主動脈夾層患者升主動脈中層彈性蛋白與彈力纖維的變化

戚悠飛，舒暢，羅明堯，方坤，張文波，肖占祥

（1. 海南省人民醫(yī)院 血管外科，海南 ?？?70311；2. 中南大學湘雅二醫(yī)院 血管外科，湖南 長沙410011；3. 中國醫(yī)學科學院阜外醫(yī)院 血管外科中心，北京 100037）

主動脈夾層（aortic dissection，AD）指主動脈血流經內膜破口進入主動脈壁內，沿管壁中膜層進一步剝離延伸，形成假腔，從而造成主動脈真、假腔分離的一種病理改變。主動脈壁（尤其是中膜層）結構的改變是發(fā)生AD的形態(tài)學基礎[1]。主動脈屬彈性大動脈，其中膜層是維持主動脈彈性和承載動脈壁搏動性應力的關鍵結構，其主要結構成份是彈力纖維（elastic fibers）和膠原纖維組成的細胞外基質[2]，彈性蛋白（elastin）則是彈力纖維的最主要結構成份[3]。目前國內關于AD患者主動脈中膜層彈性蛋白和彈力纖維表達的研究較少，本研究擬從彈性蛋白和彈力纖維在Stanford A型AD升主動脈管壁的差異表達方面探討AD發(fā)生的結構基礎。

1 材料與方法

1.1 標本與分組

AD組織標本于2016年1月—2017年3月間在海南省人民醫(yī)院和中國醫(yī)學科學院阜外醫(yī)院術中采集（AD組），入組標準：診斷Stanford A型AD[4]，并在術中證實。排除標準：排除合并有Ehlers-Danlos綜合征、Marfan綜合征等結締組織疾病，外傷、妊娠和醫(yī)源性損傷引起的AD，主動脈瓣二瓣畸形，明顯的動脈粥樣硬化以及有明確家族遺傳史的AD患者。對照組標本取自海南省人民醫(yī)院同期腦死亡患者行多器官捐獻時和冠狀動脈旁路移植（CABG）術中的升主動脈標本 ，并且排除肉眼檢查發(fā)現(xiàn)合并AD或動脈瘤等主動脈疾病的標本。兩組標本術中采集后立即沖洗，修剪成形，一部分置液氮或–80 ℃冰箱冷凍保存，另一部分置10%中性甲醛溶液固定。

AD組10例，其中男7例，女3例；年齡42～67歲，中位年齡53歲。對照組10例，其中男性8例，女性2例；年齡31～72歲，中位年齡51歲，對照組中4例標本為腦死亡患者行多器官捐獻時采集，其余為CABG術中升主動脈的打孔標本。兩組標本所采集患者的年齡及性別差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性（t=0.628、χ2=1.715，均P＞0.05）。

本研究方案經醫(yī)院倫理委員會批準，所有標本采集均獲得患者本人或家屬的知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

兔抗人彈性蛋白多克隆抗體（ab23747）及鼠抗人β-actin單克隆抗體（ab8226）購自美國Abcam公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG、HRP標記的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋。Bradford法蛋白質定量試劑盒購自大連美侖。ECL顯色試劑盒購自上海榕柏。EVG染色所用部分試劑均購于珠海貝索。

1.3 方法

1.3.1 Western blot檢測升主動脈中膜層彈性蛋白表達 取凍存升主動脈標本中膜層組織150 mg經冰上研磨、勻漿、裂解，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，收集含蛋白上清液。Bradford法測定總蛋白濃度。蛋白樣品（25 μg）與5×上樣緩沖液1:4配比后與蛋白Marker在100 ℃水浴5 min后上樣。經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）電泳分離，電轉至PVDF（polyvinylidene fluoride）膜，常溫封閉60 min，漂洗。分別加入稀釋的兔抗人彈性蛋白多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，次日洗膜后加入稀釋的二抗（HRP標記的羊抗兔、羊抗鼠IgG），ECL顯色，暗室曝光顯示條帶。實驗重復3次。各條帶顯影圖像用Image J圖像分析軟件處理、分析，以目的蛋白（彈性蛋白）/內參（β-actin）灰度積分比值代表彈性蛋白的相對表達量。

