector function of exhausted T cells.MethodsForty-two female HLA-A11DR1 transgenic mice were randomly divided into 7 groups (n=6). The mice in groups A-F were subcutaneously inoculated with phosphatidylinositol 3 (GPC3) at the age of 8 weeks (week 8), at week 11 and week 14, respectively. Mice in the group G were inoculated with the same volume of heat-free PBS as controls. Mice in the groups A-E were sacrificed at week 24, and groups F and G at week 17. Splenocytes suspension was made. Then, 20 or 40 μg/mL CD80 antibody and 10 μg/mL GPC3 peptide were pipetted in the splenocytes of groups A and B; 20 or 40 μg/mL CD86 antibody and 10 μg/mL GPC3 were pipetted in the groups C and D, respectively; 10 μg/mL GPC3 peptide was pipetted in the groups E, F, and G. After incubation for 18 h, interferon-γ (IFN-γ) was measured by enzyme-linked spot analyzer for analysis of T cell function.ResultsIFN-γ positive spots in the groups A-G were 80.61±48.91, 207.67±60.41, 1.67±0.97, 1.33±0.49, 2.33±1.53, 38.17±5.18 and 2.33±1.53, respectively. Among them, group F was significantly higher than groups E and G (bothP<0.01). There was no significant difference between groups E and G (bothP<0.01). Group A was more than group B, and group B was significantly more than group C, D and E (allP<0.01). There was no significant difference among groups C, D and E. In addition, the number of IFN-γ positive spots was positively correlated with CD80 antibody concentration (r=0.7605,P<0.01).ConclusionsAnti-CD80 could restore the exhausted T cells to secret IFN-γ with a dose-dependent manner, while anti-CD86 could not be detected for the same effect.

CD80 antibody; CD86 antibody; phosphatidylinositol 3; peptide vaccine; T cell exhaustion; interferon-γ

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.34.007

R392.5；R575.1

A

1002-266X(2017)34-0024-03

2017-08-04)

北京市科學(xué)技術(shù)委員會首都市民健康項(xiàng)目(Z141100002114002)；北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才項(xiàng)目(2014-3-092)。

孫斌(1971-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要研究方向腫瘤及肝病的介入治療。E-mail: sb5368@hotmail.com

王延軍(1971-)，女，博士，研究員，主要研究方向?yàn)楦尾〉拿庖邫C(jī)制及免疫治療。E-mail: yjunwang@ccmu.edu.cn

孫世惠(1968-)，女，副研究員，主要研究方向?yàn)檗D(zhuǎn)基因動物模型及病原感染免疫致病機(jī)制。E-mail: sunsh01@163.com