益氣滋陰方對免疫性血小板減少癥患者外周血Treg及Foxp3影響的臨床觀察

張宇 錢麗麗 陳穎 高雁婷 陳均法 沈建平 周郁鴻

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 31006

益氣滋陰方對免疫性血小板減少癥患者外周血Treg及Foxp3影響的臨床觀察

張宇 錢麗麗 陳穎 高雁婷 陳均法 沈建平 周郁鴻

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 31006

[目的]探索益氣滋陰方治療免疫性血小板減少癥的療效及其具體機制。[方法]選取112例免疫性血小板減少癥患者，隨機分為對照組（常規(guī)西醫(yī)治療）和治療組（益氣滋陰方+常規(guī)西醫(yī)治療）各56例，同時設(shè)正常對照組56例。治療前后檢測血小板計數(shù)評價總體療效，取外周血單個核細胞檢測Treg百分率及Foxp3 mRNA表達水平。[結(jié)果]治療組總有效例數(shù)47例（83.92%），明顯高于對照組的38例（67.86%，P=0.047）。治療組治療后Treg比例及Foxp3mRNA表達水平較治療前、對照組治療后均明顯升高（P＜0.001）；對照組治療后Treg比例及Foxp3mRNA較治療前均無明顯差異（P=0.055，0.058）；治療組治療后Treg比例及Foxp3mRNA與正常對照組比較仍偏低且有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001）。[結(jié)論]益氣滋陰方能促進Foxp3表達并誘導(dǎo)Treg生成，進而通過恢復(fù)免疫平衡狀態(tài)來治療免疫性血小板減少癥。

免疫性血小板減少癥；Treg；Foxp3；益氣滋陰方

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)是臨床常見血液病，主要病機是免疫系統(tǒng)過度激活后破壞血小板，易復(fù)發(fā)并成為難治[1]。調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）能發(fā)揮免疫耐受和免疫平衡的作用，其數(shù)量減少和功能受損與ITP發(fā)病成正相關(guān)[2]，轉(zhuǎn)錄因子“叉狀頭蛋白p3”（forkhead box p3，F(xiàn)oxp3）是Treg的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。本病中醫(yī)多責之“氣陰”，筆者以此為基礎(chǔ)創(chuàng)立的益氣滋陰方，臨床療效顯著[3]，今予此方治療ITP患者，觀察總體療效、外周血Treg以及Foxp3mRNA的變化，以闡明此方發(fā)揮作用的具體機制。

1 資料與方法

1.1 診斷標準

1.1.1 西醫(yī)診斷標準 參照文獻標準[4]：多次檢查血小板計數(shù)減少；骨髓檢查巨核細胞數(shù)增多或正常，有成熟障礙；排除其他繼發(fā)性血小板減少癥。

1.1.2 中醫(yī)辨證診斷標準 參照文獻標準[5]：主癥，神疲乏力，頭暈?zāi)垦＃募職舛?，手足心熱，口干心煩；次癥，瘀點瘀斑、色淡或紅，久病不愈，食欲不振，目眩耳鳴，潮熱盜汗、顴紅，過勞則加重，胃納欠佳，舌質(zhì)淡紅、苔少或薄白，脈細。主癥必備，次癥具其中2項及2項以上，結(jié)合舌、脈象即可診斷。

1.2 一般資料 選取浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院2012年4月至2016年9月確診為ITP病例112例，同時符合西醫(yī)診斷和中醫(yī)證候辨證標準；年齡在12～80歲；自愿參加本試驗并簽署臨床研究知情同意書。采用數(shù)字表隨機納入治療組及對照組各56例。治療組男33例，女23例；年齡12～77歲，中位年齡39歲。對照組男29例，女27例；年齡13～77歲，中位年齡41歲。同時設(shè)正常對照組56例，標本均來自健康體檢者。三組資料比較，在年齡、性別等方面的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.3 治療方法

1.3.1 對照組 使用西醫(yī)常規(guī)治療。一線治療：（1）腎上腺糖皮質(zhì)激素：潑尼松口服1.0mg/kg/d，嚴重者可用等效劑量地塞米松、甲潑尼龍等。病情穩(wěn)定后快速減量(＜15mg/d)，如不能維持則考慮二線治療。（2）靜脈輸注丙種球蛋白：400mg/kg/d*5d或 1.0g/kg/ d*1d(嚴重者連用2d)，必要時可以重復(fù)。二線治療：包括脾切除、硫唑嘌呤、CD20單抗、TOP激動劑等。

1.3.2 治療組在 對照組治療基礎(chǔ)上加用益氣滋陰方。組成：黃芪30g，鱉甲15g，太子參20g，山海螺30g，紫草9g，茜草9g，干蘆根15g，申骨粉4.5g。每日1劑，分兩次煎服。服用1月為1療程，3個療程后進行評價。

