三七愈傷組織對滇重樓種子萌發(fā)的影響

石燕碧，武文君，梁暉輝，喬玉琪，武文奇，牛顏冰

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

三七愈傷組織對滇重樓種子萌發(fā)的影響

石燕碧，武文君，梁暉輝，喬玉琪，武文奇，牛顏冰

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

滇重樓為延齡草科重樓屬多年生草本植物，具有抗癌、止血等功效，市場應(yīng)用前景廣闊，但其種子在實(shí)際生產(chǎn)中存在萌發(fā)周期長和萌發(fā)率低等缺點(diǎn)。為了縮短滇重樓種子萌發(fā)時(shí)間，提高其萌發(fā)率，在三七愈傷組織上對滇重樓種子進(jìn)行暗培養(yǎng)和光照培養(yǎng)試驗(yàn)。結(jié)果表明，在三七愈傷組織上進(jìn)行暗培養(yǎng)能明顯縮短滇重樓種子的萌發(fā)時(shí)間，最快在第10天就開始萌發(fā)，萌發(fā)高峰期在第20～30天，平均萌發(fā)率為12.5%。

滇重樓；三七愈傷組織；種子萌發(fā)

滇重樓（Paris ployphylla Smith var.yunnanensis）又名云南滇重樓，以根莖入藥[1]，是云南白藥的主要原料，也是宮血寧、奪命丹、總皂苷片、季德勝蛇藥片、熱毒清等65個(gè)重要中成藥的主要組方原料[2]，具有抗癌、止血、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等功效[3]。然而，滇重樓種子有“2次休眠”的生理特征，在自然狀態(tài)下其發(fā)芽率很低，且不整齊[4]，需要經(jīng)過2次發(fā)育[5]，即需經(jīng)過2冬1夏才能萌發(fā)，生產(chǎn)周期比較長，遠(yuǎn)不能滿足快速增長的市場需求。同時(shí)，經(jīng)多年來的亂采濫挖，滇重樓野生資源已日趨枯竭，依靠野生滇重樓已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足醫(yī)藥行業(yè)的需要，急需向人工栽培模式發(fā)展，但如何縮短滇重樓種子的萌發(fā)時(shí)間、提高萌發(fā)率是滇重樓人工繁育過程中亟待解決的難題。

本試驗(yàn)采用培養(yǎng)皿進(jìn)行看護(hù)培養(yǎng)的方式，研究三七愈傷組織對滇重樓種子萌發(fā)的影響，以期為滇重樓種子快速繁育和人工栽培提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

三七愈傷組織，在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)，生長約15 d即可使用；滇重樓種子，購于河北安國中藥材市場。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子前處理 將滇重樓種子放在溫水里浸泡12 h后反復(fù)搓洗去掉紅皮，棄去上浮的種子，撈取沉在下面的種子，曬干冷藏于冰箱中，備用。

1.2.2 培養(yǎng)基的配制 按照配方MS＋0.5 mg/L NAA＋0.5 mg/L 6-BA＋3%蔗糖＋0.8%瓊脂粉，進(jìn)行三七愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配制，pH值為5.6～5.8，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，倒于培養(yǎng)皿待用。

1.2.3 種子消毒處理 試驗(yàn)種子先經(jīng)75%乙醇浸泡1 min后，用超純水沖洗2～3次，接著用20%的次氯酸鈉浸泡15 min，再用超純水沖洗5～6次，最后取出放于無菌濾紙上吸干種皮表面的水分，待接種。

1.2.4 接種處理 在超凈臺內(nèi)挑取小塊三七愈傷組織（讓其在培養(yǎng)基上有個(gè)生長的空間）于培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿中均勻放置5小塊，然后在每塊三七愈傷組織上放大小約1 cm2且經(jīng)過高壓滅菌的濾紙，然后在每片濾紙上接種2～4粒種子，封口。暗培養(yǎng)編號為1～6，光照培養(yǎng)編號為Ⅰ～Ⅵ，同時(shí)以無三七愈傷組織培養(yǎng)（種子直接接種在培養(yǎng)基上）為空白對照組。所有試驗(yàn)種子放在溫度為（19± 2）℃的培養(yǎng)架上，分別進(jìn)行暗培養(yǎng)和光照培養(yǎng)。

