二甲亞砜提取—冷凍離心凈化測(cè)定食品中苯并［a］芘及苯并［e］芘

鄧麗娟，洪 霞，錢瀅文，高志瑩，何海寧，劉 琦，周鑫魁

（1．甘肅省商業(yè)科技研究所，甘肅蘭州 730010；2．甘肅中商食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司，甘肅蘭州 730010）

二甲亞砜提取—冷凍離心凈化測(cè)定食品中苯并［a］芘及苯并［e］芘

鄧麗娟1，2，洪 霞1，2，錢瀅文1，2，高志瑩1，2，何海寧1，2，劉 琦1，2，周鑫魁1，2

（1．甘肅省商業(yè)科技研究所，甘肅蘭州 730010；2．甘肅中商食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司，甘肅蘭州 730010）

建立以二甲基亞砜作為提取溶劑，冷凍離心提取凈化食品中的苯并［a］芘和苯并［e］芘，高效液相色譜—熒光法檢測(cè)的方法。替代傳統(tǒng)的固相萃取小柱凈化方式，能更快速、高效、準(zhǔn)確檢測(cè)食品中苯并［a］芘和苯并［e］芘的含量。2種目標(biāo)物在0．5～1 000 ng／mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，在1～100 ng／g添加量下，回收率為89．0%～91．3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1．19%～1．29%；儀器檢出限為0．01 ng／mL，植物油脂方法檢出限為0．05 ng／g，肉制品和動(dòng)物油脂方法檢出限為0．02 ng／g。該方法測(cè)定動(dòng)植物油脂和肉制品中的苯并［a］芘和苯并［e］芘方便、快捷，適用于批量化檢測(cè)。

二甲亞砜；苯并［a］芘和苯并［e］芘；動(dòng)植物油脂；冷凍離心

苯并［a］芘（BaP）結(jié)構(gòu)為含有五個(gè)苯環(huán)的稠環(huán)芳香烴［1］。是一種高活性致癌劑，是世界公認(rèn)的三大強(qiáng)致癌物質(zhì)（黃曲霉毒素、苯并［a］芘、亞硝胺）之一［2－3］。小劑量苯并［a］芘就能引起局部組織癌變，也可引起大鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA、肺細(xì)胞以及肝細(xì)胞損傷［4－6］。食品在加工過(guò)程中很容易產(chǎn)生苯并芘，例如油料在晾曬過(guò)程中可能受到苯并芘污染，在浸出階段溫度過(guò)高可能產(chǎn)生苯并芘，在油料焙烤時(shí)也可能產(chǎn)生苯并芘［7］。目前由食品污染導(dǎo)致的疾病已成全世界最為廣泛關(guān)注的食品安全問(wèn)題，許多國(guó)家已將苯并［a］芘列為食品有害物質(zhì)檢測(cè)的重要內(nèi)容之一，但是對(duì)苯并［e］芘的檢測(cè)并沒(méi)有相關(guān)國(guó)標(biāo)方法支持。苯并［e］芘是苯并［a］芘的同分異構(gòu)體，致癌性雖然沒(méi)有苯并［a］芘強(qiáng)，但是仍然存在潛在的致癌可能性。經(jīng)過(guò)對(duì)大量油脂及肉制樣品的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，所有樣品中不僅有苯并［a］芘，還含有苯并［e］芘。所以對(duì)苯并［e］芘的檢測(cè)工作也需要引起人們的關(guān)注。

食品中苯并［a］芘的檢測(cè)方法主要有薄層層析法、熒光分光光度法、高效液相色譜法和氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法。薄層層析法操作步驟繁瑣，分析周期長(zhǎng)，不適用大批樣品的處理。其它三種方法在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用較廣泛。我國(guó)動(dòng)植物油脂中苯并［a］芘的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)主要是GB／T 22509—2008，該方法采用反相液相色譜法，植物油脂類樣品通過(guò)石油醚稀釋，經(jīng)氧化鋁固相萃取小柱凈化［9－14］，熒光檢測(cè)器檢測(cè)。液相色譜方法具有自動(dòng)化程度高，熒光檢測(cè)器也具有高靈敏度，但固相萃取小柱由于容量固定，對(duì)苯并［a］芘含量較高的樣品檢測(cè)回收率低，重復(fù)性不好［15－19］。本實(shí)驗(yàn)提出的采用二甲亞砜快速液—液萃取、冷凍離心凈化的方法，其萃取富集率高，結(jié)果穩(wěn)定性好。能有效地凈化樣品，縮短了處理周期，達(dá)到快速又準(zhǔn)確的目的。

