硫代乙酰胺誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型合并腎臟病變

秦冬梅，李靜，陳文，王新春

（1石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子832002；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子832002）

硫代乙酰胺誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型合并腎臟病變

秦冬梅1*，李靜2，陳文1，王新春2

（1石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子832002；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子832002）

為建立硫代乙酰胺誘導(dǎo)大鼠肝纖維模型，分析肝組織病理切片及肝纖維血清指標(biāo)等，并檢查腎臟病理改變。方法：選取Wistar大鼠60只，隨機分為對照組30只、模型B組、模型C組、模型D組，每組10只。根據(jù)大鼠體重，采用腹腔隔天注射硫代乙酰胺誘導(dǎo)肝纖維化，觀察大鼠肝纖維化形成情況與腎臟組織學(xué)變化。結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠ALT、AST血清濃度均升高（P<0.01）,T-SOD活性顯著降低，GSH-PX活性顯著降低，MDA含量顯著升高（P< 0.01）。模型C組與模型D組LN、HA與對照相比有明顯差別(P<0.01)，模型D組CIV、PCⅢ與對照相比有明顯差別(P< 0.05)。模型B組LN與對照組相比有明顯差別(P<0.01)。肝臟病理組織提示模型組大鼠肝細胞大量壞死，假小葉形成，腎組織有輕度病變。由此可知，硫代乙酰胺能誘導(dǎo)大鼠形成肝纖維化，并且造成腎臟病理改變。

硫代乙酰胺（TAA)；肝纖維化；腹腔注射

慢性肝病是一類十分常見的疾病，肝纖維化（Hepatic fibrosis，HF） 是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)的病理過程[1-2]。肝纖維化是指由于肝損傷誘因的持續(xù)存在，導(dǎo)致肝細胞持續(xù)壞死，繼發(fā)肝臟類炎癥或損傷后修復(fù)過程中持續(xù)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肝臟內(nèi)纖維性結(jié)締組織異常增生，以細胞基質(zhì)在肝內(nèi)過量沉積為特征的病理變化。其終末階段稱為肝硬化，最終導(dǎo)致肝衰竭門脈高壓和肝癌。如果要深入研究肝纖維化的發(fā)病機制，成功建立比較接近人肝纖維化的動物模型是首要問題。它必須是一個慢性的發(fā)生發(fā)展過程，且應(yīng)該成模率高，制模方法簡易過程，且成模后逆變緩慢，便于探討肝纖維化形成的分子機制和抗肝纖維化藥物的作用機理[3]。

本研究中，我們選用硫代乙酰胺誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生肝纖維化模型，分析肝組織病理切片及肝纖維血清指標(biāo)等，考察該方法成模率及形成機制，并且觀察該化合物對主要排泄器官腎臟的影響，旨在為進一步模型給藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

Wistar大鼠60只（180-250 g）（新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心）（合格證號：2011-00145）。

1.1.2 藥品與試劑

硫代乙酰胺TAA（分析純，天津市光復(fù)精細化工研究所）、蒸餾水、甲醛溶液（分析純，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司）、0.9%Nacl注射液（西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司)、AST、ALT、T-SOD、MDA、GSH-PX、LN、PCⅢ、CIV與HA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 儀器

FA2104B電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、一次性注射器、大鼠解剖器具、電熱恒溫水浴鍋（北京長安科學(xué)儀器廠）、722N型可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、TDL-5臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠)、漩渦混合器（江蘇海門其林醫(yī)用儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型建立

將60只大鼠按分層隨機分籠法分為對照組與模型B組、模型C組、模型D組，對照組30只，模型組每組10只。所有大鼠在常溫條件下自由飲水自由攝取標(biāo)準(zhǔn)鼠糧，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后再進行實驗。

將TAA用滅菌注射用水配制成質(zhì)量濃度為40 mg/mL的溶液。模型1組、模型2組和模型3組以200 mg/kg隔日腹腔內(nèi)注射。

1.2.2 標(biāo)本的收集與處理

大鼠分別于三周末、五周末、七周末給藥后24小時用戊巴比妥以mg/kg1腹腔注射麻醉后，經(jīng)腹主動脈采血，離心 15 min（3000 r/min），分離血清，冷凍保存，備用。