1.2.5 生根培養(yǎng) 為了進(jìn)一步觀察滇重樓生根、生長情況，將培養(yǎng)皿中萌發(fā)的滇重樓種子移接在生根培養(yǎng)基中（MS＋1 mg/L IBA＋3%蔗糖＋0.8%瓊脂粉，pH值為5.6～5.8），生長溫度為（19±2）℃。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 萌發(fā)率 種子萌發(fā)開始以露出胚芽為起點(diǎn)。萌發(fā)率是種子萌發(fā)能力最直接的反映，但是并不能全面反映種子的萌發(fā)能力，因?yàn)樗荒芊从撤N子萌發(fā)數(shù)量的多少，而不能反映種子萌發(fā)速率的快慢。

1.3.2 萌發(fā)速率指數(shù)（GR） 萌發(fā)速率指數(shù)反映種子萌發(fā)速率的快慢，與種子萌發(fā)率和萌發(fā)時(shí)間長短有關(guān)，在萌發(fā)速率快、萌發(fā)歷期短時(shí)，其值較大[6]。

其中，Ti為第i天，Gi為第i天的萌發(fā)率[7]。

1.3.3 萌發(fā)指數(shù)（GI）

其中，Gi為逐日發(fā)芽粒數(shù)，Di為Gi對應(yīng)的發(fā)芽時(shí)間[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 光照培養(yǎng)和暗培養(yǎng)對滇重樓種子萌發(fā)的影響

由表1可知，暗培養(yǎng)滇重樓種子比光照培養(yǎng)效果好，其中，暗培養(yǎng)在第10天就開始萌發(fā)（圖1-a）；在第25～30天時(shí)為種子萌發(fā)高峰期；第35天生長情況良好（圖1-b）；之后由于三七愈傷組織逐漸褐化，導(dǎo)致40 d以后種子不再萌發(fā)。光照培養(yǎng)滇重樓種子，最早在第30 d才開始萌發(fā)。總體來看，光照培養(yǎng)的萌發(fā)結(jié)果晚于暗培養(yǎng)。

表1 不同培養(yǎng)條件下滇重樓種子在不同時(shí)間段的萌發(fā)個(gè)數(shù)

由表2可知，在三七愈傷組織上進(jìn)行暗培養(yǎng)滇重樓種子的萌發(fā)數(shù)要多于光照培養(yǎng)，并且萌發(fā)速度要快于光照培養(yǎng)，暗培養(yǎng)平均萌發(fā)率為12.5%，平均萌發(fā)速率指數(shù)為0.014 8；而光照培養(yǎng)的平均萌發(fā)率為2.6%，平均萌發(fā)速率指數(shù)為0.001 1。暗培養(yǎng)的各項(xiàng)萌發(fā)指標(biāo)都高于光照培養(yǎng)，說明暗培養(yǎng)更有利于促進(jìn)重樓種子的萌發(fā)。

表2 滇重樓種子各項(xiàng)萌發(fā)指標(biāo)

2.2 滇重樓生根結(jié)果

滇重樓種子的胚根長約1 cm（圖1-b）時(shí)，培養(yǎng)瓶中三七愈傷組織已經(jīng)占據(jù)很大空間，為了讓滇重樓更好地生長，將其移接到生根培養(yǎng)基中，大約培養(yǎng)60 d就生根，并可長出真葉（圖1-c）；培養(yǎng)至180 d時(shí)，滇重樓生長良好，且根變長增粗，同時(shí)根的周圍長出少許愈傷組織（圖1-d）。

3 討論與結(jié)論

關(guān)于愈傷組織的研究很多，王淑莉等[9]對沙芥葉片愈傷組織誘導(dǎo)進(jìn)行了研究；李明軍[10]對懷山藥莖段愈傷組織的誘導(dǎo)進(jìn)行了研究。但未分化的愈傷組織有很強(qiáng)的分裂能力，有很強(qiáng)的活力[11]。種子萌發(fā)的基本三要素為光照、水分和溫度，而滇重樓種子屬忌光性、低溫型種子[12-13]。因此，本試驗(yàn)在（19± 2）℃的溫度下進(jìn)行暗培養(yǎng)。三七愈傷組織取材廣泛，在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)組培實(shí)驗(yàn)室中有較多的三七苗，因此，試驗(yàn)在三七愈傷組織上進(jìn)行看護(hù)培養(yǎng)。根據(jù)研究目的選用不同的外植體，一般情況下選用莖作為外植體會取得不錯(cuò)的效果[14]。本試驗(yàn)設(shè)置了光照培養(yǎng)，是因?yàn)樯L活躍的愈傷組織才能對種子起作用，光照則可以促進(jìn)三七愈傷組織的生長，所以設(shè)置光照培養(yǎng)來相互對照。試驗(yàn)結(jié)果表明，暗培養(yǎng)優(yōu)于光照培養(yǎng)，暗培養(yǎng)平均萌發(fā)速率指數(shù)為0.014 8，光照培養(yǎng)平均萌發(fā)速率指數(shù)為0.001 1。從萌發(fā)速率指數(shù)來看，在三七愈傷組織上進(jìn)行暗培養(yǎng)滇重樓種子的萌發(fā)數(shù)要多于光照培養(yǎng)，萌發(fā)時(shí)間較光照培養(yǎng)短。