1 材料與方法

1．1 試劑與儀器

二甲基亞砜（分析純）：sigma公司；苯并［a］芘（≥99．9%）和苯并［e］芘（≥99．9%）：Dr．Ehrenstorfer GmbH公司；乙腈（色譜純）：北京百靈威科技有限公司。

RX－II離心機(jī)：中國(guó)天美公司；島津LC－20A高效液相色譜儀：日本島津公司；DHG－9073BS－II電熱恒溫干燥箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；IKA圓周振蕩器：德國(guó)IKA公司；XB220電子天平：普利賽斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；DS－1電動(dòng)組織搗碎機(jī)：上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 樣品處理

糧食、肉制品和動(dòng)物油樣品置于組織搗碎機(jī)中搗碎均勻，稱取樣品2．500 g，置于烘箱105℃將水分烘干，約2～3 h，趁熱加入5．00 mL二甲基亞砜，渦旋提取2 min。放入冷凍離心機(jī)中，在20℃、5 000 r／min下冷凍離心10 min，下層液體即為待測(cè)液，0．22 μm尼龍濾膜過(guò)濾后上機(jī)進(jìn)樣。

稱取植物油脂1．00 g于離心管中，加入5．00 mL二甲基亞砜，渦旋提取2 min后，放入冷凍離心機(jī)中，在－4℃的溫度下、5 000 r／min下離心10 min，放入溫度為－4℃冰鹽浴中，棄去上層的植物油脂，在室溫下融化凝固的二甲基亞砜，過(guò)0．22 μm尼龍濾膜后上機(jī)進(jìn)樣。

1．2．2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取苯并［a］芘和苯并［e］芘標(biāo)準(zhǔn)品各10．0 mg，于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到苯并［a］芘和苯并［e］芘濃度均為1 mg／mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。量取1 mg／mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0．10 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到1．00μg／mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別取該混合標(biāo)準(zhǔn)中間液0．05、0．10、1．00、5．00、7．50、10．00 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈定容刻度，得到濃度分別為0．50、1．00、10．00、50．00、75．00、100．00 ng／mL的6個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在高效液相色譜儀中進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)器為帶熒光檢測(cè)器，得到苯并［a］芘和苯并［e］芘的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．2．3 色譜條件

色譜柱：島津ODS－SP柱，5 μm，4．6×250 mm；流動(dòng)相：超純水＋乙腈（超純水和乙腈的體積比為15∶85；流速：1．0 mL／min；柱溫：30．0℃；熒光激發(fā)波長(zhǎng)：384 nm；熒光發(fā)射波長(zhǎng)：406 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2017年3月，英國(guó)地方政府協(xié)會(huì)(Local Government Association)公布了關(guān)于室外空氣污染的指導(dǎo)方針。室內(nèi)空氣質(zhì)量沒(méi)有可比的簡(jiǎn)報(bào)。

圖1 苯并［e］芘和苯并［a］芘色譜圖

2 結(jié)果與分析

2．1 分離效果

圖1為苯并［e］芘和苯并［a］芘標(biāo)準(zhǔn)色譜圖，苯并［e］芘出峰時(shí)間為10．05 min，苯并［α］芘出峰時(shí)間為10．66 min，苯并［e］芘和苯并［a］芘峰型對(duì)稱，分離度好，說(shuō)明該色譜條件能滿足苯并［e］芘和苯并［a］的同時(shí)檢測(cè)。

二甲基亞砜是一種非質(zhì)子極性溶劑，有很強(qiáng)的萃取能力，可以作為芳香烴類抽提溶劑，兩種苯并芘都是典型的芳香烴類化合物，二甲基亞砜可與苯并芘無(wú)限混溶，又具有與油脂不溶的特點(diǎn)，因此可以高效從油脂中萃取苯并芘。再利用二甲基亞砜熔點(diǎn)為18．5℃，可以和植物油脂在－4℃下冷凍離心，形成二甲基亞砜固體下層和植物油脂液體上層，達(dá)到凈化的目的；可以和動(dòng)物油脂在20℃下離心，形成二甲基亞砜液體下層和動(dòng)物油脂固體上層，到達(dá)凈化目的。最后利用苯并芘的熒光特性，經(jīng)過(guò)高效液相色譜儀，檢測(cè)并計(jì)算出樣品中苯并芘的含量。

