間充質(zhì)干細(xì)胞在自身免疫性肝病中的應(yīng)用

張迪，張雅敏，劉子榮，崔子林，李陽（.天津市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津009；.天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津市器官移植臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 009；.衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 009）

自身免疫性肝?。╝utoimmune liver disease，AILD）是由自身免疫介導(dǎo)的肝膽系統(tǒng)慢性炎癥性疾病，根據(jù)其臨床表現(xiàn)、生化、免疫學(xué)、影像學(xué)和組織病理學(xué)特點(diǎn)可分為以肝細(xì)胞實(shí)質(zhì)損害為主、血清肝細(xì)胞炎癥指標(biāo)明顯升高的自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis， AIH）、以膽管病變?yōu)橹?、淤膽指?biāo)升高顯著的原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis， PBC）、 原 發(fā) 性 硬 化 性 膽 管 炎（primary sclerosing cholangitis， PSC）及重疊綜合征（overlap syndrome， OLS）4種類型。目前，臨床上主要以糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等治療為主，但是對(duì)于部分AILD患者，其治療效果欠佳，而且容易引起骨質(zhì)疏松和惡性腫瘤等，且停藥后易復(fù)發(fā)［1］。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstem cell，MSC）是一種具有全能干細(xì)胞特點(diǎn)來源于中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞，具有多向分化潛能，最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，在特定的誘導(dǎo)條件下可擴(kuò)增為非造血組織干細(xì)胞［2-4］，具有免疫調(diào)節(jié)功能［5-6］。MSC 在體內(nèi)外均可抑制T淋巴細(xì)胞的活化和增殖［7］，并可用于治療多種疾病，均取得了較好的治療效果。MSC的分化及免疫調(diào)節(jié)功能為其治療AILD提供了可能性。

1 AILD的發(fā)病機(jī)制

AILD 可分為AIH、 PBC、 PSC、 OLS 4種類型，其中前3種較為常見。對(duì)于AILD的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確［8-9］，學(xué)者們認(rèn)為感染及抗原的分子模擬機(jī)制、自身免疫紊亂、遺傳等因素相互作用，促進(jìn)了AILD不同程度的進(jìn)展［10］。

1.1 感染及抗原的分子模擬機(jī)制：抗原的分子模擬機(jī)制是指病原體上的抗原表位與人組織蛋白表位比較相似，當(dāng)病原體感染機(jī)體時(shí)，機(jī)體激活淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生抗體及組織抗原等物質(zhì)，機(jī)體在抵抗病原體時(shí)，將正常組織誤以為“異體”而進(jìn)行攻擊，導(dǎo)致正常組織器官受到一定程度的損傷［11］。研究結(jié)果顯示，細(xì)菌感染、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、化學(xué)因素均與AILD的發(fā)病有關(guān)［12］。已有研究通過建立作用于DNA免疫的2型AIH鼠類動(dòng)物模型證實(shí)了分子模擬機(jī)制在AIH發(fā)病中的作用［13］。Liang等［14］進(jìn)行的一項(xiàng)Meta分析結(jié)果表明，泌尿系統(tǒng)感染與PBC發(fā)病有明顯的相關(guān)性。

1.2 遺傳因素：AILD有家族聚集現(xiàn)象，PBC及親屬的患病率比普通人群高100倍［15］，AIH、PSC也存在顯著的家族成員集中發(fā)病現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，人類組織相容性抗原（human lecocyte antigen， HLA）與其遺傳易感密切相關(guān)［13］。由于遺傳差異，AILD患者受到外界抗原刺激時(shí)更容易導(dǎo)致基因的異常表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體免疫狀態(tài)紊亂，正常肝臟組織被識(shí)別為“異體”而發(fā)生免疫損傷。

1.3 自身免疫紊亂：AILD的免疫損傷主要有細(xì)胞免疫和體液免疫2種方式。細(xì)胞免疫是指特異性抗原刺激機(jī)體可激活CD4+T細(xì)胞，進(jìn)而釋放一系列免疫調(diào)控因子，活化細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，釋放毒性因子直接破壞肝細(xì)胞；體液免疫是指抗原刺激機(jī)體，B細(xì)胞產(chǎn)生大量針對(duì)自身肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞的抗體，與細(xì)胞膜上的蛋白成分結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用導(dǎo)致肝臟、膽管的損傷。AIH患者肝臟組織表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞、效應(yīng)B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等浸潤，表明其發(fā)病與免疫有關(guān)［16］。Th17細(xì)胞/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例失衡導(dǎo)致患者免疫耐受機(jī)制被破壞，參與了AILD的發(fā)生［17］。Th17細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子為白細(xì)胞介素 -17（interlenkin-17， IL-17），其在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，IL-17在輔助性T細(xì)胞（Tfh）的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用，IL-17可以激活B細(xì)胞、促進(jìn)效應(yīng)B細(xì)胞分化，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞及免疫細(xì)胞的活化，對(duì)免疫球蛋白也有一定作用。研究發(fā)現(xiàn)，PBC患者中CXCR5+CD4+T細(xì)胞數(shù)量增加，IL-17因子水平提高［18］。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，AILD患者體內(nèi)轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growing factor-β1， TGF-β1）水平下降，導(dǎo)致免疫負(fù)調(diào)控下降，免疫反應(yīng)亢進(jìn)促進(jìn)AIH和PBC的發(fā)展［19］。