現(xiàn)階段滇重樓的種植方式主要是根莖繁殖和種子直播。其中，根莖繁殖需占用大量原材料，種子直播發(fā)芽率低，但從長遠(yuǎn)來看，用種子直播繁殖實(shí)生苗是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法。因此，采用適宜的方法對滇重樓種子進(jìn)行處理、提供大量優(yōu)質(zhì)的種苗，是滇重樓人工種植過程中較為重要的環(huán)節(jié)。關(guān)于促進(jìn)滇重樓種子的萌發(fā)試驗(yàn)多采用化學(xué)、物理、層積的方法，本試驗(yàn)用三七愈傷組織培養(yǎng)來促進(jìn)滇重樓種子的萌發(fā)，可以明顯加快滇重樓種子的萌發(fā)速度，最快在第10天就開始萌發(fā)，萌發(fā)高峰期在第20～30天，提前解除滇重樓種子的休眠期，提高了種子的利用率。但平均萌發(fā)率僅為12.5%，分析其原因可能有2個(gè)，第一，在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)三七愈傷組織褐化較快，導(dǎo)致滇重樓種子在三七愈傷組織上培養(yǎng)的有效時(shí)間縮短，使萌發(fā)率降低，所以尋找更合適的愈傷組織或更好地培養(yǎng)三七愈傷組織還需進(jìn)一步研究；第二，在去種皮過程中發(fā)現(xiàn)，上浮的種子中不乏有大而色深的種子，實(shí)為空殼，下沉的種子多數(shù)為小而色灰的種子，少數(shù)為飽滿色深的種子，而試驗(yàn)中萌發(fā)的種子是飽滿色深的種子，所以，種質(zhì)也是造成萌發(fā)率低的原因。

總體來看，在三七愈傷組織上進(jìn)行暗培養(yǎng)滇重樓種子，可以明顯加快滇重樓種子的萌發(fā)速度，提前解除滇重樓種子的休眠期。有研究表明，在整個(gè)萌發(fā)過程中，滇重樓種子內(nèi)源激素GA顯著升高；在滇重樓種子育苗過程中，內(nèi)源激素ABA和GA起著重要的作用[15]。也有研究表明，看護(hù)培養(yǎng)是組織培養(yǎng)中比較有效的方法之一，其可能原因是因?yàn)榭醋o(hù)細(xì)胞向原生質(zhì)體提供了可促進(jìn)生長的物質(zhì)，或提供了一種適宜的密度效應(yīng)，或吸收原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的有毒物質(zhì)[16]。本試驗(yàn)中三七愈傷組織影響滇重樓種子的機(jī)制可能是由于釋放一種物質(zhì)，并且該物質(zhì)可能具有揮發(fā)性；關(guān)于本試驗(yàn)在三七愈傷組織上看護(hù)培養(yǎng)滇重樓種子的萌發(fā)機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

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Effects of Callus from Panax notoginseng on Seed Germination of Paris ployphylla Smith var.yunnanensis

SHIYanbi，WUWenjun，LIANGHuihui，QIAOYuqi，WUWenqi，NIUYanbing
（College ofLife Science，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu 030801，China）

Trillium family of Paris polyphylla Smith var.yunnanensis is a perennialherb,with cancer，bleeding and other effects, and broad market prospect,but exists in the actual production of seed germination cycle long and germination rate low.To shorten the seed germination time and increase the germination rate,this experimentcultures the seed of Paris ployphylla Smith var.yunnanensis on callus from Panax notoginseng in lightcircumstance and dark circumstance.The experiment results indicate that the dark culture can significantly shorten the germination time ofthe seed in the callus from Panax notoginseng,the fastestin tenth days to startgermination, germination peak between 20-30 days,the average germination rate was 12.5%.

Paris ployphylla Smith var.yunnanensis;callus from Panax notoginseng;seed germination

R282.71

：A

：1002-2481（2017）09-1438-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.09.11

2017-03-31

山西省普通高等學(xué)校大學(xué)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（2015109）

石燕碧（1993-），男，山西晉中人，在讀本科，研究方向：中藥資源與開發(fā)。牛顏冰為通信作者。