BCB和Zebularine對綿羊體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育效果的影響

曹 慧，李俊杰,2*，郝永蘭，劉愛菊，李文瑞，魏巧莉，田樹軍,2，孫樹春,2

（1．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定 071000；2．河北省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，河北保定 071000）

BCB和Zebularine對綿羊體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育效果的影響

曹 慧1，李俊杰1,2*，郝永蘭1，劉愛菊1，李文瑞1，魏巧莉1，田樹軍1,2，孫樹春1,2

（1．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定 071000；2．河北省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，河北保定 071000）

為探究亮甲酚藍(lán)（BCB）染色選擇的卵母細(xì)胞是否有利于體細(xì)胞核移植胚胎的體外發(fā)育，本實(shí)驗(yàn)將卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）放入含有BCB的PBS中染色，根據(jù)細(xì)胞質(zhì)顏色可將卵母細(xì)胞分成BCB+組和BCB-組，并以未經(jīng)BCB處理的COCs作為對照組，然后將卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟，統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞的成熟率。將成熟后的卵母細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植，其中，部分BCB+組卵母細(xì)胞所需的供體細(xì)胞利用Zebularine處理，統(tǒng)計(jì)體細(xì)胞核移植的卵裂率、桑椹胚率和囊胚率。結(jié)果表明：BCB+組卵母細(xì)胞的成熟率顯著高于對照組和BCB-組（71．15% vs 65．38%，53．52%，P＜0．05）； BCB+組核移植胚胎的卵裂率（87．91% vs 56．83%）、桑椹胚率（37．41% vs 21．73%）和囊胚率（21．48% vs 6．82%）均顯著高于BCB-組（P＜0．05）；與對照組相比，BCB+組卵裂率（87．91% vs 83．23%）和囊胚率（21．48% vs 14．89%）也顯著升高（P＜0．05）。BCB+組供體細(xì)胞經(jīng)Zebularine處理后，胚胎發(fā)育能力進(jìn)一步提高，其中囊胚率顯著高于BCB+組、對照組和BCB-組（29．25% vs 21．48%，14．89%，6．82%，P＜0．05）。

BCB染色；Zebularine；綿羊；體細(xì)胞核移植

卵母細(xì)胞的質(zhì)量直接影響著體細(xì)胞核移植效率，現(xiàn)階段卵母細(xì)胞大多來源于屠宰場卵巢，其質(zhì)量和所處發(fā)育階段差別較大。前期研究表明，使用亮甲酚藍(lán)（Brilliant Cresyl Blue, BCB）對豬[1]、牛[2]、山羊[3]、綿羊[4]、小鼠[5]等動物卵母細(xì)胞進(jìn)行染色，能夠篩選出具有更高發(fā)育潛能的卵母細(xì)胞。另有研究表明，在哺乳動物體細(xì)胞核移植過程中，降低DNA甲基化水平有利于體細(xì)胞核移植重編程的進(jìn)行[6]。近年來在小鼠[7]、兔[8]、牛[9]、豬[10]上的研究表明，使用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理供體細(xì)胞或重構(gòu)胚能夠降低供體細(xì)胞或重構(gòu)胚的DNA甲基化水平，從而提高克隆胚胎的發(fā)育能力。Zebularine作為一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，具有毒性低、穩(wěn)定性強(qiáng)、半衰期長等特點(diǎn)[11-13]。使用Zebularine處理供體細(xì)胞或重構(gòu)胚，獲得了理想的體細(xì)胞核移植效果[14-16]。鑒于Zebularine與BCB共同應(yīng)用于綿羊體細(xì)胞核移植的研究未見報(bào)道，為優(yōu)化綿羊體細(xì)胞核移植技術(shù)程序，本實(shí)驗(yàn)擬在前期研究的基礎(chǔ)上，使用BCB染色篩選卵母細(xì)胞，進(jìn)而選用Zebularine處理綿羊供體細(xì)胞，研究BCB和Zebularine對綿羊體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育效果的影響。

1 材料與方法

1．1 主要化學(xué)試劑 本實(shí)驗(yàn)所用試劑除非特殊說明外均購自Sigma公司。采卵液：TCM199+5 mmol/L NaHCO3+10 mmol/L HEPES+10 mmol/L HEPESNa+20 mL/L FBS+0．04 g/L 肝素鈉+0．05 g/L 青霉素+0．05 g/L 鏈霉素；卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液：TCM199+1 mmol/L L-Glutamine+10 mg/L FSH+10 mg/L LH+20 ng/mL EGF+10% FBS（v/v）+1 mg/L E2；卵丘細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM+10% FBS；電融合液：0．3 mol/L D-甘露醇+0．1 mmol/L MgSO4+0．05 mmol/L CaCl2+0．5 mmol/L HEPES+0．1% BSA（w/v）；離子霉素激活液：DPBS+ 2% FBS+ 5 μmol/L 離子霉素；6-DMAP激活液：DPBS+ 2% FBS+2 mmol/L 6-DMAP。

