磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3在肝細(xì)胞肝癌病理診斷中的價值及應(yīng)用

路翔宇，龔 軍，許 建，熊 偉，俞小炯(1.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 61007；.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院肝膽外科，四川 成都 61007)

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3在肝細(xì)胞肝癌病理診斷中的價值及應(yīng)用

路翔宇1，2，龔 軍2，許 建2，熊 偉2，俞小炯2
(1.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610072；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院肝膽外科，四川 成都 610072)

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的明確診斷主要依靠組織病理學(xué)和臨床影像學(xué)檢查，而鑒別診斷需要免疫組化標(biāo)記物輔助確診。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)是一種廣泛應(yīng)用于肝細(xì)胞肝癌免疫組化的標(biāo)記物。隨著對GPC-3研究的深入，發(fā)現(xiàn)它不僅在血清有表達(dá)，同樣在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)。根據(jù)GPC-3在肝細(xì)胞肝癌及癌旁組織的表達(dá)情況，我們更新關(guān)于GPC-3在正常和腫瘤組織中的表達(dá)的當(dāng)前知識，評估其在臨床實(shí)踐中作為腫瘤標(biāo)志物的效用，探討其作為一種新型癌胚胎蛋白的臨床意義，為肝細(xì)胞肝癌的診斷提供科學(xué)依據(jù)，從而為肝細(xì)胞肝癌的靶向治療提供新的方向和依據(jù)。

肝細(xì)胞肝癌；磷脂酰肌醇蛋白多糖-3；免疫組化；病理

肝癌是最常見的癌癥之一，在全世界癌癥死亡原因中排列第三。是我國位居第二的癌癥“殺手”，其惡性程度高病情進(jìn)展快[2，3]。近年來，肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢，其最重要的原因是其發(fā)病機(jī)制仍不十分明確。在發(fā)展中國家慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染約占肝癌發(fā)病總數(shù)的60%[4]。盡管手術(shù)技術(shù)和醫(yī)療管理的不斷更新，HCC患者的長期預(yù)后仍不能令人滿意[5]。按組織發(fā)生可將肝癌分為三大類：①膽管細(xì)胞型肝癌：癌細(xì)胞起源于肝內(nèi)膽管上皮。其組織結(jié)構(gòu)多為腺癌或單純癌，此型比較少見。②混合型肝癌：癌組織中既有肝細(xì)胞癌又有膽管細(xì)胞癌結(jié)構(gòu)，此型最少見。③肝細(xì)胞癌：癌細(xì)胞起源于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，此型最常見，約占肝癌的80%～90%。在我國原發(fā)性肝癌中肝細(xì)胞癌占91.5%，患者早期無明顯癥狀，一旦出現(xiàn)癥狀就診，往往已屬中晚期，5年生存率低于10%～95%[6，7]。影像學(xué)技術(shù)如CT掃描、超聲波檢測或磁共振成像等是診斷HCC的主要手段，但是影像學(xué)檢測對微小病灶、良性病變或肝硬化結(jié)節(jié)等的鑒別準(zhǔn)確度不夠。因此尋找新的、靈敏度高、特異性強(qiáng)的腫瘤指標(biāo)一直是研究的熱點(diǎn)。近期的國內(nèi)外研究顯示，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 (GPC-3)在人類HCC組織及血清中有顯著的表達(dá)，尤其是在AFP陰性的HCC中GPC-3亦有表達(dá)。其對原發(fā)性肝癌的診斷具有較高的敏感性和特異性，與肝癌關(guān)系密切[8，9]。外科手術(shù)是治療肝癌的標(biāo)準(zhǔn)方法之一，患者預(yù)后差異很大。檢測肝癌組織中的蛋白水平已被廣泛報(bào)道在預(yù)測生物標(biāo)記物這方面[10]。有研究報(bào)道[11]，在肝癌組織中的高表達(dá)與預(yù)后GPC-3呈正相關(guān)，包括總生存期(OS)和轉(zhuǎn)移或無病生存率(DFS)，本文就GPC-3在HCC組織中表達(dá)的研究進(jìn)展作一概述。

