大黃藿苓湯對慢性腎衰大鼠成纖維細(xì)胞生長因子表達(dá)的影響*

韓順平，楊幼新，苑朝升，楊 曼，馬 艷

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)國際教育學(xué)院，天津 300193；2.解放軍272醫(yī)院，天津 300020）

大黃藿苓湯對慢性腎衰大鼠成纖維細(xì)胞生長因子表達(dá)的影響*

韓順平1，楊幼新1，苑朝升2，楊 曼2，馬 艷1

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)國際教育學(xué)院，天津 300193；2.解放軍272醫(yī)院，天津 300020）

[目的]探討大黃藿苓湯對慢性腎功能衰竭大鼠腎臟的保護(hù)作用及機(jī)制。 [方法]采用腺嘌呤造模，設(shè)空白組、模型組、治療1、2組。[結(jié)果]治療1、2組腎臟病理改變較模型組輕，尿素氮、肌酐、尿酸、成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）表達(dá)治療1組較模型組減少（P<0.05），治療2組與模型組相比bFGF表達(dá)無明顯差異。[結(jié)論]大黃藿苓湯對腺嘌呤致慢性腎衰大鼠腎臟有保護(hù)作用，且早期用藥優(yōu)于晚期用藥，其機(jī)制可能是抑制bFGF表達(dá)。

大黃藿苓湯；腺嘌呤；慢性腎衰；bFGF

慢性腎功能衰竭（CRF）是由多種慢性腎臟疾病發(fā)展到晚期，腎實質(zhì)損害引起臨床綜合征。其臨床癥狀復(fù)雜，死亡率較高，透析和腎臟移植是治療該病的重要手段，但治療費用較高，尚未普及。因此，CRF的非透析療法為國內(nèi)外醫(yī)家所重視。大黃藿苓湯是臨床治療CRF的有效方藥。為探討其作用機(jī)制，本實驗觀察了大黃藿苓湯對腺嘌呤所致大鼠慢性腎功能衰竭成纖維細(xì)胞生長因子的影響，現(xiàn)報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量150～180 g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗動物研究所繁育場提供。

1.2 實驗藥品 腺嘌呤（Adenine，C5H5N5，F(xiàn)W：135.13）購于上海伯奧生物科技有限公司，進(jìn)口分裝，批號：020508。用時加蒸餾水配成2%混懸液，置4℃冰箱備用，混勻后使用。大黃藿苓湯：由大黃、淫羊藿、豬苓、茯苓、雷公藤、莪術(shù)、丹參、紅花、當(dāng)歸等藥物組成，藥材由解放軍第272醫(yī)院中藥房提供，煎成生藥濃度為7.04kg/L的煎劑裝瓶，置4℃冰箱備用。

1.3 主要試劑 成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）試劑盒，采用武漢博士德生物工程公司進(jìn)口分裝試劑盒。使用日立7020全自動生化儀、光學(xué)顯微鏡、美國600CL PISERA彩色圖像分析儀等儀器進(jìn)行檢測分析。

2 實驗方法

2.1 分組及造模方法 40只大鼠購入后，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為4組，即空白組、模型組、治療1組、治療2組，每組各10只。除空白組外，各組按250mg/（kg·d）給大鼠腺嘌呤灌胃[1-2]空白組用等量生理鹽水灌胃，造模用藥21 d，并于第21天經(jīng)眼眶取血做腎功能檢查。

2.2 給藥方法 空白組、模型組：實驗開始至51 d實驗結(jié)束，1次/d，2mL/只生理鹽水灌胃；治療1組：實驗開始至51 d實驗結(jié)束，1次/d，大黃藿苓湯2mL/只灌胃；治療2組：實驗開始至21 d，1次/d，2mL/只生理鹽水灌胃，實驗22～51 d實驗結(jié)束，大黃藿苓湯2mL/只灌胃。治療過程中大鼠自由進(jìn)食、飲水。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 尿素氮、肌酐、尿酸、血鈣、血磷 血標(biāo)本離心，取血清，日立7020型全自動生化儀測定。

2.3.2 腎組織形態(tài)學(xué) 腎臟標(biāo)本10%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)蘇木-伊紅（HE）染色，光鏡觀察。

2.3.3 免疫組化染色 石蠟切片脫蠟，3%過氧化氫滅火內(nèi)源性酶，電爐煮沸抗原修復(fù)，5%～10%正常山羊血清封閉，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗、二抗及適當(dāng)比例的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 計量資料用單因素方差分析，等級資料使用秩和檢驗。

3 結(jié)果

3.1 第21天時各組生化指標(biāo)測定結(jié)果 見表1。

通過表1可以看到，在第21天時，模型組尿素氮、肌酐、尿酸均明顯高于空白組（P<0.01），說明造模成功。在造模同時預(yù)防性治療1組在第21天時，尿素氮、血肌酐、尿酸的上升水平明顯低于模型組，即腎功能損害明顯輕于模型組，但血鈣、血磷的變化不明顯。