2 MSC的免疫調(diào)節(jié)作用

MSC是具有多種分化潛能的非造血干細(xì)胞，它具有來源豐富、分化潛能高及免疫調(diào)節(jié)特性［20］，現(xiàn)已引起干細(xì)胞治療領(lǐng)域?qū)＜覞夂竦呐d趣［21］。MSC低度表達(dá)MHCⅠ，不表達(dá)MHCⅡ、CD40、CD40L、B71、B72等共刺激因子，這些特點(diǎn)使MSC可逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，進(jìn)入體內(nèi)，而不會(huì)遭受機(jī)體免疫系統(tǒng)的排斥［22］。MSC幾乎影響固有免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)的每個(gè)環(huán)節(jié)［23-25］，它可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、樹突狀細(xì)胞，在調(diào)節(jié)固有免疫及保護(hù)組織免受損傷中起到重要作用。另外，MSC還可以抑制B細(xì)胞及T細(xì)胞，在獲得性免疫中起到調(diào)節(jié)作用［26］。MSC主要通過細(xì)胞之間的相互接觸以及分泌的可溶性因子發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用［21，27-28］。MSC對(duì)T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞的增殖與分化有重要的調(diào)節(jié)作用，MSC可以促進(jìn)T細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T-regulatory lymphocytes，Tregs）和 Th2，抑制 Th17和 Tfh反應(yīng)，并可以抑制單核細(xì)胞向抗原提呈樹突狀細(xì)胞分化［29］。MSC在體內(nèi)下調(diào)Th1和Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子γ-干擾素（interferon-γ， IFN-γ）和IL-17的表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)Th2和Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-10和TGF-β的表達(dá)水平。有研究表明，吲哚胺2，3-二加氧酶IDO，前列腺素PGE2，一氧化氮（NO）、人類白細(xì)胞抗原（HLA-DR）和趨化因子等因子也參與MSC的免疫調(diào)節(jié)作用［30-31］。建立T細(xì)胞和MSC的混合培養(yǎng)體系，MSC通過產(chǎn)生Treg細(xì)胞和分泌細(xì)胞因子TGF-β和PGE2抑制T 細(xì)胞的增殖和活化［30］。Kol等［32］將 MSC 靜脈注射至健康馬體內(nèi)，觀察白細(xì)胞、脾臟淋巴細(xì)胞、血淋巴細(xì)胞以及各種細(xì)胞因子的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSC可以上調(diào)血中CD8+T細(xì)胞及脾臟中FoxP3+Treg細(xì)胞的水平。MSC可產(chǎn)生和分泌多種細(xì)胞生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、纖維母細(xì)胞生長因子2（fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF-2）、胰島素樣生長因子 - 1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）和肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）等。另外，MSC具有組織修復(fù)能力，組織出現(xiàn)損傷后，MSC可以遷移到損傷部位，在局部環(huán)境的調(diào)控下，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及分化等功能，參與組織的修復(fù)過程中［33］。

