• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    3種陸地棉下胚軸對草甘膦抗性篩選的鑒定

    2017-04-04 08:51:52何積明呂尊富江九華李飛飛
    山西農業(yè)科學 2017年9期
    關鍵詞:胚軸草甘膦抗性

    何積明,呂尊富,江九華,李飛飛

    (浙江農林大學農業(yè)與食品科學學院,浙江臨安311300)

    3種陸地棉下胚軸對草甘膦抗性篩選的鑒定

    何積明,呂尊富,江九華,李飛飛

    (浙江農林大學農業(yè)與食品科學學院,浙江臨安311300)

    為了建立以草甘膦為選擇標記且具有高效篩選效率的棉花遺傳轉化體系,研究選取WC,R15和新陸早45號這3個具有成功再生體系陸地棉的下胚軸為試驗材料,分別以選擇壓2.5,5,10,20,50,100 mg/L的草甘膦質量濃度梯度進行草甘膦敏感性試驗。結果表明,WC,R15和新陸早45號的最適抗草甘膦質量濃度分別是5,20,10 mg/L。說明不同陸地棉品種下胚軸具有不同的草甘膦抗性,選擇合適濃度的草甘膦是獲取陽性轉化體的關鍵之一,研究為提高以草甘膦為選擇標記的棉花轉基因試驗的篩選效率提供了技術支持。

    陸地棉;下胚軸;草甘膦;抗性篩選

    棉花是重要的經濟作物和纖維作物,其產量和品質容易因滋生雜草而受到嚴重影響。草甘膦(Glyphosate)作為一種廣普性除草劑,它能夠有效解決雜草給棉花生產造成的干擾,具有低毒、高效、無污染和雜草不易產生抗性等綜合性能[1],是目前世界上使用范圍最廣的除草劑[2]。研究表明,草甘膦可抑制Epsps蛋白的活性,通過阻斷芳香族氨基酸的生成,進而阻斷一些芳香族化合物的生物合成,蛋白質合成受阻,無法進行正常的氮代謝,最終導致植株死亡;但草甘膦在殺死雜草的同時也會將棉花植株殺死。因此,利用轉基因技術,培育具有草甘膦抗性的新棉種成為一種有效手段[3]。草甘膦的抗性基因為Epsps[4],在一定的草甘膦濃度下,Epsps不被草甘膦抑制而能正常合成芳香族氨基酸及相關蛋白,從而使植株正常生長,表現(xiàn)出草甘膦的抗性[5]。

    目前,農桿菌介導法是棉花轉基因常用的方法。該方法有2個關鍵點:一個是成功的再生體系,另一個是合適的選擇壓濃度。研究表明,棉花對草甘膦這種除草劑具有一定的耐受性,不同的棉花品種對草甘膦的抗性不同[6]。章鄭專等[7]研究發(fā)現(xiàn),YZ-1的胚性愈傷組織對草甘膦有較強的抗性,用10 mg/L的草甘膦進行篩選,轉化率可達到62.5%。謝龍旭等[8]以中棉所35的下胚軸為受體,以10.1 mg/L的草甘膦為篩選劑,獲得了65株轉化有草甘膦抗性基因的轉化體。趙福永等[9]以陸地棉栽培品種石遠321的下胚軸為受體,以13.5 mg/L的草甘膦為篩選濃度,獲得38株轉化有aroAM12和Bts1m基因的轉化體。由此可見,選擇適合不同棉花品種的草甘膦敏感性試驗濃度,對于成功轉化十分關鍵。

    本試驗選取3種具有成功再生體系的陸地棉WC,R15和新陸早45號為材料,設計6個草甘膦濃度梯度,對其下胚軸進行抗性篩選的鑒定,找到用草甘膦作為選擇標記的臨界濃度,以提高草甘膦為選擇標記的棉花遺傳轉化效率。

    1 材料和方法

    1.1 試驗材料

    以陸地棉(WC,R15和新陸早45號)種子無菌苗的下胚軸為材料。所用培養(yǎng)基為無菌苗培養(yǎng)基(1/2 MS)和草甘膦抗性篩選的培養(yǎng)基(MS+0.1 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L KT+0.75 g/L氯化鎂+30 g/L葡萄糖+2.0 g/L菲特膠+草甘膦(質量濃度分別為2.5,5,10,20,50,100 mg/L)。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 無菌苗的培養(yǎng) 取WC,R15和新陸早45號種子各30粒,分別放入培養(yǎng)瓶中。然后倒入75%的乙醇消毒30 s,棄去乙醇;倒入30%的雙氧水,并置于100 r/min的搖床上消毒3 h;超凈臺上用加頭孢的無菌水清洗種子3次,無菌水浸泡過夜。待種子露白,在無菌條件下,剝去種子種皮,接種于1/2 MS培養(yǎng)基上,置于25~27℃條件下培養(yǎng)5~7 d[10-11]。

