鐵皮石斛花總黃酮提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性研究

唐靜月顏美秋齊芳芳戴明珠王楠楠呂圭源陳素紅,3

1.溫州醫(yī)科大學(xué) 浙江，溫州 325035 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 3.浙江工業(yè)大學(xué)

鐵皮石斛花總黃酮提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性研究

唐靜月1顏美秋2齊芳芳1戴明珠1王楠楠1呂圭源2陳素紅1,3

1.溫州醫(yī)科大學(xué) 浙江，溫州 325035 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 3.浙江工業(yè)大學(xué)

[目的]確定鐵皮石斛花中總黃酮超聲輔助提取最佳工藝條件，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。[方法]采用正交試驗(yàn)方法，以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，對(duì)鐵皮石斛花總黃酮提取方法的影響因素進(jìn)行探討，并對(duì)鐵皮石斛花總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。以羥自由基清除率、DPPH和ABTS自由基清除率為指標(biāo)，對(duì)鐵皮石斛花總黃酮的體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。[結(jié)果]鐵皮石斛花總黃酮的最佳提取條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)80%,料液比1:50,提取溫度55℃,提取次數(shù)2次，在以上條件下，總黃酮提取率達(dá)1.99%。鐵皮石斛花總黃酮對(duì)羥自由基、DPPH和ABTS自由基有較強(qiáng)的清除作用，且羥自由基抗氧化活性與總黃酮含量呈正相關(guān)。[結(jié)論]利用正交法分析結(jié)果可靠，得到了鐵皮石斛花總黃酮超聲提取的最佳工藝條件，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明鐵皮石斛花具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

鐵皮石斛花；總黃酮；正交試驗(yàn)；提取工藝；抗氧化

鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛 Dendrobium officinale Kimura et Migo的干燥莖，具有益胃生津，滋陰清熱之功效?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》謂其：“味甘，平。主傷中，除痹，下氣，補(bǔ)五臟虛勞羸瘦，強(qiáng)陰，久服厚腸胃”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有抗氧化、降血糖、抗肝損傷、抗腫瘤等作用，對(duì)消化、心血管和免疫系統(tǒng)疾病有明顯的治療效果[1]。鐵皮石斛的藥用部位為莖，其花為非藥用部位，目前也未被列入新食品原料。隨著鐵皮石斛人工種植技術(shù)的推廣，種植面積的不斷加大，鐵皮石斛花產(chǎn)量較大，據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅浙江省鮮花年產(chǎn)量就可達(dá)1500～3000噸，干花150～300噸，造成了極大的資源浪費(fèi)。長(zhǎng)期以來(lái)，鐵皮石斛種植農(nóng)戶普遍以鐵皮石斛花泡茶飲用，還常見(jiàn)榨汁、炒蛋、煲湯、特色烹飪等方式食用。民間傳統(tǒng)認(rèn)為其具有滋陰潤(rùn)肺、養(yǎng)胃生津、安神解郁的功效，未見(jiàn)有不良反應(yīng)，具有良好的開(kāi)發(fā)前景。前期研究發(fā)現(xiàn)[2-9]，鐵皮石斛花含有大量的黃酮類化合物與有機(jī)酸類、萜類等資源性成分，這些成分具有較強(qiáng)的生物活性，能夠有效的抗氧化、抗衰老、抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫。本實(shí)驗(yàn)旨在優(yōu)化鐵皮石斛花的總黃酮提取工藝，探討其抗氧化作用，為鐵皮石斛花的開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，使鐵皮石斛產(chǎn)品的功效和形式更為多樣化，滿足市場(chǎng)需求。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料 鐵皮石斛花于2016年收集于浙江杭州、金華、臺(tái)州、云南普洱6個(gè)鐵皮石斛種植基地（編號(hào)為S1~S6），經(jīng)鑒定為蘭科植物鐵皮石斛的花，留樣憑證存放于浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥物研究所。

1.2 試劑 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100080-200707；1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH) (上海源葉生物科技有限公司，批號(hào):W09A7E12633)；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽(ABTS)、L-抗壞血酸（Vitamin C）、水楊酸均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，批號(hào)：C627BA0012、C927BA0042、C51213A0021；無(wú)水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、過(guò)硫酸鉀均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器 AG135電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；Lambda45紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Perkin Elmer）；DGG-907013型電熱恒溫干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；DZF-6020型真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Power Wave 340酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Bio-TeR公司)。