2．2 回收率及精密度

通過(guò)不同加標(biāo)量下的回收率來(lái)比較兩種方法的精密度，在6份同一種陽(yáng)性菜籽油樣品中加入苯并［a］芘和苯并［e］芘，制備不同質(zhì)量體積濃度的6份加標(biāo)樣品。分別按GB／T 22509—2008和本方法來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

表1 加標(biāo)回收率和精密度測(cè)定結(jié)果（n＝6）

由表1可以看出國(guó)標(biāo)方法回收率隨樣品中苯并芘添加量的增加而降低。而本方法回收率隨樣品中苯并芘含量的增加表現(xiàn)穩(wěn)定，均保持在89．0%～91．3%之間，檢測(cè)濃度范圍可以達(dá)到1．00～100．00 ng／g，比國(guó)標(biāo)GB／T 22509—2008適用檢測(cè)范圍更廣。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1．19%～1．29%之間，表明該方法準(zhǔn)確度和精密度較好，能夠滿足苯并芘含量的檢測(cè)要求。

2．3 凈化效果比較

圖2中色譜圖a為不經(jīng)過(guò)固相萃取柱凈化的樣品，色譜圖b按國(guó)標(biāo)GB／T 22509—2008的方法處理，色譜圖c按本方法處理的油脂樣品液相色譜圖。

圖2 凈化效果圖

從圖2可以看出未凈化油脂樣品的色譜圖中，雜質(zhì)峰很多。按國(guó)標(biāo)方法對(duì)油脂樣品進(jìn)行，固相萃取小柱凈化后，能有效除去雜質(zhì)峰。而本發(fā)明方法也能有效除去樣品中的雜質(zhì)，雜質(zhì)峰明顯減少，且能達(dá)到檢測(cè)要求，其與國(guó)標(biāo)中氧化鋁固相萃取小柱凈化效果相當(dāng)。但比起國(guó)標(biāo)固相萃取法又方便、快捷，且回收率穩(wěn)定，適用于大批量樣品的檢測(cè)。

王浩等用溶劑直接稀釋植物油樣品上機(jī)進(jìn)行分析，操作非常簡(jiǎn)單快速，且重現(xiàn)性好。但因油樣未經(jīng)凈化處理，會(huì)污染色譜柱降低柱效，縮短使用壽命，也可能因雜質(zhì)的存在干擾檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性［17］。本方法既結(jié)合了液液萃取法簡(jiǎn)便快捷的特點(diǎn)又達(dá)到了國(guó)標(biāo)固相萃取的凈化效果，有效地降低雜峰的干擾。

2．4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性回歸方程、相關(guān)性系數(shù)、線性范圍、最低檢出限

以線性范圍評(píng)價(jià)該方法的檢測(cè)濃度范圍，以最低檢出限評(píng)價(jià)該方法靈敏度，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，當(dāng)3倍信噪比對(duì)應(yīng)的濃度為儀器檢出限，由于苯并［a］芘和苯并［e］芘互為同分異構(gòu)體，光譜行為相似，熒光強(qiáng)度相似，所以苯并［a］芘和苯并［e］芘最低響應(yīng)濃度均為0．01 ng／mL，植物油脂樣品采用稀釋5倍的形式進(jìn)行前處理，兩種苯并芘方法檢出限均為0．05 ng／g；肉制品和動(dòng)物油脂樣品采用稀釋2倍的形式進(jìn)行前處理，兩種苯并芘方法檢出限均為0．02 ng／g。

表2 線性回歸方程、相關(guān)性系數(shù)、線性范圍、檢出限及精密度

2．5 適用性實(shí)驗(yàn)