1 GPC-3作為肝癌細(xì)胞來源的標(biāo)記物

GPC-3于1996年被Pillia在研究過度生長綜合征時從人胚胎中發(fā)現(xiàn)[12]。Glypican-3正常表達(dá)在胎肝和胎盤中，在成人肝組織中可以忽略不計(jì)的正常表達(dá)[13]。GPC-3基因位于人X染色體上(Xq26.1)。它的啟動子區(qū)包括6個SPI結(jié)構(gòu)、7個AP2結(jié)構(gòu)和2個CAAT盒，產(chǎn)生2130 bp的轉(zhuǎn)錄子，編碼含580個氨基酸殘基的GPC-3蛋白質(zhì)前體。GPC-3核心蛋白相對分子質(zhì)量約為70 Ku，它富含一段包括14個半胱氨酸殘基的獨(dú)特序列，中間為Furin蛋白酶切位點(diǎn)。Furin蛋白酶裂解Arg358和Cys359形成40 Ku的N末端亞基和30 Ku的C末端亞基[14]。GPC-3主要通過Wnts信號途徑產(chǎn)生作用，GPC-3在正常組織中表達(dá)及分布有明顯的組織特異性和組織分化的時相特異性其作用機(jī)制是在羧基末端接近細(xì)胞膜的區(qū)域含有兩個硫酸乙酰肝素(HS)糖鏈，可參與調(diào)解多條信號通路，與其細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子結(jié)合，促使腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。GPC-3表面表達(dá)水平在HCC細(xì)胞系之間變化，Hep3B具有最高表達(dá)之一，每個細(xì)胞估計(jì)有200000個位點(diǎn)。HuH-7和HuH-1都具有相當(dāng)少的表面表達(dá)，每個細(xì)胞約10000個位點(diǎn)。此外，GPC-3具有高內(nèi)化速率，渴望使其成為免疫毒素靶向的位點(diǎn)[16]。近年來國內(nèi)外的研究基本上都一致認(rèn)為GPC-3作為肝癌細(xì)胞來源的標(biāo)記物具有理想腫瘤標(biāo)志物的特性，對診斷HCC有較高的敏感性和特異性。

2 GPC-3在肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)

GPC-3在組織病理學(xué)診斷過程中也可作為輔助工具，使用免疫組織化學(xué)和實(shí)時逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)研究[17]59例直徑小于或等于3 cm的肝癌患者，以及66例肝硬化患者和16例低級別發(fā)育異常結(jié)節(jié)患者，33例高級別異型增生結(jié)節(jié)和13例局灶性結(jié)節(jié)性增生樣結(jié)節(jié)患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小肝癌中GPC-3的表達(dá)明顯比肝硬化和其他類型的小局灶性病變高，這表明從預(yù)惡性病變到小肝癌的轉(zhuǎn)變與GPC-3的表達(dá)在大多數(shù)情況下急劇增加有關(guān)。研究[18]免疫組化結(jié)果顯示，GPC-3蛋白在85%(34/40)HCC組織高表達(dá)，而在正常組織和其他肝病組織中陽性率均為0(0/50)和0(0/7)。近年來研究[19，20]發(fā)現(xiàn)，約有56.3%的早期肝癌的肝癌細(xì)胞表達(dá)GPC-3，顯著高于AFP(31.3%)；且GPC-3的表達(dá)與腫瘤大小及HCC分期無相關(guān)性。由此可見[21]，GPC-3相對于AFP可提高早期HCC診斷率。進(jìn)一步比較GPC-3在HCC和非肝細(xì)胞癌組織的表達(dá)方式，結(jié)果提示GPC-3在HCC胞質(zhì)和膜呈強(qiáng)陽性；在分化良好的HCC細(xì)胞中，GPC-3陽性也明顯高于癌旁組織；而局灶性結(jié)節(jié)性增生病組織中GPC-3為陰性。比較肝細(xì)胞肝癌、膽管細(xì)胞型肝癌及膽囊癌組織中GPC-3的表達(dá)狀況也發(fā)現(xiàn)，GPC-3在85%HCC中高度表達(dá)，而在膽管細(xì)胞型肝癌及膽囊癌中陰性。