2 方法

2.1 鐵皮石斛花總黃酮最佳提取工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1.1 提取方法對(duì)總黃酮提取率的影響 ①加熱回流提取法：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1:100（g·mL-1），80℃回流提取3次，每次1h；②超聲提取法：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1:100（g·mL-1），50℃超聲提取3次，每次40min。探討不同提取方法對(duì)總黃酮提取率的影響。

2.1.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響 固定料液比1:50（g·mL-1）、提取時(shí)間40min、提取溫度70℃、提取次數(shù)1次，探討乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）對(duì)總黃酮提取率的影響。

2.1.1.3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響 固定乙醇的體積分?jǐn)?shù)80%、提取溫度70℃、料液比1:50（g· mL-1）、提取次數(shù)1次，探討提取時(shí)間（20、30、40、50、60min）對(duì)總黃酮提取率的影響。

2.1.1.4 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取時(shí)間40min、提取溫度70℃、提取次數(shù)1次，探討料液比（1:20、1:30、1:40、1:50、1:60g· mL-1）對(duì)總黃酮提取率的影響。

2.1.1.5 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取時(shí)間40min、料液比1:40（g· mL-1）、提取次數(shù)1次，探討提取溫度（45、55、65、75、85℃）對(duì)總黃酮提取率的影響。

2.1.1.6 提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取時(shí)間40min、料液比1:40（g· mL-1）、提取溫度55℃，探討提取次數(shù)（1、2、3、4次）對(duì)總黃酮提取率的影響。

2.1.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、提取溫度(C)、提取次數(shù)(D)為試驗(yàn)因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，每因素3個(gè)水平(表1)，按照L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)(表2)，優(yōu)化鐵皮石斛花總黃酮的提取工藝。

2.1.3 最佳提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 精密稱取鐵皮石斛花粉末1.00g（平行3份），按“2.1.2”項(xiàng)下優(yōu)化所得最佳提取工藝提取鐵皮石斛花總黃酮，并計(jì)算總黃酮提取率。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

2.2 鐵皮石斛花總黃酮含量測(cè)定

2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，精密稱定，以70%乙醇溶解后，置于50mL容量瓶中，用70%乙醇稀釋定容至刻度，搖勻后得到質(zhì)量濃度為0.2mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定 精確移取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液3.0mL，供試品溶液1.0mL，各置于10mL具塞試管中，加70%乙醇溶液至5mL，加5%NaNO2溶液0.4mL，搖勻放置6min，加10%Al(NO3)3溶液0.4mL，搖勻，再放置6min，加4%NaOH溶液4mL，搖勻放置15min，以試劑空白作參比，于紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)上進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)510nm。

2.2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL分別置于10mL具塞試管中，各加70%乙醇溶液至5mL，按2.2.2項(xiàng)下法操作，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程。

2.2.4 總黃酮的含量測(cè)定 精確移取待測(cè)液 1.0 mL，按2.2.2項(xiàng)下法操作，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程計(jì)算總黃酮濃度，并以下式計(jì)算總黃酮的提取率：鐵皮石斛花總黃酮提取率(%)＝

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出的質(zhì)量濃度(mg·mL-1)；V1為反應(yīng)體積(mL)；V2為配制的溶液體積(mL)；v為取樣體積(mL)；m為樣品質(zhì)量(g)。

2.3 鐵皮石斛花總黃酮體外抗氧化活性測(cè)定

2.3.1 樣品溶液的制備 分別準(zhǔn)確稱取6個(gè)不同產(chǎn)地2.00g鐵皮石斛花粉末，按照最佳工藝條件提取，過(guò)濾定容至100mL，提取液減壓濃縮至適量，真空干燥后得干浸膏，試驗(yàn)前用80%乙醇配成所需濃度。

2.3.2 清除DPPH自由基能力的測(cè)定 分別取不同濃度的樣品溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg· mL-1）40μL，加入200μL 0.1mmol·L-1的DPPH無(wú)水乙醇溶液，室溫避光反應(yīng)30min，于517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(Ai)。以L-抗壞血酸作陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)水乙醇作為樣品對(duì)照(Ac)，樣品溶劑作為空白對(duì)照(Ao)，每份樣品平行實(shí)驗(yàn)3次[10]。按照下列公式計(jì)算自由基清除率：DPPH自由基清除率(%)=[Ao-(Ai-Ac)]/Ao×100%。