在市場(chǎng)隨機(jī)抽取食用油樣品20份，大米樣品20份，烤肉樣品20份，按照本實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)上述樣品中2種苯并芘的含量。20份食用油中均含有兩種苯并芘，苯并［a］芘含量為0．6～27．4 ng／g，苯并［e］芘含量為0．1～6．3 ng／g，其中有3份食用油樣品中苯并［a］芘的含量超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量10．0 ng／g，菜子油和胡麻油中苯并芘含量較多，橄欖油、花生油中含量較少，這與壓榨工藝有很大關(guān)系。20份大米樣品中2種苯并芘含量均小于1．0 ng／g。20份烤肉樣品中以烤制的樣品不同，苯并芘含量也有很大區(qū)別。如在烤魚、烤豬蹄、烤香腸等樣品中2種苯并芘含量均小于1．0 ng／g，這是因?yàn)闃悠分兄旧?，多為蛋白和淀粉類物質(zhì)不易產(chǎn)生苯并芘。但在烤肉中苯并［e］芘含量為1．8～11．4 ng／g，苯并［a］芘含量為3．3～27．5 ng／g，而且有10份烤肉樣品中苯并［a］芘含量超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量5．0 ng／g，所采集烤肉樣品中大部分以大塊肥肉為材料，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間高溫烤制或油炸，很容易產(chǎn)生苯并芘，僅有1份炭火烤肉樣品為3塊瘦肉加1塊肥肉為材料，其苯并芘含量為4．57 ng／g。食用油脂及烤肉類樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)如表3所示。

表3 樣品檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

本方法以二甲基亞砜作為提取溶劑，二甲基亞砜可與苯并芘無(wú)限混溶，又具有與油脂不溶的特點(diǎn)，因此可以高效的從油脂中萃取苯并芘。再利用二甲基亞砜熔點(diǎn)為18．5℃，可以和植物油脂在－4℃下冷凍離心，形成二甲基亞砜固體下層和植物油脂液體上層，達(dá)到凈化的目的；可以和動(dòng)物油脂在20℃下離心，形成二甲基亞砜液體下層和動(dòng)物油脂固體上層，到達(dá)凈化目的。最后利用苯并芘的熒光特性，經(jīng)過(guò)高效液相色譜儀，檢測(cè)并計(jì)算出樣品中苯并芘的含量。

本方法建立的高效液相色譜—熒光法檢測(cè)動(dòng)植物油脂和肉制品中的苯并芘，具有回收率高，穩(wěn)定性強(qiáng)，檢測(cè)范圍廣，操作簡(jiǎn)便易行，省時(shí)等特點(diǎn)，適用于批量檢測(cè)動(dòng)植物油脂和肉制品中苯并芘的前處理，有效地解決了國(guó)標(biāo)方法的缺點(diǎn)。

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Determination of benzo［a］pyrene and benzo［e］pyrene in food by extraction with dimethyl sulfoxide and purification with refrigerated centrifugation

DENG Li－juan1，2，HONG Xia1，2，QIAN Ying－wen1，2，GAO Zhi－ying1，2，HE Hai－ning1，2，LIU Qi1，2，ZHOU Xin－kui1，2
（1．Gansu Business Science and Technology Institute，Lanzhou Gansu 730010；2．Gansu Zhongshang Food Quality Test and Detection Co．，Ltd．，Lanzhou Gansu 730010）

Benzo［a］pyrene and benzo［e］pyrene in food was extracted and purified by refrigerated centrifugation with dimethyl sulfoxide as solvent and analyzed by HPLC－fluorescence detection method．This method can replace the traditional solid－phase extraction column purification method，which is faster，more efficient and accurate in the detection of benzo［a］pyrene and benzo［e］pyrene content．Both target object showed a good linear relationship within range of 0．5～1 000 ng／mL，when addition was 1～100 ng／g，the recovery rate was 89．0% ～91．3%，and the relative standard deviation was 1．19% ～1．29%；the detection limit was 0．01 ng／mL，vegetable fat detection limit was 0．05 ng／g，meat and animal fat detection limit was 0．02 ng／g．This method is faster and more convenient in the detection of benzo［a］pyrene and benzo［e］pyrene in animal，vegetable fat and meat products，which is suitable for batch detection．

dimethyl sulfoxide；benzo［a］pyrene，benzo［e］pyrene；animal and vegetable oils and fats；refrigerated centrifugation

TS 201．6

A

1007－7561（2017）02－0069－05

2016－08－24

中國(guó)－馬來(lái)西亞科技交流合作項(xiàng)目（1604WKCA001）；甘肅－青海食品研究開(kāi)發(fā)與檢測(cè)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室建設(shè)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（1606RTSA337）

鄧麗娟，1988年出生，女，碩士，工程師．

周鑫魁，1986年出生，男，碩士，工程師．