循環(huán)腫瘤細(xì)胞對胰腺癌診斷價值的Meta分析

吳斌，陳敏捷，陳飛，吳紹漢，王曉光，鐘征翔

（1.泰山醫(yī)學(xué)院 研究生院，山東 泰安 271000；2.浙江省嘉興市第二醫(yī)院 肝膽外科，浙江 嘉興 314000）

目前，胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，它的發(fā)病率在國內(nèi)外均成升高趨勢，其5年生存率＜5%[1]，且多數(shù)胰腺癌患者在有效診斷之前就發(fā)展到中晚期，僅有15%的胰腺癌患者具有手術(shù)切除指征[2]。這些問題均歸咎于當(dāng)前尚沒有哪一種檢查方法能集高敏感性、高特異性和低費用于一體而應(yīng)用于臨床。在胰腺癌發(fā)病的早期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移前，患者外周血中可以檢測到胰腺來源的腫瘤細(xì)胞，其亦可種植到胰腺外的部位，這些腫瘤細(xì)胞很可能是從原發(fā)的腫瘤上脫落下來進(jìn)入外周循環(huán)[3]，并形成微轉(zhuǎn)移灶[4]。Ashworth于1869年首次提出外周循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）的概念[5]，亦有學(xué)者稱之為“微小殘存病灶”。CTCs檢測被認(rèn)為是一種“液體活檢”[6]，更因為其方便無創(chuàng)的特點也被稱為“real-time biopsy”[7]。目前CTCs檢測已運用于乳腺癌的診斷、預(yù)后判斷等方面[8]。同樣，若能夠在胰腺癌患者中開展CTCs檢測，將對胰腺癌的診斷具有重大意義。雖然目前有文獻(xiàn)表明CTCs與胰腺癌預(yù)后相關(guān)[9-10]，但是目前胰腺癌CTCs技術(shù)未完全成熟，關(guān)于CTCs檢測對胰腺癌診斷的研究結(jié)果差異較大，結(jié)果難以令人完全信服。為此，為開展更多的臨床應(yīng)用研究提供理論依據(jù)，本研究收集國內(nèi)外有關(guān)CTCs對胰腺癌診斷價值的文獻(xiàn)并進(jìn)行Meta分析。

1 資料與方法

1.1 資料檢索

計算機(jī)檢索PubMed、Cochrane Library、Embase、萬方、中國知網(wǎng)、維普等中英文數(shù)據(jù)庫，檢索范圍從其建庫至2016年8月31日，文獻(xiàn)檢索策略采用主題詞和自由詞結(jié)合的原則，中文檢索詞為:循環(huán)腫瘤細(xì)胞、胰腺癌、胰腺腫瘤等；英文檢索詞為:CTCs、Circulating Tumor Cells、Pancreatic Cancer、Pancreatic Neoplasm等，并手工檢索納入文獻(xiàn)的參考文獻(xiàn)以發(fā)現(xiàn)潛在符合納入標(biāo)準(zhǔn)的研究。

1.2 文獻(xiàn)納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ⑴ 試驗類型:應(yīng)用檢測CTCs的方法診斷胰腺癌的試驗研究；⑵ 研究對象:試驗組為胰腺癌患者，對照組為非胰腺癌組（包括非胰腺癌胰腺疾病患者組或健康人組）；⑶ 金標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定:以病理組織學(xué)檢查和病理細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果作為診斷金標(biāo)準(zhǔn)；⑷ 已公開發(fā)表并且能獲取全文文獻(xiàn)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ⑴ 金標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定不是病理組織學(xué)結(jié)果；⑵ 文獻(xiàn)信息量太少，無法從文獻(xiàn)全文獲得完整的診斷四格表數(shù)據(jù)，聯(lián)系文章作者未果的研究文獻(xiàn)；⑶ 同一作者重復(fù)發(fā)表的研究。