1．2 卵巢和卵母細(xì)胞的采集 從保定唐縣綿羊定點(diǎn)屠宰場采集新鮮綿羊卵巢，立即放入盛有38℃左右滅菌生理鹽水（含雙抗）的保溫瓶中，3～4 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。用刀片劃破卵巢表面直徑2～6 mm的卵泡，在體視顯微鏡下挑選胞質(zhì)均勻、帶有3層及3層以上完整致密卵丘細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）用于實(shí)驗(yàn)。

1．3 COCs的染色及體外成熟 將挑取合格的COCs分成兩組，對照組COCs放入平衡好的mPBS（mPBS是在PBS中添加了1 g/L 葡萄糖、36 mg/L 丙酮酸鈉、0．5 g/L BSA、0．05 g/L 慶大霉素[4]）中作用90 min，實(shí)驗(yàn)組COCs放入含有26 μmol/L BCB的mPBS中，在38．5℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境中染色90 min[17]，根據(jù)細(xì)胞質(zhì)著色情況將卵母細(xì)胞分成兩組：細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)色的卵母細(xì)胞為BCB+組，細(xì)胞質(zhì)未著色的卵母細(xì)胞為BCB-組。然后將各組卵母細(xì)胞在成熟液中洗滌3～5次，移入經(jīng)平衡的成熟液微滴中，10～20枚/100 μL，培養(yǎng)條件為38．5℃、5%CO2、飽和濕度，培養(yǎng)時(shí)間為19 h。體外成熟19 h后，取出COCs置于含0．1%透明質(zhì)酸酶的操作液中用口徑略大于卵母細(xì)胞直徑的玻璃管反復(fù)吹打除去周圍的卵丘細(xì)胞，在體視顯微鏡下挑選具有完整第一極體的卵母細(xì)胞，并以排出第一極體作為成熟的標(biāo)志，統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞成熟率。

1．4 綿羊卵丘細(xì)胞的培養(yǎng) 收集脫落的卵丘細(xì)胞于1．5 mL離心管中，加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)液并離心，棄上清后加入相同的培養(yǎng)液吹打均勻，接種于培養(yǎng)皿中38．5℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。當(dāng)卵丘細(xì)胞生長達(dá)到90%左右匯合時(shí)進(jìn)行傳代。本實(shí)驗(yàn)采用第3～4代對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行不同處理。

1．5 供體細(xì)胞的準(zhǔn)備 生長至對數(shù)生長期（匯合度為80%左右）的卵丘細(xì)胞，血清饑餓2 d，然后根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組卵丘細(xì)胞經(jīng)含有5 nmol/L Zebularine的卵丘培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h[16]，對照組卵丘細(xì)胞經(jīng)常規(guī)卵丘細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h。實(shí)驗(yàn)前去除培養(yǎng)液，用0．25%胰蛋白酶消化處理2 min，用移液器吹打成單個(gè)細(xì)胞備用。

1．6 卵母細(xì)胞的去核和注核 將所獲得的具有完整第一極體的BCB+組卵母細(xì)胞移入到含0．5 μg/mL秋水仙胺的操作液中處理 30 min 后，選擇具有胞質(zhì)突起的卵母細(xì)胞置于操作液中[18]，在顯微操作儀下進(jìn)行顯微操作。用去核針去除第一極體及突起的胞質(zhì)。將體細(xì)胞注入到胞質(zhì)質(zhì)膜與透明帶夾角處，使供體細(xì)胞膜與受體胞質(zhì)質(zhì)膜緊密接觸以利于融合。BCB-組和對照組卵母細(xì)胞與BCB+組卵母細(xì)胞處理方法相同。

1．7 重構(gòu)胚的融合與激活 將重構(gòu)胚放入電融合液中平衡1～2 min，移入到電融合槽中，使卵丘細(xì)胞與去核卵母細(xì)胞胞質(zhì)接觸面與電流方向垂直。融合條件為1．25 kV/cm、30 μs、n=2。采用離子酶素+6-DMAP聯(lián)合激活法。

1．8 重構(gòu)胚的體外培養(yǎng) 各組重構(gòu)胚在常規(guī)發(fā)育液中培養(yǎng)。胚胎培養(yǎng)過程中每48 h半量換液，48 h后統(tǒng)計(jì)卵裂率，第7天統(tǒng)計(jì)囊胚率。