2.3.3 清除羥自由基能力的測(cè)定 分別取不同濃度的樣品溶液（2、4、6、8、10mg·mL-1）100μL，加入濃度為6.0mmol·L-1硫酸亞鐵，10.0mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液各100μL，再加入6.0mmol·L-1H2O2溶液100μL，置37℃反應(yīng)10min，于510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(Ai)。以L-抗壞血酸作陽(yáng)性對(duì)照，蒸餾水作為樣品對(duì)照(Ac)，樣品溶劑作為空白對(duì)照(Ao)，每份樣品平行實(shí)驗(yàn)3次。按照下列公式計(jì)算自由基清除率：羥自由基清除率(%)=[Ao-(Ai-Ac)]/Ao×100%。

2.3.4 清除ABTS自由基能力的測(cè)定 分別取不同濃度的樣品溶液（0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg·mL-1）50μL，加入200μL ABTS工作液[11]，室溫避光放置6min，于734nm處測(cè)定吸光度(Ai)。以L-抗壞血酸作陽(yáng)性對(duì)照，80%乙醇作為樣品對(duì)照(Ac)，樣品溶劑作為空白對(duì)照(Ao)，每份樣品平行實(shí)驗(yàn)3次[10]。按照下列公式計(jì)算自由基清除率：ABTS自由基清除率(%)=[Ao-(Ai-Ac)]/Ao×100%。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（n=3）表示，采用Pearson相關(guān)系數(shù)對(duì)總黃酮含量與體外抗氧化活性進(jìn)行相關(guān)性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定 進(jìn)行200~700nm全波長(zhǎng)掃描，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液均在510nm處有最大吸收峰，故確定最大吸收波長(zhǎng)為510nm。見(jiàn)圖1，2。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of rutin standard

圖2 樣品溶液的吸收光譜Fig.2 Absorption spectra of sample solution

3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，510nm處測(cè)吸光度，以吸光度(y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程：y＝11.856x-0.0237，R2＝0.9988。結(jié)果表明，在蘆丁質(zhì)量濃度為0.0209～0.0834mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 鐵皮石斛花總黃酮的單因素試驗(yàn)

3.3.1 提取方法對(duì)總黃酮提取率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：加熱回流提取法總黃酮提取率為1.83%，超聲波提取法提取率為1.99%，總黃酮提取率：超聲波提取法＞加熱回流提取法。

3.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響（圖3）。結(jié)果表明：總黃酮提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而升高，于乙醇體積分?jǐn)?shù)80%時(shí)達(dá)到最高值，之后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而降低。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency of total flavonoids

3.3.3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響（圖4）。結(jié)果表明：總黃酮提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，在提取時(shí)間為40min時(shí)達(dá)到最高值；之后隨時(shí)間的延長(zhǎng)總黃酮提取率下降。

圖4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction efficiency of total flavonoids

3.3.4 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響 料液比對(duì)總黃酮得率的影響（圖5）。結(jié)果表明：總黃酮提取率隨溶劑量的增大而升高，在料液比為1：40時(shí)達(dá)到最高值，之后開(kāi)始降低。

圖5 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of material-liquid ratio on extraction efficiency of total flavonoids

3.3.5 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響（圖6）。結(jié)果表明：總黃酮提取率隨著提取溫度的升高先上升后下降，在提取溫度為55℃時(shí)達(dá)到最高值。

圖6 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on extraction efficiency of total flavonoids

3.3.6 提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響 提取次數(shù)對(duì)總黃酮得率的影響（圖7）。結(jié)果表明：總黃酮提取率隨著提取次數(shù)的增加而升高，2次后總黃酮提取率升高的趨勢(shì)較平緩。

圖7 提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.7 Effect of extraction times on extraction efficiency of total flavonoids

表2 總黃酮提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Orthogonal array design matrix and results

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Tab.3 Variance analysis for the orthogonal array design experimental results

3.4 鐵皮石斛花總黃酮的正交試驗(yàn) 選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、提取次數(shù)等較優(yōu)水平，按L9(34)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)(表2、3)。觀察正交試驗(yàn)結(jié)果可知，鐵皮石斛花總黃酮提取中各因素的主次順序?yàn)椋禾崛〈螖?shù)>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比>提取溫度；由正交試驗(yàn)結(jié)果得出最優(yōu)因素水平組合為A2B2C2D3。提取次數(shù)增大會(huì)增加生產(chǎn)成本，綜合考慮，最優(yōu)提取工藝組合為A2B2C2D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1:50、提取溫度55℃、提取次數(shù)2次。