1.3 數(shù)據(jù)提取

采用統(tǒng)一制定的數(shù)據(jù)收集表，提取納入文獻(xiàn)數(shù)據(jù)資料，主要數(shù)據(jù)信息包括:第一作者、發(fā)表時間、國家、分離富集方法、檢測鑒定方法、TP（真陽性率/敏感度）、FP（假陽性率/誤診率）、FN（假陰性率/漏診率）、TN（真異性率/特異度）、診斷標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)量等級、胰腺癌組人數(shù)、非胰腺癌組人數(shù)等。如存在爭議，通過與第三方討論解決分。

1.4 納入文獻(xiàn)質(zhì)量評分

根據(jù)QUADAS[11]（Quality Assessment of Diagnostic Accuracy Studies）評分量表 分別對納入文獻(xiàn)的質(zhì)量進(jìn)行評價。QUADAS中14 個條目逐一評價文獻(xiàn)質(zhì)量，評價標(biāo)準(zhǔn)包含“是”、“否”、“不清楚”，其中“是”為達(dá)到此項標(biāo)準(zhǔn)，記1分；“否”為未達(dá)到或未提及，記-1分；“不清楚”為部分達(dá)到或從文獻(xiàn)中無法得到足夠信息的，記0分，總分≥7的視為文獻(xiàn)質(zhì)量較高，具體評價方法參考曾玉等[12]的研究。本次研究由2名評價者獨立評價，若評價不一致者經(jīng)討論決定。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

本次Meta分析主要參考診斷試驗Meta分析手冊[13]，首先檢驗各研究間異質(zhì)性大小，采用Cochran Q檢驗進(jìn)行評價，若P＜0.05提示異質(zhì)性顯著。此外，采用I2檢驗定量評估異質(zhì)性大小，I2值介于0～100%，I2值越大提示異質(zhì)性越明顯。如果各研究不存在顯著異質(zhì)性，則采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析；如果異質(zhì)性檢驗P＜0.05或者I2＞50%則提示各研究間有顯著異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型法分析[14]。探索其異質(zhì)性來源，閾值效應(yīng)是診斷性試驗異質(zhì)性的主要來源之一，做診斷優(yōu)勢比（DOR）效應(yīng)量的受試者工作特征曲線（ROC）散點圖及Spearman相關(guān)系數(shù)判斷有無閾值效應(yīng)，若無閾值效應(yīng)，則Meta回歸初步探索非閾值效應(yīng)異質(zhì)性的來源，再亞組分析以探索各亞組間異質(zhì)性來源，并逐一刪除納入的研究進(jìn)行敏感性分析以評價單個研究對總體的影響。最后采用Deek漏斗圖分析納入文獻(xiàn)有無存在發(fā)表偏移以評價原始文獻(xiàn)的真實可靠性，本文運用的統(tǒng)計學(xué)軟件:Metadisc 1.4和Stata 12.0。

2 結(jié) 果

2.1 文獻(xiàn)基本特征

共檢索到950篇中英文文獻(xiàn)，經(jīng)過閱讀標(biāo)題和摘要篩選得61篇文獻(xiàn)，再閱讀全文后，依照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，最終有19篇[6,15-32]文獻(xiàn)符合要求（圖1），包括693例胰腺癌患者和406例非胰腺癌患者（表1）。

圖1 文獻(xiàn)檢索流程Figure 1 Literature searching process

表1 納入研究文獻(xiàn)的特征Table 1 Table 1 General features of the included studies

2.2 異質(zhì)性檢驗

對研究進(jìn)行異質(zhì)性檢驗得到DOR森林圖（圖2），各研究間有明顯異質(zhì)性（Cochran-Q=51.31，P=0.0000，I2=64.9%），故采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行分析。分析其異質(zhì)性的來源，閾值效應(yīng)是診斷試驗的異質(zhì)性最基本來源之一，本研究得到ROC散點圖不呈“肩臂狀（shoulder arm）”樣式（圖3）；Spearman相關(guān)分析表明研究間不存在閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性（r=0.419，P=0.074）。然后對其他來源異質(zhì)性進(jìn)行檢驗，本研究中的非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性來源可能來自:⑴ 不同的CTCs分離、富集方法；⑵ 不同的CTCs檢測、鑒定方法；⑶ 不同的對照組組成；⑷ 種族。