觀察肝臟顏色及形態(tài)后取出，經(jīng)0.9%生理鹽水灌注沖洗殘血，大鼠肝臟用10%中性甲醛固定，用于病理診斷。

1.2.3 觀察指標(biāo)及測定方法

1.2.3.1 一般情況、體質(zhì)量及肝脾指數(shù)

定期觀察大鼠的體態(tài)變化,記錄體重。用電子天平稱取大鼠肝臟和脾臟的質(zhì)量，計算器官指數(shù)。器官指數(shù)=器官質(zhì)量(g)/大鼠體重(g)*100。

肝臟標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋切片，進行HE染色。于光鏡下觀察肝組織炎癥，由同一病理?？漆t(yī)生予以纖維化分級。

1.2.3.2 血清肝功及肝纖維指標(biāo)

血清AST、ALT、T-SOD、MDA、GSH-PX、Ⅲ型前膠原N端肽（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（IV-C）、層粘連蛋白（LN）與透明質(zhì)酸（HA）檢測按試劑盒說明書進行操作，由全自動生化分析儀測定。

1.2.3.3 肝組織病理學(xué)檢測

將取下的肝組織標(biāo)本用10%甲醛固定后，常規(guī)脫水，包埋，制作成5 μm厚切片，HE染色，光鏡下觀察。HE染色由石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科專家盲法閱片，分別在低倍鏡(×10)、高倍鏡(×40)下觀察肝組織的病理學(xué)改變。

肝纖維程度判斷標(biāo)準(zhǔn)參照王泰齡等[4-5]提出的慢性肝炎分類、分級與分期的統(tǒng)計方法。肝纖維化程度分級標(biāo)準(zhǔn)為:

0:無纖維化；

Ⅰ:輕度纖維化，纖維沉積僅位于小葉中央；

Ⅱ:中度纖維化，纖維沉積擴展至小葉中央之外，但未至小葉邊緣；

Ⅲ:嚴(yán)重肝纖維化，纖維沉積擴展至小葉邊緣；

Ⅳ:早期肝硬化(定性標(biāo)準(zhǔn))。

1.2.3.4 腎組織病理學(xué)檢測

腎臟摘下后去除包膜，長軸方向?qū)η小?0%中性福爾馬林固定、石蠟包埋切片，切片厚度4 μm。切片HE染色光鏡觀察20個高倍視野。病理損傷標(biāo)準(zhǔn)：

（1）腎小管損傷標(biāo)準(zhǔn)：細胞空泡變性、小管塌陷(與間質(zhì)纖維化和小管膜增厚無關(guān))、小管腫脹；

（2）腎間質(zhì)損傷標(biāo)準(zhǔn)：單個核細胞浸潤，間質(zhì)細胞空泡變性、水腫及間質(zhì)纖維化、瘢痕化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，采用t檢驗。P＜0.05認(rèn)為差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01認(rèn)為差異有非常顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組大鼠一般生存情況

造模期間,模型B組大鼠死亡1只，肝纖維化形成率為60%。模型C組死亡1只，肝纖維化形成率為90%。模型D組死亡4只，肝纖維化形成率為90%。

死亡原因為注射TAA過量所致（誘導(dǎo)期的肝臟相對敏感），剖腹可見肝臟腫脹并大面積壞死，其中兩只出現(xiàn)肝腹水。對照組未出現(xiàn)死亡。

2.2 各組大鼠質(zhì)量變化

對照組大鼠平均質(zhì)量整體高于模型各組大鼠平均質(zhì)量。對照組大鼠體質(zhì)量增長呈上升趨勢，模型組大鼠的體質(zhì)量在14 d內(nèi)下降較快，35 d后大鼠體質(zhì)量變化不大，趨于平穩(wěn)。建立的模型表明：大鼠體質(zhì)量變化為10 g-20 g，提示有適度肝臟損害以維持肝硬化進程[7]。

