GPSM2過表達對人胰腺癌細胞遷移能力的影響

魏彪，張建新，崔磊，瞿建國，錢小寶，黨勝春

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 普通外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001）

近年來，胰腺癌的全球新發(fā)病例及死亡人數(shù)有明顯上升趨勢[1]，由于其癥狀不明顯而不易確診等原因，患者確診時多處于腫瘤晚期。據(jù)統(tǒng)計，胰腺癌患者5年生存率＜5%，早期即會發(fā)生周圍組織器官的侵犯或遠處轉(zhuǎn)移[2]。降低胰腺癌的轉(zhuǎn)移能力是目前提高患者生存時間及生活質(zhì)量的重要手段。G蛋白信號調(diào)節(jié)蛋白2（G-protein signaling modulator 2，GPSM2）最初被發(fā)現(xiàn)為調(diào)控細胞紡錘體的正確定位[3]，維持細胞的對稱性分裂[4-6]，在參與細胞分裂的G2/M期發(fā)揮了重要的功能[7]。Fukukawa等[8]報道了GPSM2與乳腺癌發(fā)病密切相關(guān)。胰腺癌組織中GPSM2的過表達已被證實，且其表達水平與腫瘤分化程度、腫瘤臨床分期及胰腺癌患者的預(yù)后息息相關(guān)[9-10]。筆者前期實驗中發(fā)現(xiàn)，人胰腺癌MIA-PaCa-2細胞的GPSM2表達水平高于其他胰腺癌細胞株（PANC-1、AsPC-1），且該細胞株具有高侵襲轉(zhuǎn)移能力[11-12]。本研究將通過構(gòu)建GPSM2穩(wěn)定高表達的胰腺癌細胞株，并在人胰腺癌MIA-PaCa-2細胞上鑒定其表達效率，觀察過表達GPSM2的MIA-PaCa-2細胞遷移能力。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

MIA-PaCa-2細胞（中國科學(xué)院細胞庫），真核表達載體pCMV-Tag 3B、嘌呤霉素質(zhì)粒（中國碧云天公司），限制性核酸內(nèi)切酶EcoR V和Xho I及T4DNA連接酶（NEB公司），Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)，聚凝胺（吉滿生物有限公司），DNA凝膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司），小量抽提試劑盒（杭州愛思進生物技術(shù)有限公司），Opti-MEM（北京索寶來科技有限公司），胎牛血清（Gibco公司），realtime PCR試劑盒、TRIzol、RNA溶解液（南京百斯凱科技有限公司），小鼠抗人GPSM2抗體、小鼠抗人β-catenin單克隆抗體、兔抗小鼠IgG抗體（江蘇厚普生物技術(shù)科技有限公司），β-actin抗體（Sigma公司），DMEM基高糖礎(chǔ)培養(yǎng)基（Hyclone公司)，所有的引物合成均來源上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 GPSM2過表達真核載體的構(gòu)建及鑒定 按照TRIzol法提取新鮮胰腺癌細胞的總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒擴增cDNA。PCR擴增GPSM2序列，并純化回收。根據(jù)GenBank中GPSM2 cDNA序列設(shè)計并合成引物，設(shè)計的GPSM2引物上游序列:5'-TGA TAT CAT GGA GGA AAA TTT GA-3'，下游序列:5'-CTC GAG CTA ATG GTC TGC CGAT-3'。在上游引物的5'端加入EcoR V限制性核酸內(nèi)切酶位點，在下游引物5'端加入Xho I限制性核酸內(nèi)切酶位點，下劃線部分為酶切識別位點。EcoR V和Xho I分別雙酶切GPSM2片段和pCMV-Tag 3B質(zhì)粒后，T4DNA連接酶進行連接反應(yīng)。將重組表達載體轉(zhuǎn)染用氯化鈣法制備的新鮮大腸桿菌感受態(tài)細胞，并挑選出陽性克隆進行PCR擴增，送公司測序驗證。測序正確后將構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒命名為pCMV-Tag 3B-GPSM2。

1.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胰腺癌MIA-PaCa-2細胞及獲得穩(wěn)定表達細胞株 MIA-PaCa-2胰腺癌細胞轉(zhuǎn)染前24 h接種于10 cm培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染前2 h再換用8 mL高糖DMEM新鮮培養(yǎng)基（不含抗生素，含10%FBS），轉(zhuǎn)染時細胞融合度為60%～70%。pCMV-Tag 3B-GPSM2、空載pCMV-Tag 3B分別與嘌呤霉素質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，37 ℃、5%CO2孵育轉(zhuǎn)染細胞4 h后，換完全培養(yǎng)基。每2天換用含3 μg/mL嘌呤霉素新鮮完全培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染MIAPaCa-2細胞株45 d。

