GPSM2過(guò)表達(dá)對(duì)人胰腺癌細(xì)胞遷移能力的影響

魏彪，張建新，崔磊，瞿建國(guó)，錢小寶，黨勝春

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 普通外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001）

近年來(lái)，胰腺癌的全球新發(fā)病例及死亡人數(shù)有明顯上升趨勢(shì)[1]，由于其癥狀不明顯而不易確診等原因，患者確診時(shí)多處于腫瘤晚期。據(jù)統(tǒng)計(jì)，胰腺癌患者5年生存率＜5%，早期即會(huì)發(fā)生周圍組織器官的侵犯或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。降低胰腺癌的轉(zhuǎn)移能力是目前提高患者生存時(shí)間及生活質(zhì)量的重要手段。G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白2（G-protein signaling modulator 2，GPSM2）最初被發(fā)現(xiàn)為調(diào)控細(xì)胞紡錘體的正確定位[3]，維持細(xì)胞的對(duì)稱性分裂[4-6]，在參與細(xì)胞分裂的G2/M期發(fā)揮了重要的功能[7]。Fukukawa等[8]報(bào)道了GPSM2與乳腺癌發(fā)病密切相關(guān)。胰腺癌組織中GPSM2的過(guò)表達(dá)已被證實(shí)，且其表達(dá)水平與腫瘤分化程度、腫瘤臨床分期及胰腺癌患者的預(yù)后息息相關(guān)[9-10]。筆者前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，人胰腺癌MIA-PaCa-2細(xì)胞的GPSM2表達(dá)水平高于其他胰腺癌細(xì)胞株（PANC-1、AsPC-1），且該細(xì)胞株具有高侵襲轉(zhuǎn)移能力[11-12]。本研究將通過(guò)構(gòu)建GPSM2穩(wěn)定高表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞株，并在人胰腺癌MIA-PaCa-2細(xì)胞上鑒定其表達(dá)效率，觀察過(guò)表達(dá)GPSM2的MIA-PaCa-2細(xì)胞遷移能力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

MIA-PaCa-2細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)），真核表達(dá)載體pCMV-Tag 3B、嘌呤霉素質(zhì)粒（中國(guó)碧云天公司），限制性核酸內(nèi)切酶EcoR V和Xho I及T4DNA連接酶（NEB公司），Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)，聚凝胺（吉滿生物有限公司），DNA凝膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司），小量抽提試劑盒（杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司），Opti-MEM（北京索寶來(lái)科技有限公司），胎牛血清（Gibco公司），realtime PCR試劑盒、TRIzol、RNA溶解液（南京百斯凱科技有限公司），小鼠抗人GPSM2抗體、小鼠抗人β-catenin單克隆抗體、兔抗小鼠IgG抗體（江蘇厚普生物技術(shù)科技有限公司），β-actin抗體（Sigma公司），DMEM基高糖礎(chǔ)培養(yǎng)基（Hyclone公司)，所有的引物合成均來(lái)源上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 GPSM2過(guò)表達(dá)真核載體的構(gòu)建及鑒定 按照TRIzol法提取新鮮胰腺癌細(xì)胞的總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒擴(kuò)增cDNA。PCR擴(kuò)增GPSM2序列，并純化回收。根據(jù)GenBank中GPSM2 cDNA序列設(shè)計(jì)并合成引物，設(shè)計(jì)的GPSM2引物上游序列:5'-TGA TAT CAT GGA GGA AAA TTT GA-3'，下游序列:5'-CTC GAG CTA ATG GTC TGC CGAT-3'。在上游引物的5'端加入EcoR V限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，在下游引物5'端加入Xho I限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，下劃線部分為酶切識(shí)別位點(diǎn)。EcoR V和Xho I分別雙酶切GPSM2片段和pCMV-Tag 3B質(zhì)粒后，T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染用氯化鈣法制備的新鮮大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并挑選出陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增，送公司測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序正確后將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pCMV-Tag 3B-GPSM2。

1.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胰腺癌MIA-PaCa-2細(xì)胞及獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株 MIA-PaCa-2胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24 h接種于10 cm培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染前2 h再換用8 mL高糖DMEM新鮮培養(yǎng)基（不含抗生素，含10%FBS），轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度為60%～70%。pCMV-Tag 3B-GPSM2、空載pCMV-Tag 3B分別與嘌呤霉素質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，37 ℃、5%CO2孵育轉(zhuǎn)染細(xì)胞4 h后，換完全培養(yǎng)基。每2天換用含3 μg/mL嘌呤霉素新鮮完全培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染MIAPaCa-2細(xì)胞株45 d。