1.4 療效評價 療效評價參照文獻[4]：顯效，血小板計數(shù)＞100×109/L，出血癥狀停止，并維持2周以上；有效，血小板計數(shù)＞50×109/L或較前上升30×109/L以上，出血癥狀停止，并維持2周以上；進步，血小板計數(shù)上升，出血癥狀改善，并維持2周以上；無效，血小板計數(shù)及出血現(xiàn)象無改善?？傆行?(顯效+有效+進步）/總例數(shù)。

1.5 指標檢測

1.5.1 外周血血小板計數(shù) 清晨靜息狀態(tài)下取患者外周血2～3mL于EDTA抗凝試管中，以SF-3000型全自動五分類血球分析儀進行分析。

1.5.2 Treg百分率檢測 清晨取研究對象肝素抗凝靜脈血5mL，常規(guī)分離單個核細胞（PBMC），含10%小牛血清的RPMI1640調(diào)整細胞至1×106/mL，取200μL加入單克隆抗體（Becton,Dickinson and Company,美國）標記的PC5-CD4、FITC-CD25、PE-CD127，設(shè)同型對照管，4℃避光孵育30分鐘后上流式細胞儀檢測,圈定CD4+CD25+CD127low細胞為Treg。

1.5.3 Foxp3 mRNA表達水平檢測 取3×106PBMC，Trizol提取總RNA，定量后取1μgRNA，逆轉(zhuǎn)錄后取cDNA4μl進行PCR。PCR反應(yīng)條件均為94℃變性40s、60℃退火40s、72℃延伸60s,35個循環(huán)。產(chǎn)物2%瓊脂糖電泳,凝膠成像系統(tǒng)掃描。Foxp3 mRNA表達水平以Foxp3/β-actin表達。

Foxp3：

上游5′-AGGCTTCATCTGTGGCATCAT-3′

下游5′-CTTGCGGAACTCCAGCTCAT-3′

β-actin（內(nèi)參）：

上游5′-ATGGATGATGATATCGCGCG-3′下游5′-CATGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGGGCC-3′

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS15.0進行統(tǒng)計分析。正態(tài)數(shù)據(jù)指標以±s表示，總體療效進行Pearson卡方檢驗，計量資料兩兩比較采用配對或成組t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總體療效評價 兩組患者在治療3個月后進行療效評價，治療組總有效例數(shù)為47例（83.92%），對照組的總有效例數(shù)為38例（67.86%），兩者比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.047）。見表1。

2.2 Treg百分率的變化 治療組經(jīng)益氣滋陰方干預(yù)后PBMC中Treg百分率較治療前明顯上升（4.63± 0.39VS0.58±0.07，P＜0.001），且明顯高于對照組治療后（4.63±0.39VS1.30±0.16，P＜0.001），但與正常對照組比較仍偏低且有統(tǒng)計學(xué)差異（4.63±0.39VS6.35±0.93，P＜0.001），對照組治療前后Treg百分率變化無統(tǒng)計學(xué)差異（0.57±0.07VS1.30±0.16，P=0.055）。見圖1。

2.3 Foxp3 mRNA表達水平的變化 治療組經(jīng)益氣滋陰方干預(yù)后PBMC中Foxp3 mRNA表達水平較治療前明顯上升（1.13±0.10VS0.39±0.10，P＜0.001）,且明顯高于對照組治療后（1.13±0.10VS0.72±0.23，P＜0.001），但與正常對照組比較仍偏低且有統(tǒng)計學(xué)差異（1.13±0.10VS1.46±0.17，P＜0.001），對照組治療前后Foxp3 mRNA表達水平無統(tǒng)計學(xué)差異（0.48±0.12VS0.72±0.23， P=0.058）。見圖2。

表1 兩組患者治療后總體療效評價[例（%）]

3 討論

圖1 三組間PBMC中Treg百分率的變化（%）注：Treg百分率的變化在治療組治療后與治療前、對照組治療后、正常組行配對或成組t檢驗，均為**P＜0.001。

圖2 三組間PBMC中Foxp3 mRNA表達水平變化注：Foxp3 mRNA表達水平的變化在治療組治療后與治療前、對照組治療后、正常組行配對或成組t檢驗，均為**P＜0.001。

ITP是臨床最為常見的出血性疾病。經(jīng)典理論認為該病的發(fā)生是由于機體產(chǎn)生了特異性自身抗體，導(dǎo)致血小板被單核巨噬細胞或免疫系統(tǒng)過渡破壞?，F(xiàn)代研究證實除了體液免疫紊亂外，細胞免疫失衡也在本病發(fā)展中起到重要作用[2]。Treg作為T細胞中獨特的亞群，主要起免疫耐受和免疫抑制的作用。其數(shù)量減少和功能受損后，抑制功能減弱導(dǎo)致自身反應(yīng)性T細胞增殖活性提高；分泌TGF-β、IL-10等抑制性細胞因子水平降低導(dǎo)致B細胞增殖產(chǎn)生大量抗血小板抗體[6]，最終導(dǎo)致本病發(fā)生。Treg數(shù)量減少和功能受損已被證實和ITP發(fā)病成正相關(guān)[7]。因此，尋找促進Treg數(shù)量及功能恢復(fù)的方法是目前臨床研究的熱點與難點。Treg的特異性標志是轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，其在細胞內(nèi)的穩(wěn)定表達是Treg分化完成的標志[8]。

