DHA軟膠囊中3種特征標(biāo)志物的測定及其品質(zhì)評價

杜雙有，宋慧穎，方 靜，沈文忠，李福高

（杭州澳醫(yī)保靈藥業(yè)有限公司，浙江杭州 310018）

DHA軟膠囊中3種特征標(biāo)志物的測定及其品質(zhì)評價

杜雙有，宋慧穎，方 靜，沈文忠，李福高

（杭州澳醫(yī)保靈藥業(yè)有限公司，浙江杭州 310018）

針對不同來源的DHA軟膠囊，建立一種同時測定其3種特征標(biāo)志物的檢測方法，并結(jié)合其他理化指標(biāo)進(jìn)行品質(zhì)的綜合評價。建立的特征標(biāo)志物測定方法為：樣品經(jīng)甲酯化衍生化處理后，采用外標(biāo)法對不同DHA軟膠囊中DHA、EPA、亞油酸的甲酯進(jìn)行檢測，脂肪酸甲酯經(jīng)換算得到相應(yīng)脂肪酸的含量。4個品牌的產(chǎn)品性狀、酸價、過氧化值、砷均符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。特征標(biāo)志物測定的方法學(xué)驗證結(jié)果為：DHA甲酯、EPA甲酯及亞油酸甲酯的精密度RSD分別為1．39%、1．43%、0．5%；線性范圍分別為0．3～2．4 mg／mL、0．2～2．4 mg／mL、0．1～1．6 mg／mL，相關(guān)系數(shù)分別為1．000、0．999 9、1．000，線性關(guān)系均良好；平均回收率分別為96．9%～101．4%、97．5%～100．3%、95．4%～99．6%，準(zhǔn)確度較高；定量限濃度分別為0．08、0．04、0．03 mg／mL；24 h內(nèi)的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)（RSD）分別為3．19%、3．65%、3．02%，說明穩(wěn)定性好。DHA軟膠囊的評價結(jié)果表明：3＃的酸價較高，崩解較慢；2＃的DHA和亞油酸含量較低；0＃DHA軟膠囊的亞油酸含量明顯高于其他品牌。與其他理化指標(biāo)相比，3種特征標(biāo)志物在4個品牌產(chǎn)品之間差異較明顯，可較好地反應(yīng)關(guān)鍵品質(zhì)變化。

DHA；EPA；亞油酸；含量測定；品質(zhì)

DHA是人體所必需的脂肪酸，主要來自于海洋魚類和微藻油［1－2］，Boucher等［3］研究證實DHA對兒童的記憶力有積極作用。還具有降血壓、降血脂、降膽固醇［4－6］的保健作用。來源于藻油或魚油的DHA，還伴隨有EPA等脂肪酸。核桃油具有健腦益智，補腦、增加記憶力、促進(jìn)大腦及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的功能，其主要成分是亞油酸，含量超過50%。核桃油是常見市售植物油中亞油酸含量最高的。DHA油與核桃油搭配具有極高的輔助改善記憶功能，在DHA軟膠囊中已有應(yīng)用。因此，DHA、EPA、亞油酸可作為DHA軟膠囊的特征標(biāo)志物。DHA軟膠囊主要成分為油脂，易變質(zhì)，可引入酸價、過氧化值作為新鮮度指標(biāo)。眾所周知，海洋生物對砷有很強的富集能力，因此，將砷作為DHA軟膠囊的安全性指標(biāo)。