表4 不同樣品中總黃酮含量（n=3）Tab.4 Contents of total flavonoids in extract of different samples（n=3）

3.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按正交試驗(yàn)確定的最優(yōu)提取工藝組合條件，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得出平均總黃酮提取率為1.99%。

3.6 鐵皮石斛花總黃酮含量測(cè)定 鐵皮石斛花各樣品中總黃酮的含量結(jié)果見(jiàn)表4。

3.7 鐵皮石斛花總黃酮體外抗氧化活性測(cè)定

3.7.1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定 結(jié)果如圖8所示，樣品對(duì)DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，清除率隨濃度的增加而增加。IC50值見(jiàn)表5。

圖8 樣品液和Vc清除DPPH自由基的能力Fig.8 Free radical scavenging properties of extracts and Vc against DPPH

3.7.2 清除羥自由基能力的測(cè)定 結(jié)果如圖9所示，樣品對(duì)羥自由基的清除率隨濃度的增加而增加，呈明顯量效關(guān)系。IC50值見(jiàn)表5。

圖9 樣品液和Vc清除羥自由基的能力Fig.9 Free radical scavenging properties of extracts and Vc against ·OH radicals

3.7.3 清除ABTS自由基能力的測(cè)定 結(jié)果如圖10所示，樣品對(duì)ABTS自由基的清除率隨濃度的增加而增加，呈明顯量效關(guān)系。IC50值見(jiàn)表5。

圖10 樣品液和Vc清除ABTS自由基的能力Fig.10 Free radical scavenging properties of extracts and Vc against ABTS

表5 不同樣品的抗氧化活性IC50Tab.5 IC50of different extracts for various antioxidant systems

3.7.4 總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性 對(duì)6批鐵皮石斛花樣品總黃酮含量與清除DPPH自由基能力、清除羥自由基能力和清除ABTS自由基能力進(jìn)行Pearson法相關(guān)性分析，結(jié)果如表6所示，總黃酮含量與羥自由基清除能力有顯著的相關(guān)性（P＜0.05），與DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力相關(guān)性較弱。

表6 總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性Tab.6 Correlations between the antioxidant activities and flavonoids content

4 結(jié)論

4.1 總黃酮提取工藝優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)采用超聲法提取鐵皮石斛花中的黃酮，并通過(guò)單因素考察和正交設(shè)計(jì)，優(yōu)化得到總黃酮得率最高的鐵皮石斛花超聲提取工藝。①單因素試驗(yàn)中總黃酮提取率超聲波提取法大于加熱回流提取法，結(jié)合后面的實(shí)驗(yàn)，其可能是因?yàn)榛亓魈崛囟葹?0℃時(shí)黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定而分解，溶出率低，故選擇超聲波提取法。②乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)總黃酮提取率達(dá)到最高值，這可能與鐵皮石斛花中總黃酮的溶解度有關(guān)。③提取溫度55℃時(shí)總黃酮提取率最大，這種現(xiàn)象可能是因?yàn)樯邷囟仍龃罅它S酮類物質(zhì)的溶出速率，而當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)黃酮類物質(zhì)不穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)被破壞，總黃酮得率有所降低。④在單因素考察的基礎(chǔ)上，正交試驗(yàn)得出最佳工藝條件，經(jīng)驗(yàn)證該工藝穩(wěn)定，提取得到的鐵皮石斛花醇提液中總黃酮含量高。

4.2 三個(gè)體外抗氧化體系活性評(píng)價(jià) 本實(shí)驗(yàn)以DPPH自由基、羥自由基和ABTS自由基的清除率為指標(biāo)，從不同方面綜合評(píng)價(jià)了鐵皮石斛花體外抗氧化效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地鐵皮石斛花的80%醇提物對(duì)DPPH自由基、羥自由基和ABTS自由基均有清除作用，在一定的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性關(guān)系，說(shuō)明其有較好的抗氧化能力。研究顯示[7-8,12-14]，鐵皮石斛花中含多糖、黃酮、多酚等成分，均有一定的抗氧化活性。鐵皮石斛花中黃酮類成分主要是芹菜素為苷元的黃酮二糖碳苷類化合物，周桂芬等[7]發(fā)現(xiàn)上述黃酮碳苷成分具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