表1 第21天時各組生化指標(biāo)測定結(jié)果(±s)Tab.1 Resultsof biochem icalparametersofeach group on 21stday(±s)

表1 第21天時各組生化指標(biāo)測定結(jié)果(±s)Tab.1 Resultsof biochem icalparametersofeach group on 21stday(±s)

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較△P<0.05。

組別空白組模型組治療1組血磷(mmol/L)2.18±0.41 4.64±1.09**4.40±0.53**尿素氮(mmol/L)8.94±0.397 26.48±6.42**23.33±6.06**△肌酐(μmol/L)33.2±3.82 92.3±25.79**76.9±16.18**△尿酸(mmol/L)194.57±44.76 337.67±133.25**309.6±115.99**△血鈣(mmol/L)2.21±0.08 2.10±0.17 2.29±0.14

3.2 第51天時各組生化指標(biāo)測定結(jié)果 見表2。

表2 第51天時各組生化指標(biāo)測定結(jié)果(±s)Tab.2 Resultsof biochem icalparametersofeach group on 51stday(±s)

表2 第51天時各組生化指標(biāo)測定結(jié)果(±s)Tab.2 Resultsof biochem icalparametersofeach group on 51stday(±s)

注：與空白組比較，**P<0.01；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△△P<0.01；與模型組比較，△P<0.05。

組別空白組模型組治療1組治療2組尿素氮(mmol/L)7.42±0.96 15.27±3.62*10.89±1.42△10.79±1.98△肌酐(μmol/L)31.2±6.56 60.6±7.60**34.3±4.69△35.7±6.77△尿酸(mmol/L)111.04±21.12 199.56±24.56**92.73±15.34△△121.29±45.19△血鈣(mmol/L)2.17±0.37 2.22±0.35 2.30±0.27 2.32±0.48血磷(mmol/L)1.92±0.29 4.47±0.30**2.01±0.28△2.07±0.49△

通過表2可以看出，治療1、2組腎功能、血磷指標(biāo)均明顯好于模型組，表明大黃藿苓湯可以明顯抑制腎衰的進(jìn)展，治療1、2組之間無明顯差別，治療1組較治療2組腎功能進(jìn)展有減慢的趨勢。

3.3 病理學(xué)觀察 空白組：腎組織如常，組織學(xué)均未見著變。模型組：腎體積均明顯增大。個別動物腎體積較正常對照組可增大1倍以上。各腎均存在區(qū)域性腎單位萎縮、消失，纖維組織增生明顯及炎細(xì)胞浸潤。部分腎小管上皮細(xì)胞壞死、消失或擴(kuò)張，甚者呈囊性。腎實質(zhì)內(nèi)腎小球數(shù)目明顯減少并可見大小不一、數(shù)量不等的棕褐色結(jié)晶或異物肉芽腫形成及粉染勻質(zhì)的管型。治療1組：腎病變較模型對照組明顯減輕，腎體積除個別動物外，均略增大或接近正常對照組，腎單位萎縮、消失，纖維組織增生面積較小且局限在近被膜的皮質(zhì)部分。除個別動物外，擴(kuò)大的腎小管及結(jié)晶體形成均減輕，部分腎組織學(xué)與正常對照組比較大致相似。治療2組：腎病變較模型對照組減輕，區(qū)域性腎單位萎縮消失。纖維組織增生面積較模型組??；擴(kuò)大的腎小管及腎實質(zhì)內(nèi)的結(jié)晶體亦少些。

3.4 免疫組化結(jié)果 測量方法采用半定量方法進(jìn)行判定，每張切片觀察10個視野，細(xì)胞核被染成棕褐色定為陽性結(jié)果。半定量方法是根據(jù)每張切片陽性反應(yīng)顆粒的顏色深淺和占細(xì)胞總數(shù)的比例來測量：陰性（－）：未見或偶見陽性顆粒，顏色成淺黃色：陽性（＋）：陽性顆粒少于1/3，顏色呈淺棕黃色；中等陽性（＋＋）：陽性顆粒介于 1/3～2/3，顏色介于+ ～+++ 間；強陽性（＋＋＋）：陽性顆粒大于 2/3，顏色呈棕褐色。成纖維細(xì)胞生長因子免疫組化結(jié)果為：近曲、遠(yuǎn)曲間質(zhì)、血管內(nèi)細(xì)胞及血管內(nèi)皮都有陽性表達(dá)，正常對照組腎小管及間質(zhì)呈均勻一致的淡黃染，管腔內(nèi)藥物結(jié)晶體呈黃棕褐色表達(dá)。

表3 各組大鼠成纖維細(xì)胞檢測結(jié)果Tab.3 The determ ination resultof fibroblast in ratsof each group