3 MSC對(duì)AILD的作用

隨著對(duì)MSC研究的深入，MSC已應(yīng)用于多種免疫性疾病的治療，尤其對(duì)失代償期肝硬化、AILD患者的臨床應(yīng)用及研究， 已成為時(shí)下的熱點(diǎn)問題。肝細(xì)胞具有一定的再生能力，肝細(xì)胞受到輕度損傷時(shí)，可通過增殖進(jìn)行修復(fù)；而肝細(xì)胞損傷較重或受到持續(xù)的損傷時(shí)，肝臟干細(xì)胞被激活并參與到損傷修復(fù)中；當(dāng)損傷程度超過肝細(xì)胞和肝臟干細(xì)胞修復(fù)能力時(shí)， 骨髓干細(xì)胞（包括造血干細(xì)胞、 MSC和內(nèi)皮祖細(xì)胞等）被募集至損傷部位并發(fā)揮重要的修復(fù)功能［34］。MSC可轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞以增加功能肝細(xì)胞的數(shù)量，也可通過與肝細(xì)胞融合促進(jìn)損傷肝細(xì)胞的修復(fù)和功能的恢復(fù)［35］。鐘艷等［36］通過四氯化碳（CCl4）法建立大鼠肝損傷模型，分離肝損傷大鼠血清并誘導(dǎo)臍帶MSC分化，檢測培養(yǎng)液上清甲胎蛋白和白蛋白水平。肝損傷大鼠血清可使臍帶MSC向肝樣細(xì)胞分化，經(jīng)誘導(dǎo)后培養(yǎng)液上清中白蛋白水平增高。研究表明，MSC通過分泌多種細(xì)胞因子改變了肝臟局部的免疫微環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)了肝細(xì)胞的損傷修復(fù)和功能恢復(fù)［37］。低免疫原性MSC可用于異體移植并促進(jìn)受體肝的損傷修復(fù)。

3.1 MSC治療安全性研究：MSC的安全性是MSC治療各種免疫性疾病的基礎(chǔ)。Kol等［32］將MSC靜脈注射至正常馬體內(nèi)，觀察其性情、體溫、脈搏、體溫等變化，發(fā)現(xiàn)靜脈注射MSC后隨訪1周，健康馬并未出現(xiàn)臨床異常，MSC不能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，未見組織及器官毒性，MSC無明顯臨床不良反應(yīng)。在幾個(gè)臨床試驗(yàn)中，研究人員驗(yàn)證了異體或自體同源MSC的有效性和安全性［38-39］。de Windt 等［40］分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-drived mesenchymal stem cell， BM-MSC）用于治療軟骨缺損患者。Xu等［41］將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cell， UC-MSC）輸入干燥綜合征（sjogren's syndrome，SS）患者體內(nèi)。研究人員選取了10例熊脫氧膽酸（UDCA）治療無效的PBC患者給予MSC治療隨訪1年后均未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)［30］。隨著實(shí)驗(yàn)研究及臨床試驗(yàn)不斷證實(shí)MSC治療的安全性，研究MSC對(duì)AILD治療作用的障礙慢慢減少，MSC的特點(diǎn)、安全性促使學(xué)者們逐漸深入研究其在AIH中的免疫調(diào)節(jié)作用［26］。

3.2 MSC治療AILD的實(shí)驗(yàn)研究：MSC的免疫調(diào)節(jié)作用在很多免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎［42-43］、糖尿?。?4］、輻射誘導(dǎo)的肝損傷［45］的動(dòng)物模型中得到證實(shí)。有學(xué)者建立了大鼠CCl4肝纖維化模型后，肝纖維化大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝臟細(xì)胞的胞質(zhì)出現(xiàn)空泡和脂肪滴，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase， ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（asparate transaminase， AST）水平明顯升高，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA：檢測肌纖維母細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記）陽性細(xì)胞增多，而經(jīng)MSC治療的肝纖維化小鼠，其ALT、AST水平無明顯升高，肝小葉以肝中央靜脈為中心放射狀排列，僅少量肝臟細(xì)胞出現(xiàn)空泡及脂肪滴，α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)與正常大鼠相比無明顯升高［46］。MSC能夠維持血清蛋白水平穩(wěn)定，抑制轉(zhuǎn)氨酶被激活，抑制損傷肝臟纖維化。MSC可以分化為類肝臟細(xì)胞修復(fù)受損的肝細(xì)胞及纖維化肝臟，進(jìn)而促進(jìn)肝功能的恢復(fù)。Chen等［47］建立小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肝炎（experimental autoimmune hepatitis， EAH）模型，并分為正常組、模型組、藥物治療組、MSC治療1組、MSC治療2組、MSC治療3組共6組，正常組不進(jìn)行造模，模型組在造模后僅腹腔注射1 ml生理鹽水，藥物治療組腹腔注射潑尼松龍及硫唑嘌呤，MSC治療1組、MSC治療2組、MSC治療3組分別給予1、2、3次MSC治療。42天后取動(dòng)物小鼠血液及肝組織，分析ALT、AST水平，蛋白免疫印跡試驗(yàn)（Western Blot）檢測細(xì)胞因子IL-17、IL-23水平，PCR檢測程序性死亡受體配體1（PD-L1）的mRNA水平，研究結(jié)果顯示，造模后血清中ALT、AST水平增高，而MSC治療組可明顯降低其水平。IL-17是CD4+T細(xì)胞如Th17細(xì)胞分泌的致炎因子之一，Th17細(xì)胞和IL-17在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［48-49］，與正常組相比，EAH小鼠IL-17的表達(dá)水平明顯增高，而經(jīng)MSC治療后，IL-17表達(dá)水平顯著下降，且隨治療次數(shù)增加下降更明顯，IL-17下降水平與PD-L1水平呈明顯負(fù)相關(guān)，推測MSC通過激活PD-L1表達(dá)而抑制IL-17的表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)，起到治療EAH作用。Wang等［50］腹膜下注射聚肌胞苷酸建立小鼠PBC模型，經(jīng)MSC治療后，膽管周圍單核細(xì)胞浸潤減少，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）、ALT等血清轉(zhuǎn)氨酶及抗線粒體抗體（anti-mitochondrial antibody，AMA）、抗核抗體（anti-nuclear antibody，ANA）等自身抗體水平降低，外周血及淋巴結(jié)中CD4+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量增多，血清TGF-β1表達(dá)水平增高，而IFN-γ表達(dá)水平下降?？梢姡琈SC可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，抑制肝臟炎癥反應(yīng)，這些研究預(yù)示MSC以后可能應(yīng)用于臨床治療AILD。