1.2.3 運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)GPSM2 mRNA的表達(dá)水平 采用TRIzol法分別提取pCMV-Tag 3B-GPSM2轉(zhuǎn)染MIA-PaCa-2細(xì)胞（基因重組組）、pCMV-Tag 3B轉(zhuǎn)染的MIA-PaCa-2細(xì)胞（陰性對(duì)照組）及未轉(zhuǎn)染MIA-PaCa-2細(xì)胞（空白對(duì)照組）的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，變性獲得單鏈cDNA模板。反應(yīng)體系共25 μL，反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，40 個(gè)循環(huán)；然后 72 ℃延伸10 min。PCR引物序列為:GPSM2上游5'-GGC CAT TGA TTA TCA TCT GAA GC-3'，下游5'-TCC TTA CCG TGT TTG AAA GGA A-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為99 bp；內(nèi)參GAPDH上游5'-CCA CTA GGC GCT CAC TGT TC-3'， 下 游5'-AGG CGC CCA ATA CGA CCA A-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為108 bp。

1.2.4 Western blot檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞中GPSM2、β-catenin蛋白表達(dá)水平 將胰腺癌細(xì)胞加入裂解液，置冰上進(jìn)行超聲裂解35～40 min，于4 ℃下12 000 r/min離心15 min，采用碧云天BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度，并進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。取100 μg細(xì)胞總蛋白與上樣緩沖液混合后，經(jīng)100 ℃ 5 min變性后至SDS-PAGE電泳，蛋白被轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉+TBST封閉2 h，加入一抗過(guò)夜（4 ℃），充分洗滌，隨后加入1:2 000稀釋的二抗，室溫下培育1 h；洗滌、DAB顯色、暗室中膠片曝光、顯影、定影后觀察。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞的遷移能力將上述3組胰腺癌細(xì)胞分別采用常規(guī)消化傳代方法，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為2×105/mL。在Chamber下室（即24孔板底部）中加入700 μL含10%血清的培養(yǎng)基，上室加入100 μL細(xì)胞懸液，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)24 h；取出Chamber，吸干上室液體，移到預(yù)先加入800 mL 4%多聚甲醛的孔中，室溫固定20 min；取出Chamber，PBS清洗兩次。再將Chamber移至100%甲醇室溫固定20 min。將Chamber移到預(yù)先加入Giemsa染液的孔中，室溫染色15 min；PBS清洗Chamber，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞；徹底晾干Chamber后，熒光倒置顯微鏡計(jì)數(shù)、拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異采用配對(duì)t檢驗(yàn)，GPSM2與β-catenin蛋白之間的相關(guān)性采用一元線性回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組載體的鑒定

挑取pCMV-Tag 3B-GPSM2載體轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性菌落，接種到含50 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，用小量抽提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提。所得質(zhì)粒用雙酶切鑒定。酶切結(jié)果表明，被切開(kāi)的是陽(yáng)性克隆。并將陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增，送上海英駿測(cè)序顯示重組質(zhì)粒的GPSM2編碼序列與設(shè)計(jì)的片段完全一致，表明pCMV-Tag 3B-GPSM2重組載體構(gòu)建成功（圖1）。

圖1 測(cè)序法鑒定構(gòu)建的重組質(zhì)粒（箭頭所標(biāo)識(shí)的為GPSM2插入位置ATG）Figure 1 Sequencing identi fication of the recombinant plasmids (arrow showing GPSM2 insertion position of ATG codons

2.2 重組穩(wěn)定細(xì)胞株的建立

pCMV-Tag 3B-GPSM2、空載pCMV-Tag 3B分別與嘌呤霉素質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的MIA-PaCa-2細(xì)胞，在含3 μg/mL嘌呤霉素新鮮完全培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)45 d后，存活的細(xì)胞株為重組穩(wěn)定細(xì)胞株。

2.3 RT-PCR驗(yàn)證GPSM2 mRNA的高水平表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，GPSM2轉(zhuǎn)染組的GPSM2 mRNA表達(dá)水平較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組均明顯上調(diào)（圖2）（P＜0.01），與空白對(duì)照組相比，GPSM2基因上調(diào)效率達(dá)到了73.3倍。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組間GPSM2 mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 各組胰腺癌細(xì)胞GPSM2 mRNA的表達(dá)情況Figure 2 The GPSM2 mRNA expressions in each group of pancreatic cancer cells

2.4 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞GPSM2、β-catenin蛋白表達(dá)水平

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，GPSM2轉(zhuǎn)染組的GPSM2、β-catenin蛋白表達(dá)水平均較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯升高（均P＜0.05），而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組間兩種蛋白的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（圖3）。經(jīng)一元線性回歸發(fā)現(xiàn)，各組胰腺癌細(xì)胞的GPSM2與β-catenin蛋白的表達(dá)量呈明顯的正向線性關(guān)系（P＜0.05）。

圖3 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞GPSM2與β-catenin蛋白表達(dá)Figure 3 Western blot analyses for GPSM2 and β-catenin protein expressions in each group of cells

2.5 Transwell遷移細(xì)胞計(jì)數(shù)

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GPSM2轉(zhuǎn)染組的遷移細(xì)胞計(jì)數(shù)比空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯增多（均P＜0.01），而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖4）。