4 討論

慢性腎功能衰竭為內(nèi)科危重病癥，是由于多種慢性腎臟疾患發(fā)展到晚期，腎實質(zhì)損害引起慢性腎功能嚴(yán)重?fù)p害，體內(nèi)氮質(zhì)及其代謝產(chǎn)物潴留，不能維持體內(nèi)水、電解質(zhì)及酸堿平衡而引起的各種臨床綜合征。其機(jī)制目前尚未完全清楚，對于CRF的治療主要采用保守治療和透析治療、腎移植的替代療法，由于替代療法的治療費用昂貴，尚難普及，因此中醫(yī)藥治療CRF有著重要意義。CRF類似中醫(yī)學(xué)的“水腫”、“癃閉”“虛勞”、“關(guān)格”、“溺毒”等癥。根據(jù) CRF發(fā)生發(fā)展病程中主要臨床表現(xiàn)，筆者認(rèn)為CRF的病機(jī)為內(nèi)生和外來之毒侵蝕機(jī)體，引發(fā)臟腑陰陽失調(diào)，血瘀氣滯，精血耗損，故自擬具有活血化瘀、益氣養(yǎng)血、補腎健脾、利水排毒的大黃藿苓湯治療，取得了較好的臨床效果。近年研究發(fā)現(xiàn)，血小板源生長因子[3-4]參與小管、間質(zhì)的損傷過程，并刺激間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的增多，促進(jìn)腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化和小管周圍毛細(xì)血管喪失的發(fā)生與發(fā)展。血小板源性生成因子（PDGF）體外實驗可使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞較腎臟固有的成纖維細(xì)胞具有更強的纖維化功能，是腎纖維化及其他組織纖維化中細(xì)胞外基質(zhì)沉積增多的主要原因之一。成纖維細(xì)胞生長因子廣泛存在于多種組織中，能夠以自分泌和旁分泌的方式促使系膜細(xì)胞增殖及其產(chǎn)生ECM，對成纖維細(xì)胞有很強的促分裂與刺激增生、趨化移行的作用。研究表明[3]bFGF可促進(jìn)人腎成纖維細(xì)胞增殖、分泌Ⅰ型膠原增加。本實驗研究表明大黃藿苓湯可減低CRF大鼠尿素氮、血肌酐、尿酸，減少腎組織的腎單位萎縮、消失、纖維組織增生面積，抑制慢性腎功能衰竭成纖維細(xì)胞生長因子bFGF的表達(dá)。說明大黃藿苓湯能改善慢性腎功能衰竭的臨床癥狀，延緩病情的惡化，其機(jī)制可能是抑制慢性腎衰成纖維細(xì)胞生長因子bFGF的表達(dá)，進(jìn)而抑制腎臟纖維組織化。

[1]周小舟,張盛光，陽 曉，等.腺嘌呤所致CRF大鼠的機(jī)理研究[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,1997，17(1)∶54-54.

[2]鄧虹珠,金偉軍，侯連兵，等.慢性腎功能衰竭藥效學(xué)研究的設(shè)計和方法[J].中國中藥雜志,1998,23(4):243-243.

[3]楊朝暉.細(xì)胞因子對腎間質(zhì)纖維化形成的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2004，14（5）:17-18.

[4]EddyAA.Molecular insights into renal interstitial fibrosis[J].JAm Soc Nephrol,1996,7(12)：2495-2580.

[5]韋 穎，樊均明，潘麗萍，等.堿性成纖維細(xì)胞因子對人腎成纖維細(xì)胞的影響[J].中華腎病雜志，2002，18（2）：135-136.

Effectsof dahuang huoling decoction on the expression of bFGF in ratswith chronic renal failure

HANShun-ping1,YANGYou-xin1,YUANChao-sheng2,etal
（1.Tianjin University of TCM， Tianjin， China 300193； 2.The PLA 272Hospital， Tianjin 300020， China）

[Objection]To explore the protective function and ofDahuang Huoling decoction on ratswith chronic renal failure.[Methods]To establish the ratsmodelby using adenine,divide themodel rats into normalgroup,modelgroup,medicated group 1 andmedicated group 2.[Results]The pathology changesof themedicated group 1 and 2were lighter than thatof the controlgroup.Blood Urea Nitrogen(BUN),creatinine,uric acid and bFGFexpressionsofmedicated group 1 were lower than thatof themodelgroup(P<0.05).The bFGF expressions inmedicated group 2werenoobviously differentiation than that inmodelgroup(P>0.05).[Conclusion]Dahuang Huoling decoction had protective function on chronic renal failure of rat kidney caused by adenine.Earlymedication wasmore effective than later period.Itsmechanism can be the restraintin bFGFexpressions.

Dahuang Huoling decoction;adenine;CRF;bFGF

R285.5

A

1672-1519(2010)03-0245-03

天津市自然基金項目（003607811）。

韓順平（1965-），男，碩士，助理研究員，主要從事中醫(yī)治療疑難病的臨床和基礎(chǔ)研究工作。

2010-01-10）