提高血凝與血凝抑制試驗檢測精確率的探討

劉 偉

福建省石獅市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 福建石獅 362700

提高血凝與血凝抑制試驗檢測精確率的探討

劉 偉

福建省石獅市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 福建石獅 362700

血凝與血凝抑制試驗作為多種動物疫病抗體檢測的手段，在基層動物疫病預防控制機構檢測工作中被廣泛應用，同時在疫病監(jiān)測、免疫狀態(tài)評價、流行病學調查以及群體診斷中都具有重要的意義。因此，總結分析血凝與血凝抑制試驗，提高檢測精確率，避免出現(xiàn)錯誤結論就顯得尤為重要。文中從影響HA、HI試驗檢測結果的因素出發(fā)，分析總結提高檢測精確率的方法，供大家參考。

血凝與血凝抑制 禽流感 新城疫

1 緩沖液

1.1 緩沖液的種類 血凝和血凝抑制試驗所涉及的試驗不同，使用的緩沖液有所區(qū)別。常見的緩沖液有生理鹽水、磷酸鹽緩沖液（PBS）。

濃度85%的生理鹽水常被用作禽流感抗體檢測的緩沖液，鹽濃度超過85%易使紅細胞受到非特異性凝集，而生理鹽水緩沖液不具備維持反應系統(tǒng)pH值的能力，而PBS卻具備該項功能。使用PBS進行禽流感抗體檢測所測得的抗體效價比使用生理鹽水測得的要高，能提高檢出率[1]。所以，禽流感HA、HI試驗盡量使用磷酸鹽緩沖液，可提高檢出率，避免出現(xiàn)非特異性凝集。通常配置PBS使用的Na2HPO4含有水分子，此時應注意用量，同時滅菌后還要再次進行pH值的調整。

PBS也常作為新城疫抗體檢測的緩沖液。但使用pH值為5.8～6.2的PBS，會導致紅細胞自凝和出現(xiàn)凝集圖像不清晰的結果。使用pH值5.8～7.2的PBS沒有使用同一pH值生理鹽水的效果好，生理鹽水不會出現(xiàn)自凝、圖像不清等缺點[2]。因此，可把生理鹽水作為緩沖液進行新城疫抗體檢測。

1.2 緩沖液的pH值 無論是哪一種緩沖液，pH值都必須限定好適用范圍。病毒血凝性的最適pH值在6.0～7.2。使用PBS時，pH值小于5.8，紅細胞可發(fā)生聚集結塊或破裂溶血，pH值大于7.8，聚集的紅細胞會加速解聚，病毒會輕易地從吸附的紅細胞上脫落；使用生理鹽水時，如果pH值小于6.4或大于7.2，紅細胞可能破潰溶血[3]。 綜上所述，6.0＜pH＜7.2是PBS進行試驗最適合的范圍，6.4＜pH＜7.2是生理鹽水進行試驗最適合的范圍。因此，為了避免對試驗結果的誤判，緩沖液的pH值可統(tǒng)一限定在6.4～7.2，而pH值在7.0～7.2時，血沉最充分，圖像辨識度最高，觀察也最簡單，結果判斷也最準確[4]。同時考慮pH計或pH試紙的誤差，可把緩沖液的pH值設在7.0，這也在長期的檢測工作中得到有效驗證。

1.3 緩沖體系的統(tǒng)一 試驗過程中每一個步驟都必須使用同一種緩沖液，保證緩沖體系一致，尤其是在配制1%雞紅細胞時，切不可為了方便使用生理鹽水，而應該依據(jù)試驗所需的緩沖體系進行操作。

2 溫 度

溫度在4～37℃時，每提高5℃，HI效價平均上升0.35log2[5]。當環(huán)境溫度不高于4℃時，不僅反應慢以至需要延長反應時間，而且紅細胞會發(fā)生聚集；環(huán)境溫度高于37℃及以上時，抗原能釋放神經氨酸酶，破壞紅血球表面，從而使之失去聚集能力從紅血球上脫落，紅血球則血沉過快同時更容易發(fā)生溶血，溫度過高還面臨液體蒸發(fā)過快導致反應體系總量和各組分比例失調的后果，這都會導致抗原活性下降，從而使得試驗不成立。試驗最適宜的溫度范圍在18～22℃[6]，試驗開始前尤其是夏季應把環(huán)境溫度平衡到該范圍。

3 時 間

3.1 HA試驗的有效時間和判定 測定血凝效價后不能繼續(xù)做HI試驗的情況有：隔天進行HI試驗、更換了紅細胞懸液、更換了抗原，這三種情況都必須重新測定血凝效價。HA試驗一般在加入紅細胞20 min后，隨時觀察結果，直到對照孔100%凝集，空白對照孔中液體澄清透亮，再進行結果判定。

3.2 HI試驗的孵育時間和判定 HI試驗的孵育時間與孵育溫度成反比，試驗最適宜的溫度是18～22℃，在該溫度范圍內，孵育20～40 min。若孵育時間短，血清中的抗體與抗原反應不徹底，凝集不完全，且之后紅細胞會與血清中的抗體競爭抗原；若孵育時間長，抗原會釋放神經氨酸酶，使凝集的紅細胞脫落或紅細胞裂解。所以，孵育20 min后，以陰性對照孔完全沉淀、陽性對照孔凝集為信號，隨時觀察結果。淚滴完全流淌，且以與對照孔淚滴大小、淚痕線粗細、淚痕流速快慢相近的最后孔為判定結果[7]。