當(dāng)前，國內(nèi)外DHA的主流劑型是軟膠囊，來源于藻油或魚油的產(chǎn)品其處方工藝存在差別，質(zhì)量參差不齊，因此，建立品質(zhì)評價方法非常必要。脂肪酸檢測有氣相色譜法［7］、液相色譜法［8］、氣質(zhì)聯(lián)用法［9］等方法。目前，雖然藻油或魚油中DHA、EPA的檢測方法已有報道，但關(guān)于同時測定DHA軟膠囊的3種特征標(biāo)志物和綜合評價DHA軟膠囊品質(zhì)的研究未見報道。受產(chǎn)品處方工藝影響，采用DHA藻油或動植物油脂檢測的相應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn)［10－11］測定DHA軟膠囊中3種特征標(biāo)志物并非易事，特別是方法回收率低。因此，我們對甲酯化條件和色譜條件進(jìn)行了大量優(yōu)化，以外標(biāo)法對4種不同品牌的DHA軟膠囊進(jìn)行分析。本文不僅建立和驗證了3種特征標(biāo)志物的測定方法，而且結(jié)合性狀、酸價、過氧化值、砷等理化指標(biāo)對DHA軟膠囊品質(zhì)進(jìn)行綜合評價，有利于進(jìn)一步推動DHA產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

DHA軟膠囊：0＃DHA藻油軟膠囊（批號20150312、20150422、20150513），1＃DHA藻油軟膠囊（批號20150707），2＃魚油?；撬彳浤z囊（批號20150302E），3＃兒童魚油膠囊（批號268672）。

二十二碳六烯酸甲酯（C23H34O2）：美國NUCHEK，純度＞99；二十碳五烯酸甲酯（C21H32O2）：美國NU－CHEK，純度＞99%；亞油酸甲酯：阿拉丁，純度＞99%。

氯化鈉、無水硫酸鈉、異辛烷、甲醇、沸石、乙醚、乙醇、碘化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鉀、硼氫化鉀、硫脲、鹽酸、硝酸、硫酸、高氯酸、氧化鎂、抗壞血酸、酚酞指示劑、淀粉指示劑、硫代硫酸鈉、三氯甲烷、冰醋酸：均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。砷標(biāo)準(zhǔn)儲備液：國家化學(xué)試劑質(zhì)檢中心。

1．2 儀器與設(shè)備

氣相色譜儀7890A：安捷倫科技有限公司；AFS－930原子熒光光度計：島津公司；WX－8000微波消解儀：上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司；XPE－205電子天平：梅特勒—托利多國際股份有限公司；馬弗爐和水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；智能磁力攪拌器：鞏義予華儀器ZNCL－GS。

1．3 方法

1．3．1 常規(guī)理化指標(biāo)測定方法

感官指標(biāo)中色澤、氣味、滋味的測定，酸價（以KOH mg／g計）的測定以及過氧化值的測定：均參照GB／T 5009．37—2003《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》。有害金屬指標(biāo)總砷的測定：參照GB／T 5009．11—2003《食品中總砷及無機(jī)砷的測定》。崩解時限檢測：按《中華人民共和國藥典》2015年版第四部＜0921＞的方法。

1．3．2 特征標(biāo)志物測定方法的建立和驗證

本文以《GBT 17376—2008動植物油脂脂肪酸甲酯制備》和《GBT 17377—2008動植物油脂脂肪酸甲脂的氣相色譜分析》為基礎(chǔ)，通過大量優(yōu)化DHA軟膠囊的衍生化方法以及色譜條件，選擇分析時間短、分離度好、抗干擾能力強的分析方法。

1．3．2．1 初步建立的特征標(biāo)志物測定方法

稱取DHA軟膠囊內(nèi)容物約400 mg于50 mL圓底燒瓶，加入氫氧化鈉甲醇溶液4 mL，水浴上磁力攪拌并回流?；亓髦巴ㄈ氲獨? min，接上冷凝管回流30 min，用移液管從冷凝器頂部加入7 mL三氟化硼甲醇溶液于沸騰溶液中，繼續(xù)回流15 min。加入5 mL異辛烷于沸騰溶液，取下冷凝管，加入氯化鈉飽和溶液20 mL，振搖1 min。將回流液加入分液漏斗進(jìn)行萃取，取上部有機(jī)相。底部水相，再加入5 mL異辛烷，進(jìn)行二次萃取。合并萃取液，加少量無水硫酸鈉，振搖后靜置，取上清液，用異辛烷適當(dāng)稀釋后進(jìn)行測定。