1.3.2 EVG彈力纖維染色檢測升主動脈中膜層彈力纖維形態(tài)和表達 升主動脈標本用10%中性甲醛固定，沿管壁橫斷面取材。石蠟包埋切片，厚4 μm，脫蠟至水；滴加0.5%高錳酸鉀溶液氧化5 min，水洗；滴加2%草酸漂白，水洗；95%乙醇稍洗，浸Weigert氏雷鎖辛品液，室溫1～2 h；95%乙醇分化至背景清晰，水洗；Van Gieson染液對比染色1 min，95%乙醇快速分化5 s，水洗；無水乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固[5]。染色結果：彈力纖維呈藍黑色、細胞核呈藍色、膠原纖維呈紅色。在每張玻片顯示的中膜層選擇5個視野，采用Image-Pro Plus 6.0軟件對每個視野進行累積光密度（integrated optical density，IOD）分析，分析選取目標為藍黑色的區(qū)域（彈力纖維），通過IOD值可大致判定每個視野中藍黑色顏色區(qū)域顏色及深淺程度的相對累積值。比較兩組升主動脈中膜層形態(tài)及彈力纖維形態(tài)與表達。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，偏態(tài)分布計量資料以中位數(shù)表示。組間比較，計量資料采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，彈性蛋白與彈力纖維表達的相關性采用雙變量直線相關分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 彈性蛋白表達檢測結果

AD組升主動脈管壁中膜層彈性蛋白表達量為0.32±0.07，對照組為1.12±0.17，AD組升主動脈管壁中膜層彈性蛋白表達量較對照組明顯降低（t=6.722, P=0.003）（圖1）。

圖1 Western blot檢測升主動脈管壁中膜層彈性蛋白表達Figure 1 Western blot analysis of the elastin expressions in the tunica media of the ascending aortas

2.2 彈力纖維表達及形態(tài)檢測結果

對照組見主動脈壁中膜層結構完整、層次分明，中膜層血管平滑肌細胞排列整齊，彈力纖維排列緊密、有序，彈力板結構完整（圖2A）。AD組見主動脈中膜撕裂，其內可見血栓附著；平滑肌細胞明顯減少，部分區(qū)域成片消失；彈力纖維破碎、斷裂、稀釋、丟失，排列不規(guī)則，彈力板層斷裂、丟失，尤其在中膜撕裂處更為明顯；中膜外層及外膜層膠原纖維增生（圖2B）。IOD值顯示AD組為85 762.8±106.2，對照組為164 482.8±161.4，AD組較對照組IOD值明顯降低（t=5.902，P＜0.001）。

2.3 兩組升主動脈中膜層彈性蛋白和彈力纖維表達的相關性

根據(jù)彈性蛋白與彈力纖維的（相對）表達量進行雙變量直線相關分析，結果顯示，AD組和對照組的升主動脈管壁中膜層彈性蛋白與彈力纖維表達均呈明顯正相關關系（r=0.953、0.973，均P＜0.001）（圖3）。

圖2 升主動脈管壁EVG染色（×200） A：對照組；B：AD組Figure 2 EVG staining of the ascending aortic walls (×200) A: Control group; B: AD group

圖3 升主動脈中膜層彈性蛋白與彈力纖維表達的相關性分析 A：對照組；B：AD組Figure 3 Correlation analysis of the elastin and elasticfiber contents in the tunica media of the ascending aortas A: Control group;B: AD group

3 討 論

AD是一種致死率極高的主動脈急癥，其每年發(fā)病率約0.5～3/10萬，并逐年呈上升趨勢，嚴重威脅人類健康，消耗大量的醫(yī)學資源和社會財富，因而越來越受到重視，深入研究AD的病因與發(fā)病機制具有重大意義[6-8]。但是AD的病因至今尚未完全明了，主動脈壁中層退行性變、遺傳性結締組織病、先天性主動脈畸形、妊娠、醫(yī)源性因素及外傷等均有報道參與AD的形成[9-11]，上述因素可能造成主動脈管壁結構和功能的改變而誘發(fā)AD。遺傳性疾病如Marfan綜合征患者有糖蛋白fibrillin-1的缺陷，而Ehlers-Danlos綜合征患者則有Ⅲ型前膠原的合成異常，都導致主動脈壁強度減弱，發(fā)生AD。但是我們所見大部分散發(fā)性AD患者并沒有上述明確的綜合征，是否存在主動脈壁結構和性質的改變以及何種因素導致這種改變，有待深入研究。

