泛素化修飾在鹽敏感性高血壓發(fā)生發(fā)展中的分子機制研究進(jìn)展

袁玉婷

北京大學(xué)國際醫(yī)院心內(nèi)科(北京 102206)

·綜 述·

泛素化修飾在鹽敏感性高血壓發(fā)生發(fā)展中的分子機制研究進(jìn)展

袁玉婷

北京大學(xué)國際醫(yī)院心內(nèi)科(北京 102206)

泛素化修飾在鹽敏感性高血壓發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，通過參與介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解，調(diào)控細(xì)胞活動，影響與血清離子代謝相關(guān)通道如ENaC、鈉氯共轉(zhuǎn)運、腎臟外髓鉀離子通道、氯共轉(zhuǎn)運體的表達(dá)與作用，同時還參與動脈硬化、腎小管損傷、高糖所致血管損傷等病變，導(dǎo)致鹽敏感性高血壓發(fā)生與發(fā)展。

我國高血壓發(fā)病率約為20%，因人口平均年齡增長、吸煙人群比率上升等原因，發(fā)病率仍呈上升趨勢[1-2]。鹽敏感高血壓是指高鹽攝入后鈉潴留、血壓顯著上升的一類特殊性高血壓，高鹽攝入是血壓上升的獨立危險因素。鹽敏感性高血壓具有其特殊的發(fā)病機制、臨床特征，腎素-血管緊張素系統(tǒng)在其中發(fā)揮重要作用[3]。泛素是一種由76個氨基酸構(gòu)成的多肽，廣泛存在于真核生物中，具有高度保守性，泛素化修飾是指泛素分子在系列酶的作用下與蛋白質(zhì)共價結(jié)合的過程，廣泛參與介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解，幾乎調(diào)控所有的細(xì)胞活動，與人類重大疾病發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。本次研究試就泛素化修飾在鹽敏感性高血壓發(fā)生發(fā)展中的分子機制研究進(jìn)展進(jìn)行概述。

1 泛素-蛋白酶體系統(tǒng) 泛素化修飾整個過程涉及泛素分子、底物蛋白、多種酶系統(tǒng)、泛素結(jié)合酶等，共同構(gòu)成了泛素-蛋白酶體系統(tǒng)。參與了真核生物體內(nèi)80%～85%的蛋白質(zhì)降解，具有ATP依賴、高效、高度選擇性特點，具有標(biāo)記靶蛋白、轉(zhuǎn)錄因子活性、逆轉(zhuǎn)錄病毒出芽、調(diào)節(jié)胰島素水平、調(diào)控TGF-β通路等作用，參與系統(tǒng)基因表達(dá)、增殖、分化、衰老、凋亡與自噬，調(diào)控個體生長、發(fā)育與衰老等生物活動。底物蛋白廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)，泛素化修飾因此還能參與DNA損傷修復(fù)、免疫應(yīng)答等生物化學(xué)作用。泛素化修飾通過位點實現(xiàn)特異性作用。在鹽敏感性高血壓中，其主要通過參與離子通道、腎素-血管緊張素系統(tǒng)作用，影響鹽敏感性高血壓的發(fā)生與變化。

2 泛素化修飾與ENaC 腎臟中，ENaC分布在遠(yuǎn)曲小管末端、連接小管和集合管的膜表面，與鈉的重吸收、血壓調(diào)控關(guān)系密切，是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的重要組成部分。前文提到泛素化修飾廣泛參與生物細(xì)胞的活動。有證據(jù)顯示，ENaC可能與遺傳性高血壓有關(guān)，影響鹽敏感性，若出現(xiàn)功能紊亂，則在攝入高鹽后，容易出現(xiàn)離子重吸收障礙，進(jìn)而導(dǎo)致血壓上升。泛素連接酶E3 NEDD4L家族參與調(diào)控ENaC的表達(dá)，在維持細(xì)胞內(nèi)外鈉離子平衡方面發(fā)揮重要作用。臨床研究證實，Liddle綜合征與ENaC-NEDD4l-蛋白酶體系基因突變有關(guān)，一項針對人的基因多態(tài)性研究顯示，Nedd4l基因的單核酸多態(tài)性與高血壓關(guān)系密切。動物實驗研究證實鹽敏感小鼠和鹽抵抗小鼠腎臟遠(yuǎn)端小管Nedd4l表達(dá)存在顯著差異。另一項動物實驗證實，膜表面NEDD4-2數(shù)量受醛固酮水平、鈉鹽飲食影響[4]。O.Staub等發(fā)現(xiàn)，Liddle綜合征患者NEDD4-2通過WW結(jié)構(gòu)域與ENaC的PY結(jié)構(gòu)域結(jié)合介導(dǎo)ENaC的泛素化修飾，從而加速ENaC細(xì)胞活動，加速細(xì)胞凋亡，減少表達(dá)水平，引起ENaC功能紊亂，最終引起高血壓[5]?；蚯贸龑嶒炦M(jìn)一步證實了泛素化特異性修飾對ENac表達(dá)的影響[6]。NEDD4-2對EnaC的泛素化作用受激素影響，醛固酮可誘導(dǎo)血清和糖皮質(zhì)激素參與蛋白激酶的合成，競爭性抑制NEDD4-2與ENac結(jié)合，減弱了ENac泛素化修飾。最新的研究發(fā)現(xiàn)，ENaC的N端賴氨酸是泛素化、乙酰化的共同位點，組蛋白脫乙酰酶抑制劑曲古抑菌素A能夠糾正α/β/γ-ENaC的乙?；?，增加膜表面EnaC數(shù)量，這一發(fā)現(xiàn)為靶點藥物的研發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