2.3 Meta回歸分析

對于非閾值引起的異質(zhì)性采用Meta回歸分的組成析的方法初步探討異質(zhì)性的來源。按照P＜0.1即可認(rèn)為該因素可能為異質(zhì)性的主要來源的標(biāo)準(zhǔn)，得出不同的對照組（P=0.0257），可能是研究間異質(zhì)性的主要來源（表2）。

圖2 DOR森林圖Figure 2 Forest plot for DOR

圖3 SROC曲線散點圖Figure 3 Scatter plot of SROC analysis

表2 Meta回歸分析Table 2 Meta-regression analysis

2.4 亞組分析

2.4.1 對照組的組成 將對照組分成3組，A組:只有健康人群；B組只有非胰腺癌疾病患者；C組:包含健康人和非胰腺癌疾病。A組共納入研究11篇，組內(nèi)各個研究間不存在異質(zhì)性（Cochran-Q=0.79，P=0.9999，I2=0.0%）；B組共納入文獻(xiàn)4篇，組內(nèi)各個研究間不存在異質(zhì)性（Cochran-Q=2.50，P=0.4745，I2=0.0%）；C組共納入文獻(xiàn)4篇，組內(nèi)各個研究間有異質(zhì)性（Cochran-Q=8.21，P=0.0419，I2=63.4%），亞組DOR森林圖（圖4）。結(jié)合Meta回歸分析結(jié)果對照組:主要影響因素，P=0.0257＜0.10，得出不同對照組的組成很可能是各研究間異質(zhì)性的主要來源，但也不排除C組的組內(nèi)差異造成了全部研究的異質(zhì)性。該亞組分析表明CTCs檢測在健康人群中和其他胰腺疾病中區(qū)分胰腺癌患者的診斷效應(yīng)即DOR是存在差異的，CTCs檢測在各種胰腺疾病患者中診斷出胰腺癌患者的效能比在健康對照中要低，表明存在著較大的假陽性率或者假陰性率。

2.4.2 CTCs分離、富集方法 CTCs分離、富集系統(tǒng)主要有兩種[33]，一種是基于形態(tài)學(xué)的方法，包括密度梯度離心法和膜濾過分離法，另一種是基于免疫學(xué)分離方法。納入文獻(xiàn)中Screencell、密度梯度離心法歸為A組，CellSearch、GEM chip、GEDI chip、免疫磁珠法等歸為B組。A組共納入研究5篇，Cochran-Q=12.85，P=0.012，I2=68.9%，表明A組內(nèi)異質(zhì)性很大，可能由于基于膜過濾技術(shù)的CellSearch系統(tǒng)，可能由于循環(huán)腫瘤細(xì)胞直徑差異較大，造成結(jié)果的不穩(wěn)定，或者密度梯度離心法密度分層的不確定性造成。B組共納入研究14篇，Cochran-Q=4.49，P=0.9848，I2=0%，表明B組內(nèi)不存在異質(zhì)性，表明這幾種基于免疫學(xué)方法的各種裝置分離、富集CTCs的表現(xiàn)差異不大、較穩(wěn)定。分離、富集方法亞組DOR森林圖（圖5）。

圖4 對照組的組成亞組分析Figure 4 Subgroup analysis of composition of control group

圖5 分離、富集方法亞組分析Figure 5 Subgroup analysis of separation and enrichment methods

2.4.3 CTC檢測、鑒定方法 常用的有核酸檢測法和細(xì)胞計數(shù)法兩種方法，前者有逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR），后者包括免疫細(xì)胞化 學(xué) 法（immunocytochemistry，ICC）、 流式細(xì)胞術(shù)、原位雜交技術(shù)（FISH）和Giemsa染色法等。A組:細(xì)胞計數(shù)法；B組:核酸檢測法。A組納入13篇文獻(xiàn)，各研究間存在明顯異質(zhì)性（Cochran-Q=30.76，P=0.0021，I2=61.0%），分析原因可能為:⑴ 細(xì)胞計數(shù)法包括流式細(xì)胞儀法、免疫熒光法、Giemsa染色法等，各種方法檢測效能相差較大；⑵ 免疫熒光法和Giemsa染色法等受觀察者主觀影響較大。B組納入6篇文獻(xiàn)，組內(nèi)存在明顯異質(zhì)性（Cochran-Q=19.69，P=0.0014，I2=74.6%），可能由于各研究PCR選取的目的基因不同所造成，檢測、鑒定亞組DOR森林圖（圖6）。