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力 A:光鏡下情況（×100）；B:各組遷移細(xì)胞計(jì)數(shù)Figure 4 Migration ability in each group of cells by determined Transwell assay A:Views under microscope (×100); B:Numbers of migrated cells in each group

3 討 論

G蛋白偶聯(lián)受體屬于膜蛋白受體，這類受體的立體結(jié)構(gòu)中都有7個(gè)跨膜α螺旋，且其肽鏈的C端和連接第5和第6個(gè)跨膜螺旋的胞內(nèi)環(huán)上都有G蛋白的結(jié)合位點(diǎn)[13]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，與G蛋白偶聯(lián)受體密切相關(guān)的疾病為數(shù)眾多，大約有40%的現(xiàn)代藥物是以G蛋白偶聯(lián)受體作為靶點(diǎn)[14-15]。近年新發(fā)現(xiàn)的G蛋白偶聯(lián)受體（蛋白酶激活受體）與消化道腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[16]。GPSM2屬于G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白家族，在人體各組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，人染色體上的定位區(qū)域?yàn)?q31-1q32。McCudden等[17]發(fā)現(xiàn)GPSM2蛋白為G蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)子。有報(bào)道[8,18]稱，GPSM2的表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)病、增殖相關(guān)，如乳腺癌，前列腺癌，尤文肉瘤等。在胰腺癌細(xì)胞中GPSM2過(guò)表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、臨床分期相關(guān)，且腫瘤分化程度越低GPSM2的表達(dá)水平越高[10]。

β-catenin是由一條多肽鏈組成的胞質(zhì)糖蛋白，其相對(duì)分子量92～95 kD，在人染色體的定位區(qū)域3p21.3-P22，全長(zhǎng)為23.2 kb[19]。β-catenin蛋白是Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，當(dāng)Wnt信號(hào)異常激活時(shí)，β-catenin在胞質(zhì)積聚、細(xì)胞核移位，并激活下游的靶基因，從而誘發(fā)多種惡性腫瘤，如胰腺癌、肝癌、乳腺癌、白血病、黑色素瘤等[20]。據(jù)報(bào)道[21-22]，在肝癌、結(jié)直腸癌等多種消化道惡性腫瘤細(xì)胞中普遍存在著β-catenin基因第三外顯子突變，β-catenin蛋白在這些腫瘤細(xì)胞內(nèi)異常聚積。腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力與其黏附性、細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞外基質(zhì)的降解以及腫瘤血管的形成等存在著明顯的相關(guān)性。β-catenin作為黏附蛋白，與E-cadherin結(jié)合形成復(fù)合物后，定位于細(xì)胞膜，由此維持著細(xì)胞間的黏附性。β-catenin的異常高表達(dá)可明顯降低腫瘤細(xì)胞間的黏附能力，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞從其原發(fā)灶中脫落并發(fā)生轉(zhuǎn)移[23]。另有報(bào)道[24]稱，β-catenin的異常高表達(dá)可使細(xì)胞膜完整性受損，并會(huì)引起血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的生成增加，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。

為了探究GPSM2對(duì)胰腺癌遷移能力的影響，本研究通過(guò)構(gòu)建GPSM2過(guò)表達(dá)真核載體，并將其轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞MIA-PaCa-2，RT-PCR和Western-blot分別驗(yàn)證了在mRNA和蛋白水平有效上調(diào)GPSM2基因。采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示，過(guò)表達(dá)GPSM2的MIA-PaCa-2穩(wěn)定細(xì)胞株較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組的遷移能力明顯上升。根據(jù)研究結(jié)果得出，GPSM2基因的上調(diào)能顯著提升胰腺癌MIA-PaCa-2細(xì)胞的遷移的能力。Western blot檢測(cè)顯示過(guò)表達(dá)GPSM2的MIA-PaCa-2穩(wěn)定細(xì)胞株的β-catenin蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照及陰性對(duì)照組顯著上調(diào)。用一元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，各組胰腺癌組織的GPSM2與β-catenin蛋白的表達(dá)量呈正向線性關(guān)系。

β-catenin的異常表達(dá)在胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用已經(jīng)得到廣泛認(rèn)同[25-27]，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GPSM2與β-catenin蛋白在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)的關(guān)聯(lián)性，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在胰腺癌MIA-PaCa-2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)GPSM2后，胰腺癌細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)。由此推測(cè)，胰腺癌細(xì)胞中GPSM2的過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)β-catenin蛋白的表達(dá)，可能由此促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移能力。

因此針對(duì)GPSM2設(shè)計(jì)治療方案，降低胰腺癌細(xì)胞的遷移能力，提高胰腺癌患者生存時(shí)間及生活質(zhì)量，可能成為抗胰腺癌藥物研究中新的分子靶點(diǎn)。后續(xù)的研究中，本課題組將增加沉默GPSM2表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞株，進(jìn)一步驗(yàn)證GPSM2的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移能力。

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