    1.2.2 3種下胚軸的草甘膦敏感性試驗 將下胚軸切成5~7 mm的胚軸段,分別接種到含有不同質量濃度(2.5,5,10,20,50,100 mg/L)的草甘膦愈傷誘導培養(yǎng)基上,每個濃度接種3瓶,每瓶接種5段,3次重復,置于25℃的組培室內培養(yǎng),20 d左右統(tǒng)計下胚軸的膨大數(shù)和出愈數(shù)。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    利用SPSS 22.0軟件進行方差分析,并采用鄧肯氏(Duncan)新復極差測驗法,對3個品種陸地棉下胚軸在不同草甘膦濃度下的膨大率和出愈率進行差異性比較。

    2 結果與分析

    2.1 WC下胚軸對草甘膦的抗性篩選鑒定

    從表1、圖1可以看出,當草甘膦的質量濃度為2.5 mg/L時,大部分的胚軸段有明顯的膨大并且長出愈傷組織,且膨大率和出愈率分別為80%和38.89%,表明選擇效力很低;當草甘膦的質量濃度在10 mg/L及以上時,胚軸段不膨大并且無愈傷組織出現(xiàn),表明選擇壓太大;而當草甘膦的質量濃度為5 mg/L時,下胚軸有膨大,膨大率約為36.67%,幾乎沒有愈傷組織長出,起到了一定的篩選效果。因此,選取5 mg/L草甘膦作為以WC的下胚軸為受體的篩選濃度。

    表1 WC下胚軸在不同質量濃度草甘膦培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后的膨大率和出愈率

    2.2 R15下胚軸對草甘膦的抗性篩選鑒定

    由表2、圖2可知,草甘膦質量濃度為2.5 mg/L時,膨大率與出愈率與對照間無顯著差異,基本沒起到選擇效果;當草甘膦濃度分別為5,10 mg/L時,膨大率和出愈率均顯著下降,但最低仍分別達到65.56%和22.22%,選擇效果不顯著;當草甘膦質量濃度大于50 mg/L時,均不再出現(xiàn)膨大和愈傷組織,表明選擇壓過大;當草甘膦質量濃度在20 mg/L時,下胚軸少部分出現(xiàn)膨大和愈傷組織,膨大率和出愈率分別約為26.67%和11.11%,可以達到較好的選擇效果。因此,選取20 mg/L草甘膦作為以R15的下胚軸為受體的篩選濃度。

    表2 R15下胚軸在不同濃度草甘膦培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后的膨大率和出愈率

    2.3 新陸早45號下胚軸對草甘膦的抗性篩選鑒定

    新陸早45號對草甘膦的敏感性結果如表3和圖3所示。從表3、圖3可以看出,草甘膦質量濃度為2.5 mg/L時,出愈率顯著下降達到36.67%,而膨大率下降不明顯,為90.00%;當草甘膦質量濃度為5 mg/L時,膨大率顯著下降,但依舊較高,為50%,而此時出愈率為23.33%,所以這2個質量濃度的草甘膦選擇壓偏低,無法很好地將轉化體和非轉化體加以區(qū)分;當草甘膦濃度達到20 mg/L以上時,不再出現(xiàn)膨大和愈傷,選擇壓偏高;當草甘膦質量濃度為10 mg/L時,下胚軸有一部分膨大和少量愈傷組織,膨大率和愈傷率分別約為40%和11.11%,可以達到較好的選擇效果。因此,選取10 mg/L草甘膦作為以新陸早45號的下胚軸為受體的篩選濃度。

    表3 新陸早45號下胚軸在不同質量濃度草甘膦培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后的膨大率和出愈率