3 泛素化修飾與鈉氯共轉(zhuǎn)運體 鈉氯共轉(zhuǎn)運體(NCC)是影響鹽敏感性高血液的重要物質(zhì)，位于腎臟遠(yuǎn)曲小管影響鈉離子、氯離子的重吸收。NCC基因失活會導(dǎo)致低鈣低鉀性低血壓綜合征，過度激活，則會導(dǎo)致家族性高鉀性高血壓Gordon綜合征。NCC的泛素化修飾主要為泛素連接酶E3,主要受NEDD4-2、KLHL3-CUL3調(diào)控。很早學(xué)術(shù)界便認(rèn)識到NEDD4-2對NCC存在顯著影響，基因敲除實驗陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了sgk1等定點泛素化修飾對NCC表達(dá)影響，體外研究證實激活NEK293細(xì)胞，能夠上調(diào)NCC表達(dá)激活其活性。但目前尚無有關(guān)于HECT-E3人體、臨床研究證實NCC與泛素化修飾的具體作用機制研究。國內(nèi)外陸續(xù)報道證實致病基因的突變會導(dǎo)致Gordon綜合征。KLHL3-CUL3泛素連接酶復(fù)合靶向作用于WNK激酶后者通過磷酸化激活SPS-1相關(guān)的氧化應(yīng)激反應(yīng)激酶，磷酸化SPAK-OSR1，從而調(diào)控NCC在遠(yuǎn)曲小管上的表達(dá)。SPAK全基因敲除小鼠、小鼠模型也證實SPAK對NCC的調(diào)控作用，SPAK在基因敲出后無法得到有效的補償，提示其在NCC磷酸化、活性調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。

4 泛素化修飾與腎臟外髓鉀離子通道 腎臟外髓鉀離子通道是一種ATP依賴性鉀離子分泌通道，直接影響鉀離子的分泌，從而影響人體對高鹽飲食的敏感性。研究證實，PHAⅡ高血壓與KLHL3-CUL3泛素連接酶E3復(fù)合酶突變關(guān)系密切，免疫共沉實驗發(fā)現(xiàn)，后者與底物WNK4靶向結(jié)合，結(jié)合后促網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)ROMK細(xì)胞內(nèi)吞，從而抑制腎臟外髓鉀離子通道在細(xì)胞膜表面的表達(dá)，調(diào)節(jié)鉀離子分泌。動物實驗證實，對小鼠進(jìn)行WNK4特異性抗體染色，結(jié)果顯示出現(xiàn)WNK4泛素化修飾與降解異常，腎臟外髓鉀離子通道調(diào)控市場。需注意的是，目前針對WNK4對腎臟外髓鉀離子通道的抑制作用機制尚未被完成闡明，可能與下游SPAK通路有關(guān)。