2.3 各組大鼠器官指數(shù)變化

各組大鼠器官指數(shù)變化見表1。

與對照組相比，模型B組大鼠的肝臟指數(shù)顯著性升高（P<0.01），脾臟指數(shù)無統(tǒng)計學(xué)意義。模型C組的肝臟指數(shù)顯著性升高（P<0.01），脾臟指數(shù)升高（P<0.05），模型D組的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)均顯著性升高（P<0.01）（表1）。

表1 各模型組大鼠肝臟、脾臟系數(shù)變化 ±STeb.1 Changes of liver and spleen indexs in various model rats

表1 各模型組大鼠肝臟、脾臟系數(shù)變化 ±STeb.1 Changes of liver and spleen indexs in various model rats

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.4 各實驗分組大鼠血清學(xué)指標(biāo)的變化

2.4.1 ALT、AST、SOD、MDA、GSH-PX指標(biāo)變化

與對照組相比，模型組的血清AST、ALT水平均顯著升高（P<0.01），模型B組的ALT、AST水平最高，模型C組與模型D組的AST、ALT水平相當(dāng)，比模型B組的水平低。模型組的T-SOD、GSH-PX活性隨時間延長逐漸降低（P<0.01），模型組的MDA活性隨時間延長逐漸升高（P<0.01）（表2）。

表2 各組大鼠ALT、AST、SOD、MDA、GSH的變化 ±STab.2 Changes of levels of ALT、AST、T-SOD、MDA and GSH-px in various model rats

表2 各組大鼠ALT、AST、SOD、MDA、GSH的變化 ±STab.2 Changes of levels of ALT、AST、T-SOD、MDA and GSH-px in various model rats

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.4.2 各組大鼠血清LN、HA、IV-C與PCⅢ的比較

模型C組與模型D組LN、HA與對照相比有明顯差別(P<0.01)，模型D組CIV、PCⅢ與對照相比有明顯差別(P<0.05)。模型B組LN與對照組相比有明顯差別(P<0.01)(表3)。

表3 各模型組大鼠血清 LN、HA、IV-C和PCⅢ水平變化 ±STab.3 Changes of levels of LN、HA、IV-C and PCⅢ in varions model rats

表3 各模型組大鼠血清 LN、HA、IV-C和PCⅢ水平變化 ±STab.3 Changes of levels of LN、HA、IV-C and PCⅢ in varions model rats

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.5 病理檢查結(jié)果

2.5.1 肝纖維化分級

造模7周期間，大鼠在第3、5、7周末肝纖維化程度分級以及其SSS計分統(tǒng)計分析見表4。結(jié)果顯示，同對照組相比，模型B、C、D 3組在第5、10、14天的肝纖維化分級SSS計分差異明顯(P<0.05)。

表4 大鼠肝纖維化程度分級Tab.4 The stages of hepatic fibrosis in rats

2.5.2 肝組織HE染色檢查結(jié)果

對照組：均為0級。模型B組：出現(xiàn)在Ⅰ期和Ⅱ期。模型C組：大部分出現(xiàn)在Ⅲ期。模型D組：大部分出現(xiàn)在Ⅳ期（圖2）。

圖1 對照組及模型組大鼠肝組織病理切片（HE染色×200）Fig.1 The liver pathological test of normal groupand model group in rats

2.5.3 腎組織HE染色檢查結(jié)果

B組大鼠腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常；C組與D組大鼠見腎間質(zhì)炎細胞浸潤，部分區(qū)域可見上皮細胞空泡變性、脫落（圖3）。

圖2 對照組及模型組大鼠腎組織病理切片（HE染色×200）Fig.2 The kidney pathological test of normal group and model group inrats