    3 結論

    本試驗設置了6個草甘膦的濃度梯度(2.5,5,10,20,50,100 mg/L)對3個品種的下胚軸分別進行抗性篩選鑒定,結果表明,WC,R15和新陸早45號的下胚軸對草甘膦的最適篩選質量濃度分別為5,20,10 mg/L。不同基因型棉花的下胚軸對草甘膦具有不同的抗性或耐受性,選擇適合的篩選濃度是棉花轉基因成功的關鍵點之一。

    4 討論

    棉花再生體系的建立依賴于其基因型,國外成功轉化的棉花品種主要是柯字棉系列,國內成功轉化的棉花品種主要是冀字棉系列、中棉所系列及華中農業(yè)大學篩選出的高頻體細胞胚胎發(fā)生品種“豫早1號”[12-13]。所以,本試驗所選的3種陸地棉,都已成功構建了高效的再生體系,也是棉花轉基因中的常用材料。

    本試驗結果顯示,WC,R15和新陸早45號的下胚軸對草甘膦的敏感性質量濃度分為5,20,10 mg/L,由此可見,不同棉花品種對草甘膦的耐受性不同,因而,在進行以農桿菌介導為途徑的遺傳轉化之前必須對草甘膦的使用濃度進行探討。另外,棉花的組織培養(yǎng)和遺傳轉化是一個比較復雜和耗時的過程[14-16]。除感染和共培養(yǎng)外,其余環(huán)節(jié)都要通過草甘膦的篩選才可能獲得高比率的轉化植株,因而,在多個階段進行草甘膦篩選,以淘汰那些未轉化成功的個體十分必要。本試驗通過研究WC,R15和新陸早45號3種陸地棉下胚軸對草甘膦的敏感性,初步確定了用于棉花遺傳轉化的下胚軸愈傷組織誘導和生長過程中草甘膦的適宜篩選濃度,為進一步棉花轉基因試驗奠定了基礎。

    [1]FRANZJE,MAOMK,SIKORSKIJ A.Glyphosate:a unique global herbicide[M].Washington:American Chemical Society Publications,1997:617-642.

    [2]KNOWLES D A.Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations[M].Springer:DordrechtDOIPublisher,1998:41-79.

    [3]馬燕斌,王霞,吳霞,等.新的抗草甘膦轉基因棉花獲得的初報[J].山西農業(yè)科學,2013,41(10):1046-1049.

    [4]燕樹鋒,祝水金,劉海芳,等.轉EPSPS基因抗草甘膦棉花的遺傳分析[J].華北農學報,2015,30(3):54-57.

    [5]華水金,袁淑娜,邵明彥,等.抗草甘膦棉花研究進展[J].分子植物育種,2007,5(4):534-539.

    [6]李儒海,武懷恒,褚世海,等.轉基因抗草甘膦棉花與常規(guī)棉花對草甘膦耐受性的比較研究[J].中國棉花,2010,37(12):9-11.

    [7]章鄭專,湯磊鵬,王鈺,等.抗草甘膦基因aroA轉化陸地棉胚性愈傷組織的研究[J].棉花學報,2014,26(3):237-243.

    [8]謝龍旭,李云鋒,徐培林.根癌農桿菌介導的轉aroAM12基因棉花植株的草甘膦抗性[J].植物生理與分子生物學學報,2004,30(2):173-178.

    [9]趙福永,謝龍旭,田穎川,等.抗草甘膦基因aroAM12及抗蟲基因Bts1m的轉基因棉株[J].作物學報,2005,31(1):108-113.

    [10]吳慎杰,李飛飛,陳天子,等.利用農桿菌介導法轉化泗棉3號的研究[J].作物學報,2007,33(4):632-638.

    [11]華水金,袁淑娜,邵明彥,等.抗草甘膦棉花研究進展[J].分子植物育種,2007,5(4):534-539.

    [12]劉方,張寶紅.棉花組織培養(yǎng)高效植株再生體系的建立[J].棉花學報,2004,16(2):117-122.

    [13]謝德意.棉花體細胞胚胎發(fā)生能力比較及ipt基因的遺傳轉化[D].武漢:華中農業(yè)大學,2007.

    [14]JINS X,ZHANGXL,LIANGS G,etal.Factors affection transformation efficiency ofembryogenic callus ofupland cotton(Gossypium hirsutum)with Agrobacterium tume faciens[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2005,81(2):229-237.

    [15]FIROOZABADY E,DEBOER D L,MERLO D J,et al.Transformation ofcotton by Agrobacterium tume faciens and regeneration of transgenic plants [J].Plant Molecular Biology,1987,10(2):105-116.

