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    生物與物理復(fù)合法脫除棉籽粕中游離棉酚的工藝研究

    2017-03-29 03:02:35卜小麗程熠娜王春維祝家東祝愛俠
    中國畜牧雜志 2017年3期
    關(guān)鍵詞:棉酚棉籽固態(tài)

    卜小麗,程熠娜,王春維,2,陳 杰,祝家東,祝愛俠*

    (1.武漢輕工大學(xué)生豬健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北武漢 430023;2.武漢輕工大學(xué)武漢市畜禽飼料工程技術(shù)研究中心,湖北武漢 430023)

    生物與物理復(fù)合法脫除棉籽粕中游離棉酚的工藝研究

    卜小麗1,程熠娜1,王春維1,2,陳 杰1,祝家東1,祝愛俠1*

    (1.武漢輕工大學(xué)生豬健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北武漢 430023;2.武漢輕工大學(xué)武漢市畜禽飼料工程技術(shù)研究中心,湖北武漢 430023)

    本試驗旨在研究微生物固態(tài)發(fā)酵與微波降解分步復(fù)合法脫除棉籽粕中游離棉酚的加工技術(shù)。以棉籽浸出制油后的棉籽粕為原料,通過不同的菌種、接種量、料液比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間等影響因素進行試驗分析,以棉籽粕的脫毒率為評判標(biāo)準(zhǔn)。首先通過確定正交試驗的因素與水平,得出微生物固態(tài)發(fā)酵的最佳脫毒工藝參數(shù);再以發(fā)酵后的濕棉籽粕為原料,采用微波降解工藝進行第二次物理輔助脫毒,確定最佳微波工藝參數(shù);測定脫毒前后的棉籽粕粗蛋白含量和小肽含量。結(jié)果表明:混菌發(fā)酵比2∶1(枯草芽孢桿菌與酵母菌)、接種量10%、料液比2∶3、發(fā)酵時間48 h、發(fā)酵溫度30℃,脫毒效果最佳,此時脫毒率高達(dá)86.57%;當(dāng)微波時間和功率分別為6 min和3 000 W時,最終棉籽粕脫毒可達(dá)90.57%。測定脫毒后的棉籽粕粗蛋白含量為52.17%,提高了25.29%;小肽含量為11.13%,提高了20.19%。所得產(chǎn)品色澤均一,呈黑褐色,無酸臭味。微波過程可脫出一部分水分,有效節(jié)約了棉籽粕的烘干成本和烘干時間。此方法工藝簡單、安全可靠、流程短、脫毒率高、水耗和能耗低,為棉籽粕的合理開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)和試驗數(shù)據(jù)。

    棉籽粕;游離棉酚;固態(tài)發(fā)酵;微波降解;脫毒條件

    棉粕粗蛋白含量在38%~50%,是僅次于豆粕的世界第二大植物蛋白原料[1]。我國是世界上主要的產(chǎn)棉大國,年產(chǎn)棉籽餅粕在600萬t以上,對其合理開發(fā)利用能夠在一定程度上緩解我國蛋白資源的不足。但其含有的游離棉酚及環(huán)丙烯酸,尤其是游離棉酚會對畜禽造成損傷。動物攝入過量的游離棉酚,可與酶或其他蛋白質(zhì)結(jié)合,不僅降低蛋白質(zhì)消化率[2],同時會使動物出現(xiàn)腹瀉、厭食、紅細(xì)胞數(shù)減少等中毒癥狀,嚴(yán)重的會導(dǎo)致肝臟和心肌變形壞死[3];除此之外,游離棉酚可引起雄性動物的繁殖障礙,因此大大限制其在動物生產(chǎn)中的利用[4]。改善棉籽粕的營養(yǎng)價值,降低棉酚等抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì),已成為棉籽粕蛋白資源推廣運用的前提?,F(xiàn)在常用的脫毒法分為物理法、化學(xué)法、微生物法。物理法和化學(xué)法往往存在成本高、適口性差、無法規(guī)?;a(chǎn)、脫毒率低等問題。微生物發(fā)酵法成本低,無化學(xué)殘留,且較安全,是目前常用的脫毒方法,但仍達(dá)不到較為理想的脫毒效果。微波可激發(fā)物料自身水分子的高速運動,極大地縮短熱處理時間,與高溫等脫毒法相比效率更高[5]。本研究旨在采用固態(tài)發(fā)酵和微波降解分步復(fù)合的方法對棉粕中的游離棉酚進行降解,確定最佳的降解工藝參數(shù),為棉籽粕的合理開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)和試驗數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    1.1.1 試驗材料 棉籽粕原料由戰(zhàn)友生物科技有限公司提供;棉酚標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma中國有限公司;枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)由武漢輕工大學(xué)實驗室提供,酵母菌(Microzyme)購于安琪酵母有限公司;異丙醇、正己烷、冰乙酸、苯胺、3-氨基-1-丙醇、間苯三酚、丙酮為市售。