氣相色譜條件：色譜柱，安捷倫HP－INNOWAX毛細(xì)管柱（30 m×0．25 mm×0．5 μm）；進(jìn)樣量1 μL；采用程序升溫，初始溫度170℃，保持2 min，以5℃／min升溫至240℃，保持10 min；進(jìn)樣口溫度200℃；FID檢測器溫度260℃；分流比50∶1；氮氣流量為40 mL／min。

1．3．2．2 特征標(biāo)志物測定方法的驗證

（1）線性方程

稱取適量DHA甲酯標(biāo)準(zhǔn)品、EPA甲酯標(biāo)準(zhǔn)品、亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制成0．3、0．6、1．2、1．8、2．4 mg／mL DHA甲酯溶液，0．2、0．4、0．8、1．6、2．4 mg／mL EPA甲酯溶液，和0．1、0．4、0．8、1．2、1．6 mg／mL亞油酸溶液。DHA甲酯、EPA甲酯、亞油酸甲酯在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)均與其峰面積呈線性關(guān)系，線性方程分別為Y＝337．82X＋0．302 3、Y＝380X＋8．332 2、Y＝583．33X＋4．232 3，線性相關(guān)系數(shù)分別為1．000、0．999 9、1．000。

（2）精密度

稱取0＃DHA藻油軟膠囊內(nèi)容物按1．3．2．1進(jìn)行樣品處理，各取1 μL進(jìn)樣，平行進(jìn)樣6次，測得DHA、EPA、亞油酸含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1．39%、1．43%、0．5%，表明該色譜條件下精密度良好。

（3）準(zhǔn)確度

采用加樣回收率法，在已知DHA、EPA、亞油酸含量的樣品中加入1 mL的1 mg／mL DHA甲酯溶液、0．1 mL的1 mg／mL EPA甲酯溶液和0．85 mL的1 mg／mL亞油酸甲酯溶液，然后按樣品測定方法預(yù)處理后進(jìn)樣分析，得DHA回收率為96．9%～101．4%，EPA回收率為97．5%～100．3%，亞油酸回收率為95．4%～99．6%。因此，本方法完全滿足分析要求。

（4）定量限

分別移取適量DHA甲酯、EPA甲酯、亞油酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，用異辛烷逐漸稀釋后進(jìn)樣，直至三者的氣相色譜圖的信噪比約為10∶1，即得定量限。DHA甲酯、EPA甲酯、亞油酸甲酯的定量限濃度分別為0．08、0．04、0．03 mg／mL。

（5）樣品的溶液穩(wěn)定性

稱取適量DHA藻油軟膠囊內(nèi)容物，按1．3．2．1處理。將樣品在室溫下分別放置0、2、4、6、24 h，取樣測定。在24 h內(nèi)，DHA甲酯、EPA甲酯、亞油酸甲酯相應(yīng)峰面積的RSD分別為3．19%、3．65%、3．02%，均小于10%，符合規(guī)定。因此，說明供試品溶液在常溫狀態(tài)下短期放置其脂肪酸未產(chǎn)生明顯分解。

2 結(jié)果與分析

2．1 色譜柱的選擇

DHA、EPA和亞油酸均為脂肪酸。參考有關(guān)資料，本實驗分別篩選了安捷倫DB－WAX、HP－INNOWAX色譜柱，實驗結(jié)果表明HP－INNOWAX色譜柱分離效果好、分析時間短，適合DHA軟膠囊3種特征標(biāo)志物的分析檢測，色譜圖見圖1。在該色譜柱下，DHA甲酯、EPA甲酯、亞油酸甲酯的保留時間分別為24．1、18．2、12．9 min。

圖1 氣相色譜圖

2．2 萃取次數(shù)對結(jié)果的影響

DHA甲酯在衍生化結(jié)束后需用異辛烷萃取，本實驗考察了異辛烷萃取次數(shù)對實驗結(jié)果的影響。實驗結(jié)果采用外標(biāo)法，得出萃取一次，DHA萃取率為70．8%；萃取兩次，DHA萃取率約為99．2%，萃取率明顯提高；萃取三次，DHA萃取率約為99．6%，與萃取2次結(jié)果并無顯著差異。因此，確定萃取2次合適。EPA甲酯和亞油酸甲酯與DHA甲酯相似，確定萃取2次較佳。