4.3 總黃酮含量測(cè)定及體外抗氧化活性相關(guān)性分析本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了各不同來(lái)源鐵皮石斛花總黃酮含量測(cè)定，并進(jìn)一步分析了不同來(lái)源鐵皮石斛花中黃酮含量與羥自由基、DPPH自由基和ABTS自由基清除能力之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示總黃酮含量與羥自由基清除能力有顯著的相關(guān)性（P＜0.05），而與DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力相關(guān)性較弱。這表明上述兩種自由基的清除能力可能不是與黃酮總量相關(guān)，而是與黃酮的具體組成及含量有關(guān)。鐵皮石斛花中黃酮成分以及與清除DPPH、ABTS和羥自由基的關(guān)聯(lián)性及構(gòu)效關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

References：

[1]呂圭源,顏美秋,陳素紅.鐵皮石斛功效相關(guān)藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志,2013,38(4):489-493.

LV Guiyuan,YAN Meiqiu,CHEN Suhong.Review of pharmacological activities of Dendrobium officinale based on traditional functions[J].Chinese Journal of traditional Chinese Medicine,2013,38(4):489-493.

[2]霍昕,周建華,楊迺嘉,等.鐵皮石斛花揮發(fā)性成分研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2008,23(8):735-737.

HUO Xin,ZHOU Jianhua,YANG Naijia,et al.Determination of chemical constituents of essential oil fromflower of Dendrobium candidum Wall.ex Lind1[J].Chinese Journal of traditional Chinese Medicine,2008,23(8):735-737.

[3]何曉艷,吳人照,楊兵勛,等.鐵皮石斛花對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠降壓作用研究[J].浙江中醫(yī)雜志,2016,51(2):152-154.

HE Xiaoyan,WU Renzhao,YANG Bingxun,et al.Study on the antihypertensive effect of Dendrobium officinale flowers in spontaneously hypertensive rats[J].Zhejiang Journal of Traditional Chinese Medicine,2016,51(2):152-154.

[4]陳曉梅,王春蘭,楊峻山,等.鐵皮石斛化學(xué)成分及其分析的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2013,48(19):1634-1640.

CHEN Xiaomei,WANG Chunlan,YANG Junshan,et al. Research Progress on Chemical Composition and Chemical Analysis of Dendrobium officinale[J].Chinese Journalof Pharmaceutical Sciences,2013,48(19):1634-1640.

[5]呂素華,徐萌,張新鳳,等.11個(gè)鐵皮石斛雜交家系鮮花的揮發(fā)性成分分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2016,22(6):52-57.

LV Suhua,XU Meng,ZHANG Xinfeng,et al.Studies on Volatile Constituents of 11 Families of Dendrobium officinale Flowers[J].Chinese Journal of Experimental Medicine, 2016,22(6):52-57.

[6]李文靜,李進(jìn)進(jìn),李桂鋒,等.GC-MS分析4種石斛花揮發(fā)性成分[J].中藥材,2015,38(4):777-780.

LI Wenjing,LI Jinjin,LI Guifeng,et al.Analysis of 4 species of Dendrobium flower volatile components by GC-MS[J].Journal of Chinese Medicinal Material s,2015, 38(4):777-780.

[7]周桂芬,呂圭源.鐵皮石斛不同部位黃酮碳苷類成分及清除DPPH自由基能力比較研究[J].中國(guó)中藥雜志,2012,37 (11):1536-1540.

ZHOU Guifen, LV Guiyuan.Comparativestudieson scavenging DPPH free radicals activity of flavone C-glycosides from different parts of Dendrobium officinale[J]. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine,2012,37 (11):1536-1540.

[8]龔慶芳,何金祥,黃寧珍,等.鐵皮石斛花化學(xué)成分及抗氧化活性研究[J].食品科技,2014,39(12):106-110.

GONG Qingfang,HE Jinxiang,HUANG Ningzhen,et al. Chemical composition and antioxidant activities effec ts of Dendrobium offi cinale flower[J].Food Scienc e and Technology,2014,39(12):106-110.

[9]雷珊珊,呂圭源,金澤武,等.鐵皮石斛花提取物對(duì)甲亢型陰虛小鼠的影響[J].中國(guó)中藥雜志,2015,40(9):1793-1797.