    1.1.2 儀器設(shè)備 YB-1 000A分析天平(大連運邦科技發(fā)展有限公司);Evolution 220紫外分光光度計(美國Thermo公司);RC6 plus離心機(賽默飛世爾);SFG-102立式壓力蒸汽滅菌鍋(寧波久興醫(yī)療器械有限公司),WBS-10隧道式微波干燥設(shè)備(貴陽新奇微波工業(yè)有限公司);S-3000N掃描式電子顯微鏡(日立)。

    1.2 復(fù)合法工藝流程 選取新鮮棉籽粕→菌種、接種量、料液質(zhì)量比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間單因素試驗→正交試驗→確定最佳發(fā)酵試驗參數(shù)→微波降解脫毒法(時間、功率)→檢測棉粕成分變化。

    1.3 試驗設(shè)計 將棉籽粕、玉米粉、麩皮按照7:2:1形成底物。自然pH的條件進行發(fā)酵試驗,發(fā)酵后微波降解,并在65℃下烘干,粉碎過40目篩,以棉籽粕中游離棉酚含量為指標(biāo)進行測定。

    1.3.1 發(fā)酵單因素試驗 ①菌種分別為枯草芽孢桿菌、酵母菌、兩種菌種復(fù)配(枯草芽孢桿菌:酵母菌=1:1、1:2、2:1)。②接種量以6%、8%、10%、12%為單因素,初始含水率為60%,發(fā)酵溫度30℃,發(fā)酵時間48 h。③初始含水率以50%、60%、70%、80%為單因素,接種量采用①的試驗結(jié)果,發(fā)酵溫度30℃,發(fā)酵時間48 h。④發(fā)酵溫度以25、30、35、40℃為單因素,采用①、②的試驗結(jié)果,發(fā)酵溫度30℃,發(fā)酵時間48 h。⑤發(fā)酵時間以24、48、72、96 h發(fā)酵時間為單因素,接種量采用①的試驗結(jié)果,初始含水率采用②的試驗結(jié)果,發(fā)酵溫度采用③的試驗結(jié)果進行發(fā)酵試驗。

    1.3.2 發(fā)酵正交試驗設(shè)計 試驗設(shè)計見表1。

    表1 棉籽粕發(fā)酵正交試驗設(shè)計

    1.3.3 微波降解研究 ①在確定最佳發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上,以固態(tài)發(fā)酵正交試驗得到最佳發(fā)酵條件。發(fā)酵后的濕基棉籽粕為原料,以1 000、2 000、3 000、3 500 W微波功率為單因素,微波4 min時進行微波輔助脫毒;②以2、4、6、8 min微波時間為單因素,在①基礎(chǔ)上進行微波技術(shù)脫毒,確定不同微波時間對棉籽粕中游離棉酚脫毒工藝的影響。發(fā)酵結(jié)束后測定棉籽粕總蛋白、小肽含量和氨基酸變化。

    1.4 測定指標(biāo)及方法

    1.4.1 棉酚含量測定 采用間苯三酚法[6]測定棉酚的含量。

    1.4.2 掃描電鏡觀察發(fā)酵底物形態(tài) 通過掃描電鏡觀察固態(tài)發(fā)酵棉籽粕底物顯微形態(tài),觀察枯草芽孢桿菌、酵母菌對棉籽粕的利用情況。