楊龍等[22]研究證實(shí)GPC-3蛋白在肝癌組織中高表達(dá)，而在非癌組織中沒有表達(dá)或表達(dá)量極低，說明GPC-3和肝癌有特定的關(guān)系。GPC-3抑制腫瘤的生長，更加說明GPC-3在肝癌表達(dá)的特異性和在肝癌作用機(jī)制的特異性；研究表明GPC-3在肺癌、乳腺癌、間皮瘤、腎癌和卵巢癌組織中表達(dá)缺失。相關(guān)分析表明[23]，GPC-3在肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)的高低僅與血管浸潤相關(guān)，與性別、年齡、HBsAg、AFP、肝硬化、TNM分期、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目以及腫瘤的分化程度無相關(guān)性。

3 GPC-3與肝癌患者預(yù)后和復(fù)發(fā)

Jin等研究表明[24]，較低的GPC-3表達(dá)導(dǎo)致HCC患者具有低生存期以及增加了外科手術(shù)切除腫瘤后復(fù)發(fā)的風(fēng)險。Ning等[25]研究表明GPC-3的表達(dá)與HCC手術(shù)后的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)。HCC術(shù)后GPC-3高表達(dá)患者的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)風(fēng)險是GPC-3低表達(dá)患者的3.214倍。生存分析顯示，GPC-3高表達(dá)的HCC患者的總生存期明顯短于GPC-3低表達(dá)的HCC患者(P= 0.003)。Shirakawa等[26]對107例接受手術(shù)治療的患者進(jìn)行5年隨訪，發(fā)現(xiàn)GPC-3陽性組的5年生存率(54.4%)明顯低于GPC-3陰性組(87.7%)。16例首選手術(shù)治療的GPC-3陰性患者，在隨訪期間均沒有死亡。Chan等[27]研究表明GPC-3可能參與肝母細(xì)胞瘤腫瘤發(fā)生，為了從源頭上抑制或阻斷肝癌的發(fā)生發(fā)展，很有必要將此問題進(jìn)行深入研究。這種磷脂酰肌醇通過刺激經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)促進(jìn)HCC的體內(nèi)和體外生長。該信號通路的活化誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子b-連環(huán)蛋白的胞質(zhì)積累和核易位。在細(xì)胞核中，β-連環(huán)蛋白與轉(zhuǎn)錄因子的LEF/TCF家族的成員結(jié)合，并誘導(dǎo)刺激細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞存活的基因的表達(dá)。多因素分析顯示，GPC-3的表達(dá)情況是肝癌獨(dú)立的預(yù)后相關(guān)因素。如上所述，他們使用不同的百分比陽性腫瘤細(xì)胞和不同的陽性區(qū)域，可能在臨床實(shí)踐中造成誤差。因此，我們認(rèn)為有必要采取公正、普遍和更有效的分析方法精確和全面分析GPC-3在HCC患者中的預(yù)后價值。

4 展望

迄今為止，GPC-3是將HCC與肝臟良性病變和非HCC惡性肝細(xì)胞損傷區(qū)分開來的最可靠的腫瘤標(biāo)志物之一。研究表明[28，29]，GPC-3在HCC檢測中的敏感度是56.8%到83.4%，與Arg-1、HepPar-1和CD34在HCC患者中的檢出率相當(dāng)?？紤]到能夠選擇從肝組織活檢染色HCC的免疫組織化學(xué)標(biāo)記，GPC-3應(yīng)與染色板結(jié)合使用以提高HCC檢測的準(zhǔn)確性。由于HCC的發(fā)生仍是一個長期的、多階段、多因素導(dǎo)致的復(fù)雜過程，且起病比較隱匿。目前臨床上對于此類患者多采取外科干預(yù)治療，但由于其預(yù)后較差，所以尋找新的治療方法已經(jīng)勢在必行。