2.4.4 種族 將納入研究分為兩組:歐美人群組與亞洲人群組。歐美人群組共納入研究8篇，歐美組不同研究間異質(zhì)性較明顯（Cochran-Q=22.59，P=0.0020，I2=69.5%），可能由于歐美人群較分散，且歐美人群之間遺傳等存在差異所造成。亞洲人群組共納入研究11篇，組內(nèi)各個研究間無異質(zhì)性（Cochran-Q=2.19，P=0.9947，I2=0%），回顧文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)目前胰腺癌CTCs研究主要集中在中國、日本、韓國等東北亞地區(qū)，人群種族相似度較高，幾乎無種族異質(zhì)性。種族亞組森林圖（圖7）。

圖6 檢測、鑒定亞組分析Figure 6 Subgroup analysis of detection and ident ification methods

圖7 種族亞組分析Figure 7 Subgroup analysis of race

2.5 敏感性分析

將每個研究逐一排除后，重新估計合并效應(yīng)量，并與未排除前的Meta分析結(jié)果進(jìn)行比較，探討該研究對合并效應(yīng)量影響程度及結(jié)果穩(wěn)健性。若排除后加過發(fā)生大的變化，說明敏感性高，結(jié)果的穩(wěn)健性較低。本文用stata 12.0軟件做出敏感性分析（圖8），顯示分別剔除研究10、11的研究后，對結(jié)果影響較大，提示研究不穩(wěn)定。究其原因:研究10采用了Screencell+Giemsa染色細(xì)胞計數(shù)的方法，有文獻(xiàn)報道單獨采用Giemsa染色進(jìn)行CTCs細(xì)胞計數(shù)準(zhǔn)確性不高，此外，該研究病例數(shù)較多，所占權(quán)重較大，對合并結(jié)果影響大。研究11研究對象的是老年胰腺癌患者，與其他研究存在差異。

2.6 合并統(tǒng)計量

因各納入研究間存在由非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性，故采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析，結(jié)果CTCs診斷胰腺癌的合并敏感性為0.67（95% CI= 0.63～0.60），合并特異性為0.94（95% CI=0.91～0.96），DOR為50.47（95% CI=20.13～126.55），合并+LR（陽性似然比）為11.15（95% CI=5.42～22.95），合并-LR（陰性似然比）為0.36（95% CI=0.28～0.45），SROC曲線下面積總AUC為0.93，Q*值為0.03（圖8）。

2.7 發(fā)表偏倚評價

發(fā)表偏倚主要是指有統(tǒng)計學(xué)意義的研究結(jié)果比無統(tǒng)計學(xué)意義的研究更容易被投稿和發(fā)表[34]。應(yīng)用Stata 12.0軟件繪診斷性試驗Deek漏斗圖（圖9），回歸直線與DOR軸的夾角偏離90°，Bias為14.122 86（P=0.240），表明納入研究間存在發(fā)表偏倚。

圖8 敏感性分析結(jié)果Figure 8 Results of sensitivity analysis

圖9 Deek's漏斗圖評價表達(dá)偏倚Figure 9 Deek’s funnel plot of publication bias

3 討 論

胰腺癌作為一種高度惡性的腫瘤，由于起病隱匿，是目前預(yù)后最差的惡性腫瘤之一[35]，胰腺癌的早期發(fā)現(xiàn)和早期干預(yù)顯得尤為重要。目前常用的診斷方法有B超、CT、MRI、EUS，血清學(xué)腫瘤標(biāo)記物如CA19-9等[36]。有研究[37]將CA19-9的免疫定量分析作為胰腺癌檢測的常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)，但是CA19-9的升高在非惡性腫瘤中也會出現(xiàn)，如急性胰腺炎、胃腸道腫瘤、梗阻性黃疸等，假陽性率較高，所以傳統(tǒng)的CA19-9可能不是一種最理想的腫瘤標(biāo)記物。有研究表明CTCs檢測在胰腺癌中的敏感度很高，如Soeth等[38]的研究中敏感性可達(dá)0.89（81/91），Nagrath等[39]的研究中敏感性可達(dá)1（15/15）。目前，CellSearch檢測系統(tǒng)已被美國食品和藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)應(yīng)用于乳腺癌、直腸癌、前列腺癌[40]的診治，由此看來CTCs作為一種新興技術(shù)也有望成為胰腺癌的有效診斷方法，但是目前CTCs技術(shù)仍層次不齊，對胰腺癌的診斷效能仍未明確。