    1.4.3 脫毒前后棉籽粕中粗蛋白質(zhì)和小肽含量 采用GB/T 6432-1994《飼料中粗蛋白質(zhì)測定方法》、GB/T 22492-2008《大豆肽相對分子質(zhì)量的測定方法》,測定脫毒前后棉籽粕中蛋白和小肽的含量。

    1.4.4 脫毒前后棉籽粕中氨基酸及氨基酸評分變化采用OPA柱后衍生法測定氨基酸含量[7]。

    1.5 統(tǒng)計分析 本試驗中不同處理試驗結(jié)果采用Excel(2007)進行預(yù)處理,試驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan’s多重比較檢驗,以P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn);結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

    2 結(jié) 果

    2.1 不同菌種對發(fā)酵棉籽粕中游離棉酚脫毒率的影響 由圖1可知,枯草芽孢桿菌的發(fā)酵脫毒效果顯著高于酵母菌(P<0.05),但脫毒率均低于混菌發(fā)酵的脫毒效果;在混菌發(fā)酵時,枯草芽孢桿菌與酵母菌接種比例為2:1時脫毒率顯著高于其他兩組混菌發(fā)酵的效果(P<0.05)。說明這兩種菌協(xié)同性好,在同一個發(fā)酵環(huán)境下能較好的互利共生。因此根據(jù)以上試驗結(jié)果對枯草芽孢桿菌與酵母菌接種比例為2:1進行復(fù)合發(fā)酵,以期找出復(fù)合發(fā)酵的最佳工藝條件。

    2.2 接種量、含水率、溫度、時間對發(fā)酵棉籽粕中游離棉酚脫毒率的影響 由圖2可知,脫毒率隨接種量、含水率、溫度、時間增加均呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢,菌種接種量為10%時脫毒率最大。在接種量從6%增加到10%的過程中,脫毒率明顯增加。但當(dāng)接種量大于10%后,脫毒率反而下降。在一定范圍內(nèi),含水率越高,棉酚降解率越高。含水率為60%時脫毒率最高,且含水率從50%增加到60%時,脫毒率明顯增大。在溫度由25℃增加到30℃時脫毒率明顯增加,且在發(fā)酵溫度為30℃時脫毒率最高,當(dāng)發(fā)酵溫度高于35℃時,脫毒率明顯下降。在發(fā)酵24 h時,脫毒率不足40%;在發(fā)酵48 h時脫毒率達(dá)到最高,隨著發(fā)酵時間的增加,脫毒率略有下降的趨勢。

    圖1 不同菌種發(fā)酵棉籽粕對其游離棉酚脫率的影響

    2.3 固態(tài)發(fā)酵法脫除游離棉酚的正交試驗結(jié)果 從表2結(jié)果可以得出,對發(fā)酵棉籽粕中游離棉酚含量的影響因素主次是D>A>B>C,即發(fā)酵時間>接種量>初始含水率>發(fā)酵溫度。最佳方案是A2B2C1D2,未在試驗組合中,所以對該組合做驗證試驗,結(jié)果顯示脫毒率為86.57%,高于正交試驗中的最高脫毒率85.89%,因此確定最佳工藝組合為A2B2C1D2,即接種量為10%、初始含水率為60%、發(fā)酵溫度為30℃、發(fā)酵時間為48 h。

    2.4 微波降解脫毒法脫除游離棉酚的工藝優(yōu)化 由圖3可知,脫毒率隨著微波功率和時間增加均呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢。微波功率為3 000 W時的脫毒率顯著高于1 000 W的脫毒率(P<0.05),其余微波功率組之間均沒有顯著性差異(P>0.05);但從數(shù)值上看,在微波功率達(dá)到3 000 W時,脫毒率達(dá)到最大。微波6 min的脫毒率顯著高于2 min的脫毒率(P<0.05),隨著微波時間的增加,脫毒率并沒有顯著變化(P>0.05)。從數(shù)值上來看,6 min脫毒率最高。

    2.5 脫毒前后棉籽粕變化

    圖2 不同接種量、含水率、溫度、時間對棉籽粕中游離棉酚脫毒率的影響

    圖3 微波功率、時間對游離棉酚脫毒率的影響

    表2 棉籽粕發(fā)酵正交試驗

    圖4 固態(tài)發(fā)酵棉籽粕形態(tài)