目前，多種抗GPC-3的單克隆抗體已經(jīng)研制，這些抗體可以在細(xì)胞和組織中特異識別GPC-3蛋白，抑制肝癌細(xì)胞的增殖或誘導(dǎo)凋亡。GPC-3在HCC中特異性高表達(dá)，在非肝細(xì)胞肝癌組織內(nèi)低表達(dá)或不表達(dá)，其在肝細(xì)胞癌的診斷與鑒別診斷方面有重要的臨床價值。它的功能的表達(dá)和作用作為一個重要的信號調(diào)制器提示GPC-3可能是癌癥治療的潛在靶點(diǎn)。根據(jù)近期的結(jié)果[30]，GC33在患有晚期HCC的受試者中良好耐受，并且達(dá)到任何劑量限制性毒性。Feng[31]等分離了第二個潛在靶標(biāo)，稱為HN3，其以高親和力結(jié)合GPC-3。當(dāng)被引入GPC-3陽性HCC細(xì)胞系中時，HN3顯著抑制細(xì)胞增殖，據(jù)推測是通過在G1期誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯。在小鼠中，HN3同樣減緩了HCC腫瘤生長。這兩種抗體都可能在GPC-3相關(guān)癌癥的未來預(yù)測和治療中發(fā)揮作用。目前正在評估由Nobuoka等[32]開發(fā)的GPC-3衍生肽疫苗在患有晚期HCC的患者中通常有利的I期和II期結(jié)果。預(yù)期隨后更大規(guī)模的隨機(jī)臨床試驗(yàn)將確定該疫苗的功效。動態(tài)觀察外周血中GPC-3表達(dá)水平有助于判斷肝癌患者的預(yù)后、復(fù)發(fā)等情況，有望成為判斷肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的一個有意義的預(yù)測指標(biāo)。它與AFP相比具有更高的特異性，成人組織中缺乏表達(dá)，在確定的光譜中存在GPC-3免疫染色是一種有價值的診斷試驗(yàn)以及將臨床腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行鑒別診斷。因此，我們樂觀地認(rèn)為，GPC-3可以在肝臟疾病中提供有用的預(yù)后和治療價值，特別是當(dāng)與肝臟病變的形態(tài)學(xué)評估結(jié)合時。然而，目前大多數(shù)研究的局限性都是基于回顧性和橫斷面設(shè)計(jì)的研究。前瞻性隊(duì)列研究將使得未來在進(jìn)一步研究與探討GPC-3的結(jié)構(gòu)和功能時，有助于發(fā)現(xiàn)新的、更有效的和具有腫瘤抑制活性的抗體，并在此基礎(chǔ)上應(yīng)用多靶點(diǎn)抑制劑或聯(lián)合不同作用途徑和機(jī)制的藥物，可能在未來肝癌治療中取得更大的成功，也為開發(fā)更加有效的肝癌治療藥物和合理的治療策略提供理論依據(jù)。

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The value and application of Glypican-3 in pathological diagnosis of hepatocellular carcinoma

LUXiang-yu1，2，GONGJun2，XUJian2，XIONGWei2，YUXiao-jiong2
(1.SchoolofMedicine，UniversityofElectronicScienceandTechnology，Chengdu610072，China；2.TheSecondDepartmentofHepatobiliarySurgery，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China)

YUXiao-jiong

The definitude diagnosis of hepatocellular carcinoma (HCC) is mainly dependent on histopathology and clinical imaging，and the differential diagnosis should be confirmed by immunohistochemical markers.Glypican-3 (GPC-3) is a widely used marker of immunohistochemistry for HCC.With the constant deepening of research on GPC-3，it has been found that GPC-3 is not only presented in serum but also expressed in HCC tissues.According to the expression of GPC-3 in HCC and adjacent tissues，we have updated the current knowledge about the expression of GPC-3 in normal and tumor tissues，evaluated its utility as a tumor marker in clinical practice，and investigated the clinical significance of this new type of cancer embryonic protein.This will provide a scientific basis for the diagnosis of HCC，as well a new direction and basis for targeted therapy of HCC.

Hepatocellular carcinoma；Glypican-3； Immunohistochemisty； Pathology

俞小炯，男，主任醫(yī)生，碩士生導(dǎo)師。中華醫(yī)學(xué)會外科學(xué)分會第十六屆委員會委員，中華醫(yī)學(xué)會外科學(xué)分會脾學(xué)組委員，中國研究型醫(yī)院學(xué)會肝膽胰外科委員會委員，四川省醫(yī)學(xué)會日間手術(shù)委員會副主任委員，四川省醫(yī)師協(xié)會外科學(xué)分會常委，四川省醫(yī)學(xué)會外科學(xué)分會委員。研究方向：肝膽胰脾外科基礎(chǔ)與臨床。

R735.7

A

1672-6170(2017)03-0012-04

2017-03-14)