1.2.3 運用RT-PCR檢測GPSM2 mRNA的表達水平 采用TRIzol法分別提取pCMV-Tag 3B-GPSM2轉(zhuǎn)染MIA-PaCa-2細胞（基因重組組）、pCMV-Tag 3B轉(zhuǎn)染的MIA-PaCa-2細胞（陰性對照組）及未轉(zhuǎn)染MIA-PaCa-2細胞（空白對照組）的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，變性獲得單鏈cDNA模板。反應(yīng)體系共25 μL，反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，40 個循環(huán)；然后 72 ℃延伸10 min。PCR引物序列為:GPSM2上游5'-GGC CAT TGA TTA TCA TCT GAA GC-3'，下游5'-TCC TTA CCG TGT TTG AAA GGA A-3'，擴增產(chǎn)物為99 bp；內(nèi)參GAPDH上游5'-CCA CTA GGC GCT CAC TGT TC-3'， 下 游5'-AGG CGC CCA ATA CGA CCA A-3'，擴增產(chǎn)物為108 bp。

1.2.4 Western blot檢測胰腺癌細胞中GPSM2、β-catenin蛋白表達水平 將胰腺癌細胞加入裂解液，置冰上進行超聲裂解35～40 min，于4 ℃下12 000 r/min離心15 min，采用碧云天BCA蛋白濃度試劑盒測定總蛋白質(zhì)濃度，并進行蛋白質(zhì)定量。取100 μg細胞總蛋白與上樣緩沖液混合后，經(jīng)100 ℃ 5 min變性后至SDS-PAGE電泳，蛋白被轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉+TBST封閉2 h，加入一抗過夜（4 ℃），充分洗滌，隨后加入1:2 000稀釋的二抗，室溫下培育1 h；洗滌、DAB顯色、暗室中膠片曝光、顯影、定影后觀察。

1.2.5 Transwell實驗檢測胰腺癌細胞的遷移能力將上述3組胰腺癌細胞分別采用常規(guī)消化傳代方法，制成細胞懸液，計數(shù)，調(diào)整濃度為2×105/mL。在Chamber下室（即24孔板底部）中加入700 μL含10%血清的培養(yǎng)基，上室加入100 μL細胞懸液，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)24 h；取出Chamber，吸干上室液體，移到預(yù)先加入800 mL 4%多聚甲醛的孔中，室溫固定20 min；取出Chamber，PBS清洗兩次。再將Chamber移至100%甲醇室溫固定20 min。將Chamber移到預(yù)先加入Giemsa染液的孔中，室溫染色15 min；PBS清洗Chamber，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細胞；徹底晾干Chamber后，熒光倒置顯微鏡計數(shù)、拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間差異采用配對t檢驗，GPSM2與β-catenin蛋白之間的相關(guān)性采用一元線性回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組載體的鑒定

挑取pCMV-Tag 3B-GPSM2載體轉(zhuǎn)染的陽性菌落，接種到含50 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，用小量抽提試劑盒進行質(zhì)粒抽提。所得質(zhì)粒用雙酶切鑒定。酶切結(jié)果表明，被切開的是陽性克隆。并將陽性克隆進行PCR擴增，送上海英駿測序顯示重組質(zhì)粒的GPSM2編碼序列與設(shè)計的片段完全一致，表明pCMV-Tag 3B-GPSM2重組載體構(gòu)建成功（圖1）。

圖1 測序法鑒定構(gòu)建的重組質(zhì)粒（箭頭所標識的為GPSM2插入位置ATG）Figure 1 Sequencing identi fication of the recombinant plasmids (arrow showing GPSM2 insertion position of ATG codons

2.2 重組穩(wěn)定細胞株的建立

pCMV-Tag 3B-GPSM2、空載pCMV-Tag 3B分別與嘌呤霉素質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的MIA-PaCa-2細胞，在含3 μg/mL嘌呤霉素新鮮完全培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)45 d后，存活的細胞株為重組穩(wěn)定細胞株。

2.3 RT-PCR驗證GPSM2 mRNA的高水平表達

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，GPSM2轉(zhuǎn)染組的GPSM2 mRNA表達水平較空白對照組和陰性對照組均明顯上調(diào)（圖2）（P＜0.01），與空白對照組相比，GPSM2基因上調(diào)效率達到了73.3倍。陰性對照組與空白對照組間GPSM2 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 各組胰腺癌細胞GPSM2 mRNA的表達情況Figure 2 The GPSM2 mRNA expressions in each group of pancreatic cancer cells

2.4 Western blot檢測各組細胞GPSM2、β-catenin蛋白表達水平

Western blot檢測結(jié)果顯示，GPSM2轉(zhuǎn)染組的GPSM2、β-catenin蛋白表達水平均較空白對照組和陰性對照組明顯升高（均P＜0.05），而陰性對照組與空白對照組間兩種蛋白的表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）（圖3）。經(jīng)一元線性回歸發(fā)現(xiàn)，各組胰腺癌細胞的GPSM2與β-catenin蛋白的表達量呈明顯的正向線性關(guān)系（P＜0.05）。

圖3 Western blot檢測各組細胞GPSM2與β-catenin蛋白表達Figure 3 Western blot analyses for GPSM2 and β-catenin protein expressions in each group of cells

2.5 Transwell遷移細胞計數(shù)

Transwell實驗結(jié)果顯示，GPSM2轉(zhuǎn)染組的遷移細胞計數(shù)比空白對照組和陰性對照組明顯增多（均P＜0.01），而陰性對照組與空白對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖4）。