3.3 MSC治療AILD的臨床進(jìn)展：100所自身免疫性疾病研究試驗(yàn)基地中有22所基地研究了MSC的疾病治療作用［38-39］。初期臨床試驗(yàn)在激素難治性Crohn?。?1］、激素抵抗型移植物抗宿主病［52］、多發(fā)性硬化［53］、酒精性肝硬化［54］等疾病中體現(xiàn)了MSC的免疫調(diào)節(jié)作用，MSC對(duì)肝移植后急性排斥的調(diào)節(jié)作用正在研究中［26］。PBC是一種慢性進(jìn)行性膽汁淤積性AILD，目前主要治療為UDCA，對(duì)于UDCA治療無效的PBC患者，治療是臨床上較為棘手的問題。有研究選取了10例UDCA治療無效的PBC患者，給予MSC治療，隨訪1年，進(jìn)行PBC-40問卷分析患者生活質(zhì)量，檢測患者血清中ALT、AST、ALP、γ-轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyltranspeptidase，γ-GT）、 總 膽 紅素（total bilirubin，TBiL）、間接膽紅素（indirect bilirubin，DBiL）、免疫球蛋白（IgM）水平及IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor， TNF-α），TGF-β1 等因子變化，分析外周血淋巴細(xì)胞表型，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PBC患者經(jīng)MSC治療后，ALT、AST、γ-GT、IgM表達(dá)水平較治療前明顯降低［30］。外周血淋巴細(xì)胞中CD8+T細(xì)胞數(shù)量減少，與此同時(shí)，CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量增多。IL-10表達(dá)水平升高，驗(yàn)證了MSC在UDCA難治性PBC患者中的免疫調(diào)節(jié)及治療作用。Wang等［55］用UC-MSC治療7例UDCA難治性PBC患者，發(fā)現(xiàn)經(jīng)治療后ALP、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶降低，Mayo風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（mayo risk score， MRS）可以評(píng)估PBC患者生存率，同樣說明了MSC治療的安全性及有效性。呂勝祥等［56］從外周靜脈輸注MSC，觀察了6例AILD患者的肝功能變化及治療后的安全性情況，經(jīng)治療后6例患者均達(dá)到臨床病情緩解標(biāo)準(zhǔn)，血清白蛋白水平較治療前明顯升高，ALT和AST水平低于治療前，治療后無嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生。

4 小 結(jié)

AILD是由自身免疫介導(dǎo)的肝膽系統(tǒng)的慢性炎癥性疾病，目前，臨床上主要以糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等治療為主，但是對(duì)于部分AILD患者，其治療效果欠佳，而且此類藥物易引起骨質(zhì)疏松和惡性腫瘤等，且停藥后易復(fù)發(fā)［1］。AILD與機(jī)體免疫紊亂有關(guān)，而MSC的低免疫原性、免疫調(diào)節(jié)等生物特性及組織損傷修復(fù)功能為AILD治療提供了新途徑。但目前AILD的發(fā)病機(jī)制及MSC免疫調(diào)節(jié)及修復(fù)受損肝臟組織的機(jī)制還不明確。另外，實(shí)驗(yàn)研究及臨床試驗(yàn)相對(duì)缺乏，MSC治療AILD的劑量及遠(yuǎn)期安全性問題需要進(jìn)一步研究。隨著組織工程學(xué)的快速發(fā)展及細(xì)胞治療的不斷成熟，在不久的將來，上述問題將在研究中不斷解決。相信MSC將給難治性AILD患者帶來希望，也將更好地應(yīng)用于臨床，為患者服務(wù)。