2．3 氣相色譜分流比對結(jié)果的影響

當(dāng)進(jìn)樣量為1 μL時，需改變分流比以達(dá)到較好的分離效果。當(dāng)分流比為10∶1時，色譜柱超載；分流比為50∶1時，色譜峰強度適中，可用于樣品的分析，因此最終確定分流比為50∶1。同時，實驗過程中發(fā)現(xiàn)分流比對亞油酸等成分具有較大的分流歧視現(xiàn)象，故對于含量測定采用外標(biāo)法比國家標(biāo)準(zhǔn)中的面積歸一法準(zhǔn)確性更高。

2．4 皂化和甲酯化的試劑用量和時間

氫氧化鈉甲醇溶液和三氟化硼甲醇溶液的用量在反應(yīng)過程中直接影響甲酯化的速度和程度。本實驗考察了不同試劑用量與反應(yīng)時間對結(jié)果的影響：分別設(shè)定氫氧化鈉甲醇溶液3、4、5、6 mL，三氟化硼甲醇溶液5、6、7、8 mL，皂化時間10、20、30、60 min，甲酯化時間5、10、15、20 min，得出適當(dāng)延長皂化反應(yīng)時間對整個甲酯化過程影響較大。以GBT 17376為基礎(chǔ)，經(jīng)預(yù)實驗和單因素對比實驗優(yōu)化，得出最佳衍生化條件為：氫氧化鈉甲醇溶液4 mL，三氟化硼甲醇溶液7 mL，皂化反應(yīng)時間30 min，甲酯化時間15 min。

2．5 氮氣保護(hù)時間

作為不飽和脂肪酸，DHA含有6個碳碳雙鍵，雙鍵含孤電子對，極不穩(wěn)定，極易被氧化，實驗過程中要用氮氣保護(hù)，防止在皂化、甲酯化過程中DHA被氧化。從表1可以看出，回流之前通入氮氣3 min與6 min差別不大，通入氮氣可以顯著提高DHA甲酯的含量，故選用3 min的通氮時間。

表1 氮氣保護(hù)對DHA軟膠囊3種特征標(biāo)志物含量的影響（n＝3） %

2．6 不同品牌DHA軟膠囊的理化指標(biāo)

從表2可看出，3＃兒童魚油膠囊，酸價和過氧化值較高、崩解時限較長。從軟膠囊殼硬度來看，3＃兒童魚油膠囊硬度最大。1＃DHA藻油軟膠囊有較明顯腥味，可能是軟膠囊內(nèi)容物部分物質(zhì)遷移出軟膠囊殼引起的。所測DHA軟膠囊的酸價均低于1 KOH mg／g、過氧化值均低于0．1 g／100 g，符合《GB 15196—2015食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食用油脂制品》的要求。

表2 不同品牌產(chǎn)品的理化指標(biāo)比較

DHA主要從海洋生物中提取，而海洋生物對砷有很強的富集能力，并且砷是一種毒性很強的元素，因此對產(chǎn)品中砷含量應(yīng)有限制。由表2可知，4個品牌的DHA軟膠囊砷含量均低于1 mg／kg，符合《GB 16740—2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)保健食品》的要求。

2．7 特征標(biāo)志物的結(jié)果與分析

稱取各品牌DHA軟膠囊內(nèi)容物適量，按1．3．2．1分別處理。進(jìn)樣1 μL，所得色譜圖如圖2所示。因?qū)φ掌窞橹舅峒柞ィ嬎憬Y(jié)果以游離酸表示，所以DHA、EPA和亞油酸的含量需根據(jù)分子量比值（酸／酯）進(jìn)行換算，換算系數(shù)分別為0．959 1、0．955 8、0．952 0。不同來源的軟膠囊內(nèi)DHA、EPA、亞油酸含量如表3所示。