1．9 統(tǒng)計(jì)分析 本實(shí)驗(yàn)中每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS21．0進(jìn)行One-Way ANOVA差異顯著性檢驗(yàn)，P＜0．05表示差異顯著，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2．1 BCB染色情況 如圖1所示，卵母細(xì)胞經(jīng)BCB染色90 min，根據(jù)細(xì)胞質(zhì)顏色可將卵母細(xì)胞分成兩組，卵巢內(nèi)生長完全的卵母細(xì)胞因缺乏葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）而呈現(xiàn)藍(lán)色（BCB+），處于卵巢內(nèi)生長期的卵母細(xì)胞因含有大量的G6PDH而呈現(xiàn)無色（BCB-）[4,17]。

圖1 BCB染色的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體

2．2 卵母細(xì)胞的體外成熟情況 經(jīng)BCB染色后，卵母細(xì)胞著色與否對卵母細(xì)胞成熟率的影響見表1。BCB+組卵母細(xì)胞的成熟率顯著高于對照組和BCB-組（71．15% vs 65．38%，53．52%，P＜0．05），對照組卵母細(xì)胞的成熟率顯著高于BCB-組（65．38% vs 53．52%，P＜0．05）。

表1 BCB對綿羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響

2．3 BCB染色及Zebularine處理供體細(xì)胞對綿羊體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育情況的影響 如表2所示，Zeb+BCB+組（卵母細(xì)胞經(jīng)BCB染色胞質(zhì)呈藍(lán)色且供體卵丘細(xì)胞經(jīng)Zebularine處理）和BCB+組核移植胚胎的卵裂率顯著高于對照組和BCB-組（88．24%，87．91% vs 83．23%，56．83%，P＜0．05），且對照組卵裂率也顯著高于BCB-組（83．23% vs 56．83%，P＜0．05），而Zeb+BCB+組和BCB+組核移植胚胎的卵裂率差異不顯著。Zeb+BCB+組、BCB+組和對照組核移植胚胎的桑椹胚率顯著高于BCB-組（39．41%，37．41%，35．63% vs 21．73%，P＜0．05），而三組之間桑椹胚率差異均不顯著。Zeb+BCB+組囊胚率最高，達(dá)29．25%，顯著高于BCB+組、對照組和BCB-組（29．25% vs 21．48%，14．89%，6．82%，P＜0．05）。

3 討 論

在體細(xì)胞核移植過程中，卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能（質(zhì)量）是制約該技術(shù)成功率的主要因素之一。來自屠宰場卵巢的卵母細(xì)胞的質(zhì)量和發(fā)育潛能存在較大的差異性。通常情況下，用觀察卵母細(xì)胞周圍卵丘細(xì)胞層的數(shù)量和緊密度以及卵母細(xì)胞胞質(zhì)的均一性等形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)來選擇卵母細(xì)胞，該種方法選擇的卵母細(xì)胞發(fā)育潛能存在較大的差異性[19]。因此，尋找一種更科學(xué)更公正的卵母細(xì)胞選擇方法就顯得尤為重要。

通常認(rèn)為， G6PDH在生長期卵母細(xì)胞中非?；钴S，隨著生長期的結(jié)束，其活性逐漸減弱直至消失。G6PDH活性的缺失是檢測已經(jīng)結(jié)束卵巢內(nèi)生長的完全成熟的卵母細(xì)胞的一個(gè)間接方法。G6PDH能夠降解BCB，因此，完成生長階段的卵母細(xì)胞因缺乏G6PDH而呈現(xiàn)藍(lán)色（BCB+），而處于生長期的卵母細(xì)胞則由細(xì)胞內(nèi)的G6PDH降解BCB呈現(xiàn)無色（BCB-）。BCB染色不能提高第二次減數(shù)分裂中期（MⅡ期）卵母細(xì)胞的成熟率和體外受精率，但有助于篩選體外成熟前具有發(fā)育活性的卵母細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)中，BCB+組卵母細(xì)胞的成熟率顯著高于對照組和BCB-組，這個(gè)研究結(jié)果與之前在豬、牛、山羊、綿羊、小鼠等動物的體外成熟實(shí)驗(yàn)中利用BCB染色法篩選高質(zhì)量卵母細(xì)胞的結(jié)果一致。經(jīng)過體外發(fā)育實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)中BCB+組和對照組核移植胚胎的卵裂率和桑椹胚率顯著高于BCB-組。BCB+組核移植胚胎的囊胚率明顯高于對照組和BCB-組。這些結(jié)果進(jìn)一步證明了使用BCB染色卵母細(xì)胞能夠有效篩選出發(fā)育能力強(qiáng)的卵母細(xì)胞，從而提高克隆效率。