4 紅細胞

4.1 紅細胞的采集 通常情況采集1羽禽的紅細胞可能出現(xiàn)自凝，所以一般采集至少3羽無免疫、健康禽的抗凝血液。采集時，抗凝劑使用過少，血液會凝集成塊，導致出現(xiàn)凝集價低、凝集抑制價高的誤判；抗凝劑使用過多，會抑制凝集，導致出現(xiàn)凝集價高、凝集抑制價低的結果?？鼓齽┡c血液的最佳比例是（1∶4）～（1∶5）[7]。 條件允許的情況下，可以使用含檸檬酸鈉抗凝劑的一次性真空采血管，以提高檢測的精確性。

4.2 禽種的選擇 檢測禽類血清抗體時，用同種禽類紅細胞基本上不出現(xiàn)非特異性凝集；檢測水禽血清抗體時，用雞紅細胞就可能出現(xiàn)非特異性凝集，出現(xiàn)假陰性[4]。因此，檢測禽類血清抗體時最好采集同種禽類的血液。

4.3 紅細胞的洗滌 在基層工作中我們很難判斷采集紅細胞的禽類是否健康和有無免疫，因此，采集來的血液要適當增加洗滌次數(shù)，以洗去血清中固有的抗體和雜質。采集的3份紅細胞可先分別進行3次洗滌，盡量洗去白細胞膜，然后把洗滌好的3份紅細胞進行混合，再進行洗滌，洗滌次數(shù)不宜過多，離心轉速按標準文件設定，直至上清液澄清、透明即可。離心管有“U”型和“V”型兩種，最好選擇后者，因為前者會使紅細胞沉淀不完全，導致洗滌效果不好。有的紅細胞血沉較慢，會導致試驗結果誤差很大，因此，制備好的紅細胞，一定要先觀察血沉，血沉過慢的應當重新制備[8]。

4.4 紅細胞的配制 去除紅細胞離心管的上清液后，吸取X mL緩沖液加入到紅細胞泥中，充分混勻后回抽（X+Y）mL，這時回抽液中就含有Y mL紅細胞，就可以配制出（100×Y）mL的1%紅細胞懸濁液，0.5%的紅細胞懸濁液以此類推。根據(jù)檢測樣品數(shù)就可以推算出需要回抽多少毫升的紅細胞。

5 抗 原

目前基層使用的抗原基本上都是凍干粉，所以，抗原方面只需要做好抗原效價的測定以及抗原效價的返滴定即可，返滴定可對不準確的效價進行校正。按照測定的抗原效價，進行效價±1共三種梯度的返滴定，選取使1單位抗原完全凝集、1/2單位抗原完全抑制的抗原梯度作為配制4單位抗原的效價。由于凍干粉原液中的各種成分依然存在于凍干粉中，所以，配制抗原用滅菌水稀釋凍干粉就可以了，否則可能導致抗原鹽類濃度過高，出現(xiàn)鹽類凝集、抗原效價不準確等現(xiàn)象。

6 操 作

試驗操作時吸頭要壓實緊密，指壓力度要均勻，吹打要慢吸快注，避免氣泡和溢出，同時要避免吸頭與反應板底部摩擦，造成的底部磨損會導致淚滴流淌不順暢、圖像不清晰。樣品、陽性血清、抗原和紅細胞懸液在使用前要搖勻，加入紅細胞反應后要使用振蕩器平穩(wěn)、勻速振蕩混勻，時間在10 s左右即可。加紅細胞時，從最后一孔向前加，可以平衡各孔的反應時間。要避免把反應板放在空調出風口的方向上，以免反應體系的液體蒸發(fā)過快。

[1]許連珍.HA、HI微量法檢測雞群抗體的影響因素[J].中國家禽,2006,28(18)：31-32.

[2]張波,閻紅,莊艷.實驗室操作過程中影響血凝抑制試驗的因素[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2006(10)：44.

[3]閆玲.幾種試驗條件對雞新城疫血凝和血凝抑制試驗的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)1995(6)：25-26.

[4]杭柏林,胡建和,劉麗艷,等.影響血凝抑制試驗因素的研究進展[J].貴州農業(yè)科學,2009,37(3)：111-113.

[5]雷莉輝.影響血凝試驗和血凝抑制試驗的因素分析[J].中國畜牧獸醫(yī),2013,40(6)：244-246.

[6]楊文,孫文梅,江燕萍.HI試驗中應注意的問題[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2002(3)：31.

[7]宋建國,周峰.影響血凝和血凝抑制試驗因素的探討與分析[J].國外畜牧學豬與禽,2015,35(10)：59-61.

[8]黃愉森,莊克,謝淑敏.不同種禽類紅細胞懸液對HI結果的影響[J].養(yǎng)禽與禽病防治,2005(1)：8-9.

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1003-4331（2017）06-0034-02