在主動脈中膜層結構中，彈力纖維與管壁順應性有關，在外力作用下彈力纖維可伸長70%，是維持主動脈軸向回縮力的主要成份；膠原纖維則與管壁的極限強度有關，伸縮性不及彈力纖維1%。在生理血壓條件下彈力纖維是主要的受力纖維，大部分膠原纖維處于功能儲備狀態(tài)，只是在管壁擴張幅度過大時才受力。中膜層由數(shù)十層環(huán)形排列的彈力層組成，每層彈力層由彈力纖維相互交叉形成網狀結構，膠原纖維穿插其中，相鄰兩薄層間為一層平滑肌細胞。既往研究[12]認為主動脈壁彈力纖維表達或排列的改變可能導致夾層、動脈瘤等主動脈疾病，管壁中層彈力層結構的毀損和缺失是AD特征性病理改變之一[13]。目前對疾病病因的研究已經深入到基因水平，但是生物功能的主要體現(xiàn)或執(zhí)行者是蛋白質，所以本研究先從彈性蛋白和彈力纖維水平探討其在AD病因和發(fā)病機制中的作用。

3.1 AD時主動脈管壁的彈性蛋白表達

彈力纖維主要由有序排列的無定型核心（amorphous core，AC）和微纖維“框架”在Loxl-1等賴氨酰氧化酶家族成員交聯(lián)“組裝”下，按照一定比例和程序逐級組裝而成，合成過程異常精密，涉及彈性蛋白分泌、激活、吸附、聚合、沉積、交聯(lián)等過程[14-15]。彈性蛋白是無定型核心的主要成份，主要由中膜層血管平滑肌細胞合成。彈性蛋白表達下降可導致多種彈力纖維相關疾病，如盆腔器官脫垂、顱內動脈瘤、年齡相關性黃斑退行性病變等[16-18]。既往有關彈性蛋白在AD發(fā)病機制中作用的研究多從彈性蛋白酶、炎癥反應等對彈力纖維降解的角度展開[19-20]，然而AD時是否存在彈性蛋白合成和表達異常值得關注。本研究顯示AD組主動脈中膜層彈性蛋白的表達明顯較對照組低，說明彈性蛋白的低表達有可能通過改變主動脈管壁的機械強度，導致AD發(fā)生[21]。

3.2 AD時主動脈管壁的彈力纖維表達

彈力纖維是主動脈管壁最重要的纖維，是維持主動脈壁結構和功能的最主要結構成份。Schmitto等[22]研究認為胸主動脈夾層患者升主動脈血管組織中彈力纖維及膠原纖維稀疏、斷裂、結構紊亂，伴血管組織細胞凋亡明顯增加，血管壁病理性重構。因此，可以推測任何造成造成主動脈中膜彈力纖維損害的因素，均可能誘發(fā)AD。本研究通過EVG染色顯示：AD組升主動脈中膜層彈力纖維形態(tài)和排列不規(guī)則，出現(xiàn)彈力纖維破碎、斷裂、稀疏、丟失，彈力板斷裂、丟失，層狀結構受到破壞，彈力板層間相互連接減少，黏附性減弱，從而使主動脈易于發(fā)生夾層。結合彈性蛋白的Western blot實驗結果，可以推測彈力纖維形態(tài)和結構紊亂可能與彈性蛋白的表達下調有關，繼而導致主動脈中膜層纖維結構改變，導致AD發(fā)生。本研究也顯示AD組和對照組的升主動脈中膜層彈性蛋白與彈力纖維表達均呈明顯的正相關關系。

當然AD發(fā)生是一個復雜的病理過程，彈性蛋白的表達差異僅僅是AD主動脈壁結構、成份改變的一個重要方面，彈性蛋白“組裝”成彈力纖維過程中的任何微纖維蛋白、酶類（如Loxl-1）的缺陷都有可能導致AD發(fā)生[23]，需要進一步行主動脈管壁差異蛋白質組學的研究，以了解是否存在其他更多的重要結構蛋白在AD和正常主動脈之間存在差異表達。

綜上所述，根據(jù)上述實驗結果，可以推知彈性蛋白在主動脈中膜層表達下調，可能影響彈力纖維的合成，從而導致主動脈中膜層薄弱，承受血流張力和剪切力能力下降，可能在AD的發(fā)生中起重要作用。而關于彈性蛋白表達改變的分子生物學機制及其在AD發(fā)病機制的作用有待進一步深入研究。

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