然而，在體細(xì)胞核移植過程中，即使選擇了發(fā)育潛能高、發(fā)育潛能均一的高質(zhì)量卵母細(xì)胞，異常的表觀遺傳修飾依然存在，即高的DNA甲基化水平和低的組蛋白乙酰化水平[20-21]。有研究表明，使用濃度為5 nmol/L的5-aza-dC和Zebularine處理核移植重構(gòu)胚，5-aza-dC實(shí)驗(yàn)組和Zebularine實(shí)驗(yàn)組的卵裂率分別為92．6%和93．3%，顯著高于對照組的87．2%，并且Zebularine實(shí)驗(yàn)組的囊胚率為60．9%，顯著高于5-aza-dC實(shí)驗(yàn)組的囊胚率（53．5%）[15]。Diao等[21]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Zebularine處理供體細(xì)胞進(jìn)行核移植后，囊胚率顯著高于對照組和5-azadC處理組。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與前人結(jié)果相似，用Zebularine處理綿羊供體卵丘細(xì)胞，提高了囊胚發(fā)育率（29．25%）。并且在都選用BCB+卵母細(xì)胞作為受體細(xì)胞的情況下，加入Zebularine的處理組囊胚率顯著升高（29．25% vs 21．48%）。這些研究結(jié)果表明，Zebularine作為一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，很可能是降低了供體核的DNA甲基化水平，從而提高了核移植效率。

表2 BCB染色及Zebularine對綿羊體細(xì)胞核移植胚胎體外發(fā)育的影響

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，COCs體外成熟培養(yǎng)前以BCB染色篩選為依據(jù)，所得BCB+卵母細(xì)胞作為受體進(jìn)行體細(xì)胞核移植，可以提高囊胚發(fā)育率；并且使用5 nmol/L Zebularine處理供體卵丘細(xì)胞，能夠進(jìn)一步提高BCB+卵母細(xì)胞核移植胚胎的發(fā)育能力，從而獲得更高的囊胚發(fā)育率。

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Ef f ect of Brilliant Cresyl Blue Staining and Zebularine on Development of Somatic Cell Nuclear Transfer Embryos in Sheep

CAO Hui1, LⅠ Jun-jie1,2*, HAO Yong-lan1, LⅠU Ai-ju1, LⅠ Wen-rui1, WEⅠ Qiao-li1, TⅠAO Shu-jun1,2, SUN Shu-chun1,2
(1. College of Animal Science and Technology, Agricultural Univesity of Hebei, Hebei Baoding 071000, China; 2. Research Cencer of Cattle and Sheep Embryo Engineering Technique of Hebei, Hebei Baoding 071000, China)

To investigate whether oocytes selecting were favorable for the development of somatic cell nuclear transfer embryosin vitroby brilliant cresyl blue (BCB) staining, the cumulus-oocyte complexes (COCs) were stained in PBS containing BCB. According to the color of cytoplasm, the oocytes were divided into two groups: BCB+group and BCB-group. The COCs without BCB treatment were used as the control group, then the oocytes were maturatedin vitroand the maturation rate of oocytes was counted. The matured oocytes were then subjected to somatic cell nuclear transfer. The cumulus cells treated with Zebularine were used as the donor cells of some BCB+oocytes. The cleavage rate, morula rate and blastocyst rate were counted. Results showed that the maturation rate of BCB+group was signif i cantly higher than that of control group and BCB-group (71.15% vs 65.38%, 53.52%,P＜0.05); after somatic cell nuclear transfer, the development level of cloned embryos was evaluated, there is signif i cant dif f erence in the cleavage rate (87.91% vs 56.83%), morula rate (37.41% vs 21.73%) and blastocyst rate (21.48% vs 6.82%) between BCB+group and BCB-group (P＜0.05). Compared with the control group, the cleavage rate (87.91% vs 83.23%) and blastocyst rate (21.48% vs 14.89%) of BCB+group were also signif i cantly higher (P＜0.05). When donor cells were treated with Zebularine, the blastocyst rate of the BCB+group (Zeb+BCB+group) was further increased, it was signif i cantly higher than that of BCB+ group, control group and BCB-group (29.25% vs 21.48%, 14.89%, 6.82%,P＜0.05).

Brilliant cresyl blue (BCB) staining; Zebularine; Sheep; Somatic cell nuclear transfer

S826.3

A

10.19556/j.0258-7033.2017-03-058

2016-10-08；

2016-11-11

河北省自然科學(xué)基金（C2014204119）；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（ZD2014002）

曹慧（1989-），女，河北正定人，在讀碩士研究生，主要從事動物繁殖與胚胎工程研究，E-mail: caohui8529@163．com

*通訊作者：李俊杰，男，博士，教授，E-mail: lijunjie816@163．com