3 討論

建立一個能完全反映人類肝纖維化的動物模型比較困難,但是可供選擇的實驗動物模型種類很多,并且各種造模方法各有其特點與不足,可依據(jù)不同的實驗?zāi)康膩磉x擇相應(yīng)的實驗動物模型,同時兼顧造模的重復(fù)性、可預(yù)測性、可比性和費效比[6]。采用硫代乙酰胺誘導(dǎo)的肝纖維化動物模型在血流動力學(xué)、形態(tài)學(xué)及生化代謝的改變均與人肝纖維化最相似[7]，與病毒性誘發(fā)的肝硬化也很相似[8]，硫代乙酰胺可作用在肝細胞DNA、RNA和蛋白合成酶上產(chǎn)生毒性作用,還可誘導(dǎo)肝的代謝紊亂,甚致肝壞死[9]。采用腹腔注射硫代乙酰胺染毒易于控制大鼠硫代乙酰胺的攝入量，組內(nèi)差異小組間差別易于量化控制，具有較好的重復(fù)性和可控性,誘導(dǎo)時間短，只需35～42 d。硫代乙酰胺致肝纖維化模型,大鼠死亡率低,形成的肝纖維化相對穩(wěn)定,不易被吸收,適用于肝纖維化的基質(zhì)研究、治療藥物的篩選和肝纖維化血清學(xué)標(biāo)記物的可靠性評價等[10]。

在實驗中大鼠在誘導(dǎo)期間一般情況較差,體重減輕較快，誘導(dǎo)結(jié)束后，體重緩慢增長。血清檢測指標(biāo)和病理檢查結(jié)果顯示模型B組肝損傷較輕，大鼠處于Ⅰ和Ⅱ期，模型C組的大鼠大部分處于Ⅲ期，這組模型正是實驗所需的最佳階段，模型D組的大鼠大部分處于Ⅳ期，即肝硬化階段。所以硫代乙酰胺造肝纖維模型的的最佳造模時間是五周，隔天腹腔注射濃度為40 mg/mL，其初始劑量是200 mg/kg，之后根據(jù)大鼠的質(zhì)量變化調(diào)整劑量，此為良好的肝纖維模型。本實驗結(jié)果還顯示了肝纖維大鼠的腎臟功能有輕度病變，腎間質(zhì)炎細胞浸潤，部分區(qū)域可見上皮細胞空泡變性、脫落，可能該化合物對于腎臟有一定的毒性，其機制有待進一步研究。因此要重視在化學(xué)性肝纖維模型的制備中其它臟器的病變，以及人類肝炎發(fā)生發(fā)展中是否存在其它臟器的病變情況，此對選擇與人類肝纖維化病變更接近的模型，改善預(yù)后，降低死亡率均具有重要的意義。

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Establishment of rat hepatic fibrosis model with kidney disease induced by thioacetamide intraperitoneal injection

Qin Dongmei1*,Li Jing2,Chen Wen1,Wang Xinchun2
(1 College of Pharmacy,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China; 2 The First Hospital of Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China)

To lay the foundation of a rat hepatic fibrosis model under the induction of thioacetamide (TAA),and to analyze hepatic pathologic classification and serum test index of rat.The renal pathological changes also examined.60 Wistar rats were chosen and randomly divided into control group,model group B,model group C and model group D.According to the rats weight,intraperitoneal injection of thioacetamide every 2d to induce liver fibrosis.Compared with control group,model group, serum ALT,AST levels were elevated(P<0.01).The activity of T-SOD decreased significantly.The activity of GSH-PX decreased significantly.The content of MDA increased significantly (P<0.01).Model C HA significant difference compared with control(P< 0.01),model group D CIV,PCⅢ significant difference compared with the control(P<0.05).LN Model B group compared with the control group were significantly different (P<0.01).The liver pathology organization prompts the model group big mouse liver cell massive necroses,false small leaf formation,Renal tissue with a mild lesions.Thioacetamide can induce the formation of liver fibrosis in rats,and can lead to renal pathological changes.

thioacetamide(TAA);hepatic fibrosis;intraperitoneal injection

R743.6

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.01.021

1007-7383(2017)01-0124-05

2016-10-25

國家自然科學(xué)基金項目（81560680），石河子大學(xué)“應(yīng)用基礎(chǔ)研究青年項目”（2014ZRKXYQ19）

秦冬梅(1976-)，女，副教授，從事天然藥物及制劑研究，e-mail：dongmeiqinli@163.com。