ITP屬中醫(yī)學(xué)“血癥”、“發(fā)斑”等范疇，其主要病機為火熱熏灼或氣虛不攝，致使血液不循常道溢出而發(fā)病。本病多責之“氣陰”：久病自虛，氣不攝血則血溢脈外；陰分虧損，虛火內(nèi)盛則迫血妄行。我們以此為根據(jù)，創(chuàng)立益氣養(yǎng)陰方治療ITP，取得了滿意的臨床療效。此方為增血湯合生血散組成（黃芪、鱉甲、太子參、山海螺、紫草、茜草、干蘆根、猴骨粉)。黃芪與鱉甲同為君藥，黃芪補氣固表，鱉甲滋腎潛陽，兩藥共用氣陰雙補。太子參、山海螺為臣藥，太子參為補氣良藥，山海螺為補中益氣良品，兩者配以黃芪，氣旺則能固攝，陰血循經(jīng)而行。蘆根、紫草、茜草為佐藥，蘆根清熱生津，紫草清熱涼血，茜草涼血止血。猴骨粉祛風除濕、柔肝養(yǎng)血。

本項目組既往研究已證實，益氣滋陰方能顯著提升ITP患者外周血小板計數(shù)[9]，同時對T淋巴細胞亞群的表達有調(diào)節(jié)作用[10]，包括促使CD3+、CD4+細胞表達增高，CD8+細胞表達下降，而對于ITP發(fā)病環(huán)節(jié)中關(guān)鍵的Treg及其轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達尚無研究涉及。本研究希望通過檢測Treg比例、Foxp3mRNA表達水平的變化，闡明益氣滋陰方治療ITP的具體機制。從結(jié)果分析，治療組的總體療效明顯優(yōu)于對照組，說明益氣滋陰方確能提升ITP患者血小板并改善病情。治療組在治療后Treg比例及Foxp3mRNA表達水平較治療前均明顯升高，且明顯高于對照組治療后數(shù)據(jù)，而對照組治療前后Treg比例及Foxp3mRNA表達水平無明顯差異，說明益氣滋陰方治療ITP并提升血小板計數(shù)有可能是通過促進Foxp3表達并誘導(dǎo)Treg生成，進而抑制自身反應(yīng)性T細胞增殖活性，分泌TGF-β、IL-10等抑制性細胞因子[11]，最終發(fā)揮免疫耐受和免疫抑制作用。

該方治療后患者Treg比例及Foxp3mRNA表達雖然有所恢復(fù)，但與正常對照組比較仍明顯偏低，這也為本方治療ITP提供了后續(xù)的研究方向和思路，筆者將繼續(xù)篩選本方的有效成分，以進一步提高本方治療后患者Treg比例及Foxp3mRNA表達水平為目標，不斷提高本病的臨床療效。

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The Clinical Observation of Influence to Treg and Foxp3 in Immune Thrombocytopenia Treated by Qi-supplementing and Yin-nourishing Prescription

ZHANG Yu,QIAN Lili,CHEN Yin,et al The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006).

[Objective]To explore the effect and mechanism of Qi-supplementing and Yin-nourishing prescription treated for immune thrombocytopenia. [Methods]Select 112 cases of immune thrombocytopenia patients,randomly divided into control group(conventional western medicine therapy)and treatment group(Qi-supplementing and Yin-nourishing prescription+conventional western medicine therapy)equally,at the same time establish normal control group including 56 healthy cases.Peripheral blood platelet count and mononuclear cell were detected for percentage of Treg and Foxp3 mRNA expression level. [Results]Treatment group’s overall efficacy was significantly higher than control group 47(83.92%)versus 38(67.86%),P=0.047),treatment group’s Treg and Foxp3 mRNA expression level after treatment were significantly higher than pre-treatment and control group(P＜0.001);The control group’s Treg and Foxp3 mRNA had no obvious difference before and after treatment(P=0.055,0.058);Treatment group’s higher Treg ratio and Foxp3 mRNA expression level were still lower compared with normal control group(P＜0.001).[Conclusion]Qi-supplementing and Yin-nourishing prescription can promote Foxp3 expression and induce Treg generation,and then treat ITP by restoring the immune balance.

immune thrombocytopenia;Treg;Foxp3;Qi-supplementing and Yin-nourishing prescription

R543

A

1005-5509（2017）03-0215-04

10.16466/j.issn1005-5509.2017.03.011

2016-11-03）

國家自然科學(xué)基金（81603573）

Fund project:National Natural Scientific Foundation(81603573)