    [16]UMBECK P,JOHNSON G,BARTON K,et al.Genetically transformed cotton(GossypiUm hirsutuml L.)plants[J].Biotechnology,1987,5(3):263-266.

    Identification of Glyphosate Resistance Screening in Three Upland Cotton Hypocotyls

    HE Jiming,LüZunfu,JIANGJiuhua,LIFeifei

    (College ofAgriculture and Food Science,Zhejiang Agriculture and Forestry University,Lin'an 311300,China)

    For developing a transgenic cotton transformation system,in which glyphosate was used as a selective agent in high screening efficiency,the research adopted hypocotylfrom three varieties of WC,R15 and Xinluzao 45 ofupland cotton as experimental materials,and designed glyphosate solutions of six concentrations of 2.5,5,10,20,50,100 mg/L to carry out glyphosate susceptibility tests.The results showed thatoptimum concentrations ofglyphosate ofWC,R15 and Xinluzao 45 resistwere 5,20,10 mg/L,respectively. The research explained that hypocotyl of different upland cottons had differrent resistance to glyphosate.Selecting the appropriate concentration ofglyphosate was one ofthe keys to obtain the positive transformation.So,the research provides a technicalbasic for cotton genetic transformation,aim atimproving the screening efficiency oftransgenic cotton with glyphosate as the selective marker.

    upland cotton;hypocotyl;glyphosate;resistance screening

    S562

    :A

    :1002-2481(2017)09-1408-04

    10.3969/j.issn.1002-2481.2017.09.04

    2017-05-27

    國家自然科學基金青年基金項目(31401461);2016年浙江農林大學校級教改項目(KG16001);2016年浙江農林大學學生科研訓練項目(113-2013200012)