    2.5.1 掃描電鏡觀察固態(tài)發(fā)酵棉籽粕形態(tài) 由圖4可知,酵母菌、枯草芽孢桿菌在棉籽粕底物中很好的生長,同時由圖4 b觀察到經(jīng)過2種菌混合發(fā)酵后,棉籽粕底物被分解得更加徹底,表明這兩種菌具有協(xié)同生長、共同利用棉籽粕底物的作用。

    2.5.2 脫毒后棉籽粕中粗蛋白質(zhì)、小肽含量變化 由表3可知,利用復(fù)合法脫毒后的棉籽粕蛋白質(zhì)和小肽均有顯著提高(P<0.05)。脫毒后棉籽粕中蛋白質(zhì)含量提高了25.29%,小肽含量提高了20.19%。

    2.5.3 脫毒前后棉籽粕中氨基酸的變化 由表4可以看出,脫毒后所測棉籽粕中必需氨基酸含量由脫毒前的9.95 nmol/mL提高到11.45 nmol/mL,非必需氨基酸含量與脫毒前比較也有提高。其中蘇氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸均有顯著性提高(P<0.05)。必需氨基酸蘇氨酸提高14.6%,纈氨酸提高18.35%,蛋氨酸提高提高21.43%,異亮氨酸提高19.59%,亮氨酸提高15.81%,苯丙氨酸提高12.22%,賴氨酸提高11.81%。

    表3 發(fā)酵后棉籽粕營養(yǎng)成分變化 %

    3 討 論

    3.1 接種量、含水率、溫度、時間對發(fā)酵棉籽粕中游離棉酚脫毒率的影響

    3.1.1 接種量對發(fā)酵棉籽粕中游離棉酚脫毒率的影響 菌種的接種量在固態(tài)發(fā)酵中是一個很重要的因素[8]。接種量過少,則菌體生長緩慢、代謝少,在限定的時間內(nèi)游離棉酚降解率低。而接種量過高,導(dǎo)致發(fā)酵營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快,后期菌體長勢不明顯,不利于產(chǎn)物的形成和毒性物質(zhì)的降解;同時培養(yǎng)基粘度大、易結(jié)塊,導(dǎo)致氧氣交換受到限制,菌種生活力不斷衰退,增加了雜菌污染的機會[9]。本試驗中,適量接種量為10%,脫毒效果較好。

    表4 復(fù)合法脫毒前后棉籽粕中氨基酸的變化

    3.1.2 含水率對發(fā)酵棉籽粕中游離棉酚脫毒率的影響 底物的含水率對微生物的生長及其代謝能力有重要影響。本試驗結(jié)果與劉國娟等[10]研究結(jié)果相同。含水率低會降低營養(yǎng)物質(zhì)的溶解性、酶的穩(wěn)定性和微生物的生長,進而降低脫毒效果[10];含水率過高,發(fā)酵物料顏色過深,氣味變差,脫毒率下降,不利于菌體的生長和發(fā)酵物料的干燥。其原因可能是發(fā)酵物料中含水量過高會使底物粘度增大、易結(jié)塊、通氣差、易染菌[11],限制了氧的傳遞和細(xì)胞的氧需求,影響菌體生長。本試驗表明,含水率為60%時脫毒率最高。

    3.1.3 溫度對發(fā)酵棉籽粕中游離棉酚脫毒率的影響復(fù)合菌種的生長和代謝對溫度具有敏感性[12]。溫度是保證菌種生長和產(chǎn)物合成的重要因素,是固態(tài)發(fā)酵的關(guān)鍵控制點。本試驗結(jié)果表明,在發(fā)酵溫度為30℃時脫毒率最高,這與金紅春[13]用微生物發(fā)酵脫毒棉粕及在青魚養(yǎng)殖上的利用研究結(jié)果一致。發(fā)酵溫度達(dá)到37℃時不適合酵母菌的生長;同時溫度過高,芽孢桿菌會啟動自我保護機制,形成芽孢,不利于菌體的生長代謝,進而對棉粕脫毒的生化和代謝產(chǎn)生不利影響。而且固態(tài)發(fā)酵傳熱效果較差,會造成培養(yǎng)基局部溫度過高而導(dǎo)致菌體死亡,降低棉酚脫毒率。