圖2 不同品牌DHA軟膠囊的色譜圖

表3 不同品牌DHA軟膠囊的3種特征標(biāo)志物含量（n＝3）%

從表3可以看出，來源于藻油的DHA軟膠囊，其EPA含量明顯低于來源于魚油的產(chǎn)品。0＃DHA藻油軟膠囊是所有品牌中亞油酸含量最高的。本次實驗所測產(chǎn)品中DHA含量最大值是最小值的2．46倍，由此可見，市場上DHA軟膠囊的質(zhì)量參差不齊。

藻油主要來源于海洋藻類，含極少量的EPA；而魚油的EPA含量較高。DHA主要消費人群是嬰幼兒和孕婦，研究表明過量的EPA會對人多血管發(fā)育造成損害。藻類的DHA含量高，EPA含量低，且容易吸收，是補充DHA的理想產(chǎn)品。另外，0＃DHA藻油軟膠囊中的亞油酸含量達(dá)17%左右，主要來源于產(chǎn)品中添加的核桃油。

3 結(jié)論

本文所測4個品牌的DHA軟膠囊，其氣味、酸價、過氧化值、砷，基本接近，符合相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)。與其他理化指標(biāo)相比，3種特征標(biāo)志物含量在4個品牌產(chǎn)品之間存在較明顯差異，可較好地反映關(guān)鍵品質(zhì)變化。特征標(biāo)志物測定方法經(jīng)線性、精密度、回收率、定量限、穩(wěn)定性的方法學(xué)驗證，確定該分析方法可靠、重現(xiàn)性好，可用于不同DHA軟膠囊中DHA、EPA和亞油酸的含量測定。本文對不同品牌DHA軟膠囊的品質(zhì)進(jìn)行綜合評價，可為DHA軟膠囊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供參考。

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［10］GB／T 17376－2008，動植物油脂脂肪酸甲酯制備［S］．

［11］GB／T 17377－2008，動植物油脂脂肪酸甲脂的氣相色譜分析［S］．

Determination of 3 kinds of characteristic markers in DHA soft capsules and its quality assessment

DU Shuang－you，SONG Hui－ying，F(xiàn)ANG Jing，SHEN Wen－zhong，LI Fu－gao
（Hangzhou Aoyipollen Pharmaceutical CO．，LTD．，Hangzhou Zhejiang 310018）

A method was established for the simultaneous determination of 3 kinds of characteristic markers in DHA soft capsules from different sources．The other physicochemical indexes were comprehensive assessed．The method was：after methyl esterification and derivatization，the methyl esters of DHA，EPA and linoleic acid in different DHA soft capsules were detected by external standard method，and then the contents of the corresponding fatty acid were obtained by conversion．The product characteristics，acid value，peroxide value and arsenic of 4 samples from different companies were in line with relevant national standards．The results of verification test for the determination of DHA methyl ester，EPA methyl ester and linoleic acid methyl ester were as follows：the precisions were 1．39%，1．43%，0．5%；the linear ranges were 0．3～2．4 mg／mL，0．2～2．4 mg／mL，0．1～1．6 mg／mL；the correlation coefficients were 1．000，0．999 9 and 1．000，which showed good linear relationship；the average recovery ranges were 96．9%～101．4%，97．5%～100．3%，95．4%～99．6% ，respectively，which showed that the method had high accuracy；the concentrations of the limit of quantitation（LOQ）were 0．08，0．04，0．03 mg／mL，respectively．The stability data（RSD）within 24 h were 3．19%，3．65%，3．02%，which indicated that the sample had good stability．The evaluation results of DHA soft capsule showed that the 3＃hadhigh acid value and slow disintegration，the 2＃had low content of DHA and linoleic acid，and the 0＃had the highest content of linoleic acid among the samples．Compared with other physicochemical indicators，the difference among 4 brand products on the 3 kinds of characteristic markers were larger and the markers were suitable to reflect the key quality．

DHA；EPA；linoleic acid；content determination；quality

TS 227

A

1007－7561（2017）02－0051－05

2016－08－05

農(nóng)業(yè)科研攻關(guān)專項（20140432 B109）

杜雙有，1972年出生，女，工程師．

李福高，1979年出生，男，高級工程師．