    何積明(1996-),男,浙江溫州人,在讀本科,研究方向:植物基因工程。李飛飛為通信作者。

    猜你喜歡
    胚軸草甘膦抗性
    不同鮮重秋茄胚軸形態(tài)及其對幼苗生長的影響
    一個控制超強電離輻射抗性開關基因的研究進展
    控制水稻中胚軸伸長的QTL 定位
    中國稻米(2019年6期)2019-12-05 03:34:22
    法國擬2020年廢除草甘膦的使用
    甲基對硫磷抗性菌的篩選及特性研究
    利用重測序和集團分離分析鑒定水稻中胚軸延長相關染色體區(qū)域
    水稻中胚軸伸長研究進展
    甜玉米常見病害的抗性鑒定及防治
    中國果菜(2016年9期)2016-03-01 01:28:44
    用于黃瓜白粉病抗性鑒定的InDel標記
    中國蔬菜(2015年9期)2015-12-21 13:04:40
    草甘膦生產廢水治理技術探討
    国产精品 国内视频| 成人毛片60女人毛片免费| 色哟哟·www| 极品少妇高潮喷水抽搐| 又大又黄又爽视频免费| 国产精品一二三区在线看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产精品久久久久成人av| 国产在线免费精品| 国产免费视频播放在线视频| 久久久欧美国产精品| 亚洲av.av天堂| 国产日韩欧美亚洲二区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 美女视频免费永久观看网站| av在线观看视频网站免费| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 咕卡用的链子| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 一本久久精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 老司机亚洲免费影院| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 我要看黄色一级片免费的| 新久久久久国产一级毛片| 一区二区av电影网| 韩国精品一区二区三区| 亚洲天堂av无毛| 久久久久久久大尺度免费视频| 五月伊人婷婷丁香| 中文字幕亚洲精品专区| 最黄视频免费看| 丝瓜视频免费看黄片| 少妇人妻 视频| 高清在线视频一区二区三区| 桃花免费在线播放| 亚洲第一av免费看| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲人成网站在线观看播放| 91久久精品国产一区二区三区| 黄片小视频在线播放| 久久久久久久精品精品| 国产在线免费精品| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 黄频高清免费视频| 欧美日韩av久久| 2022亚洲国产成人精品| 老汉色∧v一级毛片| 人人妻人人澡人人看| 国产野战对白在线观看| 亚洲精品乱久久久久久| 美女中出高潮动态图| 国产亚洲最大av| 在线精品无人区一区二区三| 国精品久久久久久国模美| 欧美最新免费一区二区三区| 又黄又粗又硬又大视频| 天天操日日干夜夜撸| 少妇熟女欧美另类| 美女主播在线视频| 伊人久久国产一区二区| 久久久国产一区二区| 国产毛片在线视频| 91精品国产国语对白视频| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 免费看不卡的av| 免费大片黄手机在线观看| 亚洲久久久国产精品| 丁香六月天网| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 午夜老司机福利剧场| 午夜老司机福利剧场| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 免费在线观看黄色视频的| 青春草视频在线免费观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 少妇被粗大猛烈的视频| 日韩精品有码人妻一区| 精品人妻偷拍中文字幕| videosex国产| 国产午夜精品一二区理论片| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 在现免费观看毛片| 最新中文字幕久久久久| 久久毛片免费看一区二区三区| 好男人视频免费观看在线| av在线观看视频网站免费| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品av久久久久免费| 最近的中文字幕免费完整| 丝袜在线中文字幕| 亚洲av.av天堂| 国产成人一区二区在线| 久久午夜福利片| 亚洲一区二区三区欧美精品| 精品亚洲成国产av| 9色porny在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 久热久热在线精品观看| 高清av免费在线| 国产一区二区三区综合在线观看| av女优亚洲男人天堂| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产精品国产av在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久国产亚洲av麻豆专区| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲伊人色综图| 亚洲精品久久午夜乱码| 母亲3免费完整高清在线观看 | 久久久久久久国产电影| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲av综合色区一区| 亚洲欧洲日产国产| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产精品久久久久久久久免| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | av网站免费在线观看视频| 涩涩av久久男人的天堂| 精品少妇久久久久久888优播| 日韩一本色道免费dvd| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| xxxhd国产人妻xxx| 丝袜人妻中文字幕| 在线观看免费视频网站a站| 一级毛片我不卡| 26uuu在线亚洲综合色| 在线精品无人区一区二区三| 少妇人妻精品综合一区二区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 如何舔出高潮| 国产片内射在线| 伦理电影大哥的女人| 高清欧美精品videossex| 99热网站在线观看| 免费高清在线观看日韩| 韩国精品一区二区三区| 午夜福利视频精品| 久久精品国产自在天天线| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 精品卡一卡二卡四卡免费| 日韩伦理黄色片| 十八禁网站网址无遮挡| 久久久精品区二区三区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 日韩在线高清观看一区二区三区| 黄色视频在线播放观看不卡| 午夜久久久在线观看| 一级片免费观看大全| 日韩精品免费视频一区二区三区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲国产欧美在线一区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲成国产人片在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 欧美激情高清一区二区三区 | 色94色欧美一区二区| 久久久久久久久久久免费av| 90打野战视频偷拍视频| 国产淫语在线视频| 一级黄片播放器| 黄片播放在线免费| 波多野结衣一区麻豆| 国产免费现黄频在线看| 新久久久久国产一级毛片| 国产精品熟女久久久久浪| 啦啦啦在线观看免费高清www| 男的添女的下面高潮视频| 少妇的逼水好多| 久久精品夜色国产| 如何舔出高潮| 午夜免费男女啪啪视频观看| kizo精华| 99国产精品免费福利视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 午夜激情av网站| 日韩视频在线欧美| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 一个人免费看片子| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 亚洲四区av| 日本91视频免费播放| 免费观看在线日韩| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 