5 泛素與轉(zhuǎn)運體 泛素與Na+-K+-2CL-共轉(zhuǎn)運體(NKCC2)在髓端升支粗段細(xì)胞頂端膜中表達(dá)，調(diào)控Na+、Cl-的重吸收，相關(guān)特異性抑制劑已被用于抗高血壓的治療。動物研究證實，高鹽飲食實驗的CYP4F2轉(zhuǎn)基因小鼠的NKCC2、NEDD4-2結(jié)合增加，相較于野生的小鼠，其腎臟NKCC2蛋白表達(dá)明顯下降，同時采用20-HETE合成抑制劑可起到糾正作用。Y等較早的一項實驗發(fā)現(xiàn)，EEDD4-2是人類NHE3通道的泛素連接酶，在PS120纖維原細(xì)胞周利用慢病毒shRNA使Nedd-42基因沉默，結(jié)果顯示人類NHE3表達(dá)下調(diào)，同時動物實驗發(fā)現(xiàn)，這種方法不能使小鼠、家兔表達(dá)下調(diào)。另有實驗發(fā)現(xiàn)，rNHF3活性不受shNEDD4-2處理影響。誘導(dǎo)NEDD-4突變，發(fā)現(xiàn)其對NHE3泛素化主要依賴于PY結(jié)構(gòu)域，這種結(jié)構(gòu)域僅存在于靈長類動物中，與前文中的小鼠、兔表達(dá)不受影響相吻合。高血壓患者為代償性的減少Na+負(fù)荷，NHE3通道會從膜表面進(jìn)行例子重排，NEDD4-2會調(diào)節(jié)hNHE3的吞噬作用。NHE3的降解影響因素較大，動物研究顯示阿齊沙坦等血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑，相較于空白小鼠、坎地沙坦在切除部分腎后，排鈉量明顯上升，排除曲線顯示阿齊沙坦具有明顯的鈉潴留作用，與此同時其血壓下降更為顯著。動物實驗證實，阿齊沙坦可能通過誘導(dǎo)NHE3表達(dá)下調(diào)，增加NHE3泛素化水平，提高鈉離子敏感性，從而發(fā)揮降壓作用。

6 其 他 前文的研究，主要針對泛素化在離子代謝通道相關(guān)調(diào)控作用，通過調(diào)節(jié)吞噬作用，影響表達(dá)，從而影響離子代謝，在許多高鹽敏感性高血壓中被檢出泛素化、連接酶相關(guān)基因表達(dá)異常。泛素化還通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等作用，參與炎癥反應(yīng)、高血糖所致腎小管損傷等途徑，影響高血壓的發(fā)生、進(jìn)展。目前，已有許多泛素-蛋白酶體抑制劑用于臨床，并成為防治動脈硬化的重要藥物。這些抑制劑主要包括：①天然的蛋白酶體抑制劑，如乳胞素、3，4-二氯異香豆素(DCI)、PR-30等。以PR-39為例，是一種富含精氨酸/脯氨酸的多肽，具有可逆性；②合成的蛋白酶抑制劑，如肽醛類化合物，如MG132、MG115等，這類化合物選擇性、穩(wěn)定性差，強度低，但選擇性較高，應(yīng)用廣，硼酸肽類抑制劑，多為二肽硼酸衍生物，如硼替佐米已被批準(zhǔn)用于多發(fā)性骨髓瘤的治療。動脈硬化是高血壓的重要原因，與高血壓互為因果，在鹽敏感性高血壓發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，研究證實其實血管損傷后炎癥性反應(yīng)。血管炎癥因子以核因子kB研究最多，NF-kB的活化形式只存在于細(xì)胞核提取物種，與其抑制蛋白結(jié)合，以穩(wěn)定的無活性形式存在，當(dāng)細(xì)胞受到外來的刺激時，I-kB激酶被激活，其先被磷酸化、泛素化，而后被降解，快速解離釋放，進(jìn)而NF-kB易位至細(xì)胞核，指導(dǎo)cAMP反應(yīng)元件和結(jié)合蛋白(CREB)和結(jié)合蛋白基因轉(zhuǎn)錄。理論上，通過控制相關(guān)磷酸酶，從而調(diào)節(jié)NF-kB，抑制NF-kB活化，通過抑制I-kB蛋白講解，使的NF-kB無法進(jìn)入細(xì)胞核，從而發(fā)揮抗炎作用，抑制動脈硬化。

7 小 結(jié) 泛素化參與的細(xì)胞生活活動十分復(fù)雜，通過直接以及間接作用，影響鹽敏感性高血壓發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)歸，已有針對泛素化-蛋白酶體的用于治療高血壓的靶點藥物應(yīng)用于市場。目前高鹽敏感性高血壓的患者占高血壓患者的比重較低，基因變異引起的高鹽敏感性高血壓分子生物學(xué)研究集中在動物模型上。而高鹽飲食高血壓患者較多，高鹽飲食對相關(guān)泛素化-蛋白酶體系統(tǒng)的影響較大，相關(guān)泛素化-蛋白酶體系統(tǒng)可自適應(yīng)性的調(diào)節(jié)相關(guān)分子生物通道的功能，從而參與高血壓的發(fā)生、進(jìn)展，這是今后研究的重點。

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(收稿：2017-01-14)

高血壓 @泛素化修飾 分子生物學(xué)

R544.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.08.081