本研究經(jīng)文獻(xiàn)檢索共19篇文獻(xiàn)納入研究，包括1 099例研究對象，693例胰腺癌患者，406例非胰腺癌患者，按QUADAS質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)評價文獻(xiàn)質(zhì)量，文獻(xiàn)質(zhì)量中等。異質(zhì)性檢驗示存在除閾值效應(yīng)外的較明顯異質(zhì)性，Meta回歸和亞組分析提示不同對照組的組成可能是異質(zhì)性的主要來源，敏感性分析得出Cauley等[23]和朱國棟等[24]兩個研究敏感性較大，對結(jié)果影響大。采用隨機(jī)效應(yīng)模型合并統(tǒng)計量得出外周循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測對胰腺癌檢出的敏感性為0.67（95% CI=0.63～0.60），特異性為0.94（95% CI=0.91～0.96），DOR為50.47（95% CI=20.13～126.55），+LR為11.15（95% CI=5.42～22.95），-LR為0.36（95% CI=0.28～0.45），敏感性中等，特異性較高，本研究的合并敏感度不理想，分析原因可能是研究人群的不同，檢測方法不同所致，本研究敏感性分析中Cauley等[23]的研究對合并敏感性影響也較大，因為這兩個研究患者例數(shù)較多，所占權(quán)重較大，剔除這個研究后合并敏感性為0.72（95% CI=0.68～0.76）。診斷性試驗Deek漏斗圖顯示存在發(fā)表偏倚，因CTCs作為一種新興技術(shù)運用在胰腺癌中仍不完全成熟，多種胰腺癌CTCs技術(shù)仍處于研究階段，這造成了某些未取得進(jìn)展的研究沒有發(fā)表出來，從而引起發(fā)表偏倚，筆者認(rèn)為本次分析得到的結(jié)果對于所有胰腺癌CTCs（包括未發(fā)表研究）研究來說仍較樂觀。

由上可知，CTCs檢測單獨作為胰腺癌早期診斷指標(biāo)尚有不足，可以作為胰腺癌早期診斷檢測方法的重要補(bǔ)充，是胰腺癌診斷的可選檢查方法，隨著技術(shù)的發(fā)展，更加有效的CTCs捕獲技術(shù)和檢測技術(shù)出現(xiàn)，CTCs檢測的敏感性有望大大提高，結(jié)合極高的特異度成為胰腺癌的有效早期診斷方法。

本研究存在以下局限性:⑴ 由于有對照組的關(guān)于胰腺癌CTCs的研究文獻(xiàn)較少，病例數(shù)較少，并且個別研究權(quán)重較大，對最終合并結(jié)果的影響較大；⑵ 納入文獻(xiàn)中有15個研究的對照組含有招募的健康人群，可能會影響試驗數(shù)據(jù)的穩(wěn)定、可靠；⑶ 僅有1個研究采用了前瞻性研究，其18個研究均為回顧性研究；⑷ 各個研究試驗設(shè)計、試驗方法、試驗試劑、試驗儀器不同，可能會導(dǎo)致研究間的異質(zhì)性。

綜上所述，Meta分析提示外周CTCs檢測可作為胰腺癌的診斷方法，但是受納入研究質(zhì)量和數(shù)量限制，目前尚無充足的證據(jù)證明可將CTCs檢測單獨作為胰腺癌早期診斷指標(biāo)并應(yīng)用于臨床。因此，需要納入更多高質(zhì)量的隨機(jī)對照試驗進(jìn)行更有效的評價，有理由相信，CTCs檢測將成為胰腺癌診治中的一個熱點。

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