久久国内精品自在自线图片| 国产精品熟女久久久久浪| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 中文字幕亚洲精品专区| 免费高清在线观看日韩| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲av中文av极速乱| 国产在线免费精品| 国产免费又黄又爽又色| 天堂俺去俺来也www色官网| 热re99久久国产66热| 国产男女内射视频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产一区二区激情短视频 | 国产av国产精品国产| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 老鸭窝网址在线观看| 欧美+日韩+精品| 精品亚洲成a人片在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产精品女同一区二区软件| 国产成人91sexporn| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲久久久国产精品| 精品亚洲成国产av| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 热re99久久国产66热| www.精华液| 欧美日韩一级在线毛片| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲在久久综合| 国产日韩欧美在线精品| 另类精品久久| 免费日韩欧美在线观看| 久久综合国产亚洲精品| 精品一区二区免费观看| 国产精品 国内视频| 国产免费现黄频在线看| 久久久精品免费免费高清| 亚洲美女搞黄在线观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久国产亚洲av麻豆专区| √禁漫天堂资源中文www| 日韩精品有码人妻一区| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲经典国产精华液单| av视频免费观看在线观看| 国产在线一区二区三区精| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | av女优亚洲男人天堂| 日日爽夜夜爽网站| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久精品国产自在天天线| 大码成人一级视频| 久久人妻熟女aⅴ| 欧美+日韩+精品| av在线app专区| 婷婷色av中文字幕| www日本在线高清视频| 久久 成人 亚洲| 青春草亚洲视频在线观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 日本午夜av视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 精品国产一区二区三区四区第35| 黑丝袜美女国产一区| 麻豆乱淫一区二区| 午夜影院在线不卡| 久久久久久久久久人人人人人人| 少妇的丰满在线观看| 欧美日韩精品网址| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 人人妻人人澡人人看| 一本大道久久a久久精品| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 人人澡人人妻人| 精品第一国产精品| 有码 亚洲区| 色吧在线观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 哪个播放器可以免费观看大片| 久久 成人 亚洲| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久99一区二区三区| 搡老乐熟女国产| 国产精品欧美亚洲77777| 久久久久久伊人网av| 日韩伦理黄色片| 制服诱惑二区| 超色免费av| 一级片免费观看大全| 满18在线观看网站| 美女脱内裤让男人舔精品视频| www.av在线官网国产| 91精品三级在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| 男人添女人高潮全过程视频| videos熟女内射| 亚洲图色成人| 免费黄网站久久成人精品| 久热久热在线精品观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 午夜激情av网站| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产精品偷伦视频观看了| 视频在线观看一区二区三区| 制服丝袜香蕉在线| 欧美xxⅹ黑人| 国产免费福利视频在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产av精品麻豆| 国产精品一区二区在线不卡| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 人成视频在线观看免费观看| 天堂8中文在线网| 如何舔出高潮| 亚洲,欧美精品.| 中文天堂在线官网| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 久久影院123| 在线观看美女被高潮喷水网站| 色视频在线一区二区三区| 亚洲 欧美一区二区三区| av国产精品久久久久影院| 国产av国产精品国产| 国产精品久久久久久av不卡| 精品国产国语对白av| 一区二区三区乱码不卡18| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 亚洲国产精品999| 亚洲情色 制服丝袜| 人妻系列 视频| 成年动漫av网址| 亚洲欧美精品自产自拍| 日本vs欧美在线观看视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 青春草国产在线视频| 少妇的逼水好多| 国产一区二区三区av在线| 少妇人妻 视频| xxx大片免费视频| 国产亚洲最大av| 看免费av毛片| 精品久久久精品久久久| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 一级黄片播放器| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 少妇熟女欧美另类| 欧美亚洲日本最大视频资源| 18禁观看日本| 亚洲欧美色中文字幕在线| 精品一品国产午夜福利视频| 热99久久久久精品小说推荐| 捣出白浆h1v1| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产极品天堂在线| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产97色在线日韩免费| av网站在线播放免费| 亚洲国产精品一区三区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 免费黄色在线免费观看| 国产精品蜜桃在线观看| videos熟女内射| 赤兔流量卡办理| 久久久久国产网址| 天堂中文最新版在线下载| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 精品国产乱码久久久久久小说| 日韩大片免费观看网站| 国产激情久久老熟女| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久午夜福利片| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产日韩欧美亚洲二区| 少妇的逼水好多| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 制服丝袜香蕉在线| 国产精品成人在线| 桃花免费在线播放| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 欧美日韩亚洲高清精品| 午夜影院在线不卡| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲人成77777在线视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 波多野结衣一区麻豆| 精品久久蜜臀av无| 校园人妻丝袜中文字幕| av不卡在线播放| 性色av一级| 亚洲欧美色中文字幕在线| 久久精品国产亚洲av涩爱| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产极品天堂在线| 一级毛片 在线播放| av天堂久久9| 一本久久精品| 