圖4 Transwell實驗檢測各組細胞遷移能力 A:光鏡下情況（×100）；B:各組遷移細胞計數(shù)Figure 4 Migration ability in each group of cells by determined Transwell assay A:Views under microscope (×100); B:Numbers of migrated cells in each group

3 討 論

G蛋白偶聯(lián)受體屬于膜蛋白受體，這類受體的立體結(jié)構(gòu)中都有7個跨膜α螺旋，且其肽鏈的C端和連接第5和第6個跨膜螺旋的胞內(nèi)環(huán)上都有G蛋白的結(jié)合位點[13]。據(jù)統(tǒng)計，與G蛋白偶聯(lián)受體密切相關(guān)的疾病為數(shù)眾多，大約有40%的現(xiàn)代藥物是以G蛋白偶聯(lián)受體作為靶點[14-15]。近年新發(fā)現(xiàn)的G蛋白偶聯(lián)受體（蛋白酶激活受體）與消化道腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[16]。GPSM2屬于G蛋白信號調(diào)節(jié)蛋白家族，在人體各組織細胞中廣泛表達，人染色體上的定位區(qū)域為1q31-1q32。McCudden等[17]發(fā)現(xiàn)GPSM2蛋白為G蛋白信號傳導(dǎo)的負調(diào)節(jié)子。有報道[8,18]稱，GPSM2的表達與多種惡性腫瘤的發(fā)病、增殖相關(guān)，如乳腺癌，前列腺癌，尤文肉瘤等。在胰腺癌細胞中GPSM2過表達，其表達水平與腫瘤的分化程度、臨床分期相關(guān)，且腫瘤分化程度越低GPSM2的表達水平越高[10]。

β-catenin是由一條多肽鏈組成的胞質(zhì)糖蛋白，其相對分子量92～95 kD，在人染色體的定位區(qū)域3p21.3-P22，全長為23.2 kb[19]。β-catenin蛋白是Wnt信號通路中的關(guān)鍵分子，當(dāng)Wnt信號異常激活時，β-catenin在胞質(zhì)積聚、細胞核移位，并激活下游的靶基因，從而誘發(fā)多種惡性腫瘤，如胰腺癌、肝癌、乳腺癌、白血病、黑色素瘤等[20]。據(jù)報道[21-22]，在肝癌、結(jié)直腸癌等多種消化道惡性腫瘤細胞中普遍存在著β-catenin基因第三外顯子突變，β-catenin蛋白在這些腫瘤細胞內(nèi)異常聚積。腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力與其黏附性、細胞增殖能力、細胞外基質(zhì)的降解以及腫瘤血管的形成等存在著明顯的相關(guān)性。β-catenin作為黏附蛋白，與E-cadherin結(jié)合形成復(fù)合物后，定位于細胞膜，由此維持著細胞間的黏附性。β-catenin的異常高表達可明顯降低腫瘤細胞間的黏附能力，從而導(dǎo)致腫瘤細胞從其原發(fā)灶中脫落并發(fā)生轉(zhuǎn)移[23]。另有報道[24]稱，β-catenin的異常高表達可使細胞膜完整性受損，并會引起血管內(nèi)皮生長因子的生成增加，從而促進腫瘤細胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。

為了探究GPSM2對胰腺癌遷移能力的影響，本研究通過構(gòu)建GPSM2過表達真核載體，并將其轉(zhuǎn)染人胰腺癌細胞MIA-PaCa-2，RT-PCR和Western-blot分別驗證了在mRNA和蛋白水平有效上調(diào)GPSM2基因。采用Transwell遷移實驗顯示，過表達GPSM2的MIA-PaCa-2穩(wěn)定細胞株較空白對照組及陰性對照組的遷移能力明顯上升。根據(jù)研究結(jié)果得出，GPSM2基因的上調(diào)能顯著提升胰腺癌MIA-PaCa-2細胞的遷移的能力。Western blot檢測顯示過表達GPSM2的MIA-PaCa-2穩(wěn)定細胞株的β-catenin蛋白表達水平較空白對照及陰性對照組顯著上調(diào)。用一元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，各組胰腺癌組織的GPSM2與β-catenin蛋白的表達量呈正向線性關(guān)系。

β-catenin的異常表達在胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用已經(jīng)得到廣泛認同[25-27]，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GPSM2與β-catenin蛋白在胰腺癌細胞中表達的關(guān)聯(lián)性，同時還發(fā)現(xiàn)在胰腺癌MIA-PaCa-2細胞中過表達GPSM2后，胰腺癌細胞的遷移能力明顯增強。由此推測，胰腺癌細胞中GPSM2的過表達能增強β-catenin蛋白的表達，可能由此促進胰腺癌細胞的遷移能力。

因此針對GPSM2設(shè)計治療方案，降低胰腺癌細胞的遷移能力，提高胰腺癌患者生存時間及生活質(zhì)量，可能成為抗胰腺癌藥物研究中新的分子靶點。后續(xù)的研究中，本課題組將增加沉默GPSM2表達的胰腺癌細胞株，進一步驗證GPSM2的過表達可促進胰腺癌細胞的遷移能力。

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