LEI Shanshan,LV Guiyuan,JIN Zewu,et al.Effect of extracts from Dendrobii ifficinalis flos on hyperthyroidism Yin deficiency mice[J].Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine,2015,40(9):1793-1797.

[10]林為藝,顏美秋,呂圭源,等.鐵皮石斛莖非多糖與粗多糖體內(nèi)外抗氧化活性的比較 [J].中藥藥理與臨床,2016,32(2): 138-141.

LIN Weiyi,YAN Meiqiu,LV Guiyuan,et al.Antioxidant activity comparison between non-polysaccharides and crude polysaccharides from Dendrobium officinale stems in vitro and in vivo[J].Pharmacologyand clinic of Chinese medicine, 2016,32(2):138-141.

[11]LUO AX,HE XJ,ZHOU S,et al.Purification,composi-tion analysis and antioxidant activity of the polysaccharides from Dendrobium nobile Lindl[J].Car-bohydrate polymers,2010,79(4):1014-1019.

[12]周桂芬,呂圭源.基于高效液相色譜-二極管陣列光譜檢測(cè)-電噴霧離子化質(zhì)譜聯(lián)用鑒定鐵皮石斛葉中8種黃酮碳苷化合物及裂解規(guī)律研究 [J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2012,47 (1):13-19.

ZHOU Guifen,LV Guiyuan.Study on Eight FlavoneC-glycosides in Dendrobium officinale Leaves and their Fragmentation Pattern by HPLC-DAD-ESI-MSn[J].Chinese Journal of Pharmaceutical Sciences,2012,47(1):13-19.

[13]周桂芬,陳素紅,呂圭源.浙江省鐵皮石斛黃酮類成分高效液相色譜指紋圖譜的建立[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2013,48(15): 1261-1265. ZHOU Guifen,CHEN Suhong,LV Guiyuan.HPLC Fingerprint of Flavonoids in Dendrobium officinale from Zhejiang Province[J].Chinese Journal of Pharmaceutical Sciences,2013,48(15):1261-1265.

[14]黃琴,沈楊霞,張成靜,等.鐵皮石斛多酚和黃酮含量及與抗氧化活性的相關(guān)性 [J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2014,20(3): 438-442.

HUANG Qin,SHEN Yangxia,ZHANG Chengjing,et al. Correlation of the antioxidant property with the total phenolic content and total flavonoids of different Dendrobium offi cinale extracts[J].Chinese Journal of Applied Environmental Biology,2014,20(3):438-442.

Study on Optimum Extraction of Total Flavones in Dendrobium Officinale Flower and Its Antioxidant Activity in Vitro

TANG Jingyue1,YAN Meiqiu2, QI Fangfang1,et al 1.Wenzhou Medical College,Zhejiang(325035),China;2.Zhejiang Chinese Medical University

[Objective]To explore the optimal ultrasonic-assisted extraction conditions of total flavonoids from D-endrobium officinale flower and evaluate the antioxidant activity.[Methods]Orthogonal experiment was conducted to study the influence factor of extracting total flavones from Dendrobium officinale flower，the yield of total flavones as inspection index，and then optimized the extraction technology.The antioxidant effects of the total flavones were determined by hydroxyl,DPPH and ABTS radical scavenging capacities.[Results]The optimal extraction conditions of total flavonoids were ethanol concentration of 80%，material-liquid ratio of 1:50，extraction temperature of 55℃ and 2 extraction times.Under the optimal conditions，the maximum extraction rate of total flavonoids was 1.99%.Extracted total flavonoids had strong scavenging capacity on hydroxyl free radicals,DPPH and ABTS free radicals.[Conclusion]Orthogonal experiment is applicable for the optimization of ultrasonic extraction of total flavonoids from Dendrobium officinale flower. The total flavonoids from Dendrobium officinale flower have strong antioxidant capacity.

Dendrobium officinale flower;total flavonoids;orthogonal experiment;extraction;antioxidant activity

R282.71

A

1005-5509（2017）03-0235-08

10.16466/j.issn1005-5509.2017.03.017

2016-12-08）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81673638）；國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃（2011BA104B06）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)課題（2015Z11；2016ZG16）

Fund projects:National Natural Science Foundation of China(81673638)；National Science&Technology Pillar Program during the Twelfth Five-year Plan Period(2011BA104B06)；Colonel-level topics supported by Zhejiang University of Chinese Medicine(2015Z11;2016ZG16)

陳素紅，E-mail:chensuhong@aliyun.com