韩国高清视频一区二区三区| 免费黄频网站在线观看国产| 黄片小视频在线播放| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 超色免费av| 久久久久国产一级毛片高清牌| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 最近手机中文字幕大全| 激情视频va一区二区三区| 波多野结衣av一区二区av| 国产精品二区激情视频| 国产成人精品久久久久久| 日本午夜av视频| 国产精品 欧美亚洲| 精品久久久精品久久久| 老汉色∧v一级毛片| 精品一品国产午夜福利视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 这个男人来自地球电影免费观看 | 婷婷色麻豆天堂久久| 日韩大片免费观看网站| 亚洲色图综合在线观看| 国产成人aa在线观看| 精品亚洲成国产av| 久久久久国产网址| 最新的欧美精品一区二区| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 九草在线视频观看| 这个男人来自地球电影免费观看 | 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| xxx大片免费视频| 99久久综合免费| 婷婷色av中文字幕| 赤兔流量卡办理| 国产成人精品久久久久久| 国产麻豆69| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产成人aa在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 女性生殖器流出的白浆| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 2018国产大陆天天弄谢| 午夜91福利影院| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产精品久久久久久av不卡| 1024香蕉在线观看| 国产一区二区在线观看av| 美女国产高潮福利片在线看| 欧美+日韩+精品| 色婷婷av一区二区三区视频| 欧美日韩av久久| 在线天堂中文资源库| 久久久久国产一级毛片高清牌| 免费日韩欧美在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 欧美最新免费一区二区三区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产在线视频一区二区| 香蕉国产在线看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 在线免费观看不下载黄p国产| 一区二区日韩欧美中文字幕| 边亲边吃奶的免费视频| 一级片'在线观看视频| 老司机影院成人| 精品国产一区二区三区四区第35| 黄频高清免费视频| 日韩中文字幕视频在线看片| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 久久久久精品人妻al黑| 我的亚洲天堂| 久久狼人影院| 国产激情久久老熟女| 成人午夜精彩视频在线观看| 欧美中文综合在线视频| 青春草视频在线免费观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲国产av影院在线观看| av线在线观看网站| 人人妻人人澡人人看| 久久久久久久国产电影| 美女主播在线视频| 国产成人欧美| 欧美日韩一级在线毛片| 乱人伦中国视频| 69精品国产乱码久久久| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲av中文av极速乱| 五月天丁香电影| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲久久久国产精品| 国产一区二区 视频在线| 国产毛片在线视频| 有码 亚洲区| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 美女午夜性视频免费| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产又爽黄色视频| 十分钟在线观看高清视频www| 国产免费又黄又爽又色| 精品久久蜜臀av无| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产精品免费大片| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产精品一区二区在线不卡| 久久久欧美国产精品| 午夜久久久在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲第一av免费看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美另类一区| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 九草在线视频观看| 国产视频首页在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 成人毛片60女人毛片免费| 欧美国产精品va在线观看不卡| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 少妇人妻精品综合一区二区| 街头女战士在线观看网站| 中文字幕制服av| 十分钟在线观看高清视频www| 精品视频人人做人人爽| 亚洲av.av天堂| 国产又爽黄色视频| 国产精品 欧美亚洲| 国产伦理片在线播放av一区| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产欧美亚洲国产| av国产久精品久网站免费入址| 天堂中文最新版在线下载| 国产成人aa在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 韩国精品一区二区三区| 七月丁香在线播放| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美精品av麻豆av| 国产毛片在线视频| 国产1区2区3区精品| 久久久久久久久久人人人人人人| 色婷婷久久久亚洲欧美| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产一区有黄有色的免费视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产不卡av网站在线观看| 9色porny在线观看| 美女高潮到喷水免费观看| 午夜日韩欧美国产| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 成人毛片60女人毛片免费| a 毛片基地| 免费人妻精品一区二区三区视频| 成人二区视频| 男人操女人黄网站| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲美女视频黄频| 亚洲欧美色中文字幕在线| av一本久久久久| 国产探花极品一区二区| 99九九在线精品视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久久久网色| 免费高清在线观看视频在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产一区二区在线观看av| 国产免费又黄又爽又色| 久久久久人妻精品一区果冻| 伦精品一区二区三区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久久久网色| 大香蕉久久成人网| 男人舔女人的私密视频| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 欧美日本中文国产一区发布| 午夜日韩欧美国产| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产极品天堂在线| 久久久久久久国产电影| 少妇的丰满在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 七月丁香在线播放| 久热这里只有精品99| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲成色77777| 男人爽女人下面视频在线观看| 两性夫妻黄色片| 十八禁高潮呻吟视频| 欧美中文综合在线视频| 不卡视频在线观看欧美| 性色avwww在线观看| a级毛片在线看网站| 飞空精品影院首页| 久久久久视频综合| 18+在线观看网站| 精品少妇内射三级| 国产成人精品久久二区二区91 | 亚洲国产毛片av蜜桃av|