    3.1.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵棉籽粕中游離棉酚脫毒率的影響 在發(fā)酵48 h時脫毒率最高,延長發(fā)酵時間并不能增大脫毒率,這與朱德偉等[8]研究結(jié)果一致。在發(fā)酵前期,脫毒率明顯增加,因在24~48 h菌體處于對數(shù)期,菌體生長迅速、代謝旺盛產(chǎn)物多,脫毒率增加明顯。但當(dāng)發(fā)酵時間超過96 h后,脫毒率略有下降趨勢,由于過長的發(fā)酵時間,基質(zhì)被過度消耗,而菌體過了穩(wěn)定期后,單位時間產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物減少,雜菌的繼續(xù)生長又消耗底物,進而使脫毒率降低。但發(fā)酵時間太短,不足以到達(dá)菌體的生長對數(shù)期,影響菌體的脫毒作用。因此,在發(fā)酵時間為48 h時,脫毒效果較好。

    3.2 微波降解法脫除游離棉酚的工藝優(yōu)化 在輸出功率達(dá)到3 000 W時,脫毒效果最好。在微波時間為6 min時,脫毒率最高??赡苡捎谖⒉訜嶙饔茫姑拮哑蓽囟妊杆僭黾?,從而破壞棉籽粕中游離棉酚結(jié)構(gòu),或游離棉酚在經(jīng)過微波后與蒸發(fā)的水分一起被釋放。同時微波處理是一種重要的蛋白改性方式,其與傳統(tǒng)制油工藝中采用的高溫蒸炒壓榨技術(shù)較為相似。研究資料表明,微波處理可有效降解棉籽蛋白中的各個亞基,并提高其在動物消化道內(nèi)的利用率[5]。由固態(tài)發(fā)酵法和微波技術(shù)方法復(fù)合脫毒后,制得的棉籽粕產(chǎn)品的脫毒率達(dá)到90.57%,原料中棉酚含量僅為72 mg/kg,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國家飼料標(biāo)準(zhǔn)值300 mg/kg[14],屬于低酚棉籽粕。

    3.3 脫毒后棉籽粕形態(tài)/粗蛋白質(zhì)、小肽和氨基酸含量變化 脫毒后的棉籽粕蛋白質(zhì)提高了25.29%,小肽含量提高了20.19%。說明在發(fā)酵過程中棉籽粕經(jīng)枯草芽孢桿菌、酵母菌分泌的蛋白酶使得發(fā)酵后棉籽粕蛋白質(zhì)含量提高,發(fā)酵使其中部分大分子蛋白質(zhì)分解為小分子肽,提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率,改變飼料蛋白質(zhì)品質(zhì),產(chǎn)生促生長因子改善棉籽粕飼料的適口性[15]。蛋白質(zhì)以小肽形式直接吸收有很多優(yōu)點:肽之間的運轉(zhuǎn)不存在競爭性和抑制性,吸收小肽和氨基酸的機制是彼此獨立,互不干擾的,且小肽所占比例越大,越有較好的吸收效果。

    4 結(jié) 論

    在本試驗條件下,通過單因素和正交試驗研究得出,當(dāng)枯草芽孢桿菌與酵母菌以2:1進行復(fù)合發(fā)酵,最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)為接種量10%、初始含水量60%、發(fā)酵時間48 h、發(fā)酵溫度30℃,此時脫毒率可達(dá)86.57%。以發(fā)酵后棉籽粕為原料,采用微波輔助脫毒,工藝條件是微波功率3 000 W、微波時間6 min,棉籽粕中游離棉酚脫毒率可達(dá)90.57%,發(fā)酵后游離棉酚含量僅為72 mg/kg。

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    S828.5

    A

    10.19556/j.0258-7033.2017-03-079

    2016-07-22;

    2016-08-13

    湖北省教育廳科研項目(Q20141706)

    卜小麗(1989-),女,河南商丘人,在讀研究生,動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)專業(yè),研究方向為飼料添加劑及資源開發(fā)與利用,E-mail: syrlbxl@163.com

    * 通訊作者:祝愛俠,博士,E-mail: zhuaixia807@163.com

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