雙黃連口服液（僅適用于兒童）的大鼠毒理學(xué)研究

賀一新+樊靜恒+董金鵬+邢澤田

摘要：目的 觀察雙黃連口服液（僅適用于兒童）對SD離乳大鼠一般狀況、體質(zhì)量、攝食量、生長發(fā)育、血常規(guī)和病理學(xué)的影響，為臨床安全用藥提供實(shí)驗依據(jù)。方法 SD離乳大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為對照組和雙黃連口服液低、中、高劑量組，每組30只。各給藥組給予相應(yīng)劑量雙黃連口服液（僅適用于兒童）濃縮膏灌胃，每日1次，連續(xù)33 d。分別觀察給藥期、恢復(fù)期（停藥25 d）各組大鼠毒性反應(yīng)。結(jié)果 各組大鼠給藥期和恢復(fù)期一般狀況、個體發(fā)育、臟器質(zhì)量和系數(shù)，以及剖檢肉眼觀察和病理結(jié)果均無明顯差異。雙黃連口服液高劑量組雌鼠和雄鼠體質(zhì)量與攝食量不同程度低于對照組；給藥期血常規(guī)檢測顯示，雙黃連口服液高劑量組雌鼠和雄鼠淋巴細(xì)胞比率顯著降低、中性粒細(xì)胞比率顯著升高，恢復(fù)期恢復(fù)正常。結(jié)論 雙黃連口服液（僅適用于兒童）濃縮膏對幼年大鼠全身臟器和組織無相關(guān)毒性作用，安全性好。

關(guān)鍵詞：雙黃連口服液（僅適用于兒童）；毒理學(xué)實(shí)驗；安全劑量；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.016

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）04-0061-06

Rat Toxicological Study of Shuanghuanglian Oral Solution （Only for Children） HE Yi-xin， FAN Jing-heng， DONG Jin-peng， XING Ze-tian （Pharmaceutical Engineering Center， Henan Taloph Pharmaceutical Stock Co.， Ltd， Zhengzhou 450001， China）

Abstract： Objective To study the effects of Shuanghuanglian Oral Solution （only for children） on general condition， body weight， food intake， growth and development， blood routine and pathologic changes of SD weanling rats； To provide experimental references for clinical safe medication. Methods SD weanling rats were randomly divided into control group， Shuanghuanglian （only for children） Oral Solution low-， medium- and high-dose group according to body mass， with 30 rats in each group. Each administration group was given corresponding amount of Shuanghuanglian Oral Solution （only for children） concentrated ointment for gavage， once a day， for 33 d. The toxicity of the rats during dosing period and recovery period （medicine withdrawal 25 d） was observed. Results There were no significant differences in general condition， individual development， organ mass and coefficient， and internal fixation and pathological findings of rats in administration groups during dosing period and recovery period. The body mass and food intake of female and male rats in the Shuanghuanglian Oral Solution high-dose group were lower than those in the control group. The blood routine test during dosing period showed that the lymphocyte ratio of female rats and male rats in Shuanghuanglian Oral Solution high-dose group decreased significantly， neutrophil ratio increased significantly， and then returned to normal level in recovery period. Conclusion Shuanghuanglian Oral Solution （only for children） concentrated ointment has no toxic effect on the whole body organs and tissues of juvenile rats， and the safety is good.

Key words： Shuanghuanglian Oral Solution （only for children）； toxicological test； safe dosage； ratsendprint

雙黃連口服液全方由金銀花、黃芩、連翹3味中藥組成，具有抗菌、抗病毒和解熱消炎的功效[1]。雙黃連口服液（僅適用于兒童）是在雙黃連口服液原有基礎(chǔ)上應(yīng)用先進(jìn)工藝將其制成兒童適宜的藥分含量。由于兒童生理解剖特點(diǎn)與成人不同，對藥物的吸收代謝、療效和毒性反應(yīng)等均有其特殊性[2]，為保證兒童

用藥的安全性，本實(shí)驗對雙黃連口服液（僅適用于兒童）毒理學(xué)進(jìn)行研究，為臨床安全用藥提供實(shí)驗依據(jù)。

1 實(shí)驗材料

1.1 動物

SPF級SD離乳（出生21 d）大鼠120只，雌雄各半，體質(zhì)量40～60 g，北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2012-0001。分籠飼養(yǎng)，2～5只/籠，室溫20～26 ℃，相對濕度40%～70%，人工光照，12 h明暗周期，通風(fēng)≥15次/h，自由攝食飲水。

1.2 藥物

雙黃連口服液（僅適用于兒童）濃縮膏，河南太龍藥業(yè)股份有限公司，批號16030711。

1.3 主要試劑與儀器

PEROX SHEATH、PEROX1、PEROX2、PEROX3、RBC/PLT、AUTORETIC、SHEATH/RINSE，德國Simens。ADVIA2120血球計數(shù)儀（德國Simens），Excelsior ES全自動脫水機(jī)（英國Shandon），石蠟包埋機(jī)（英國Shandon Histocentre），切片機(jī)（英國Shandon Finesse），全自動染色機(jī)（英國Shandon Varistain Gemini），顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus）。

2 實(shí)驗方法

2.1 分組和給藥

實(shí)驗大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為對照組和雙黃連口服液低（28.5 g/kg）、中（57.0 g/kg）、高（113.9 g/kg）劑量組，每組30只，各給藥組予相應(yīng)劑量雙黃連口服液（僅適用于兒童）濃縮膏灌胃，相當(dāng)于小兒臨床使用劑量（1.8 g/kg體質(zhì)量）的15.8、31.7、63.2倍，對照組給予等量純凈水。給藥體積均為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)33 d。

2.2 指標(biāo)檢測

于給藥期（33 d）和恢復(fù)期（停藥25 d）分別觀察每組大鼠一般狀況、體質(zhì)量和攝食量；測量大鼠頂臀和脛骨長度，觀察個體發(fā)育情況；檢測血常規(guī)，包括紅細(xì)胞（RBC）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、紅細(xì)胞平均體積（MCV）、紅細(xì)胞分布寬度（RDW）、血紅蛋白（HGB）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白量（MCH）、平均血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板計數(shù)（PLT）、降鈣素原（PCT）、平均血小板體積（MPV）、血小板分布寬度（PDW）、白細(xì)胞（WBC）、淋巴細(xì)胞（LYM）、中性粒細(xì)胞（NEUT）、單核細(xì)胞（MONO）及網(wǎng)織紅細(xì)胞（RET）；大鼠脫頸處死剖檢，檢測臟器質(zhì)量，并計算臟器系數(shù)（臟器質(zhì)量÷動物體質(zhì)量×100%）。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以—x±s表示，體質(zhì)量、攝食量、生長發(fā)育、血常規(guī)、臟器指數(shù)等指標(biāo)按雌雄進(jìn)行分析，組間比較用單因素方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

4 結(jié)果

4.1 雙黃連口服液（僅適用于兒童）對大鼠一般狀況、體質(zhì)量及攝食量的影響

給藥期間各組大鼠自主活動、飲水、攝食及二便正常，精神狀態(tài)良好；毛色有光澤，口、鼻、眼均未見異常分泌物，未見呼吸異常。實(shí)驗期間各組大鼠均未死亡。各給藥組給藥后大鼠體質(zhì)量均保持增長趨勢，給藥第5日至給藥結(jié)束高劑量組雄鼠體質(zhì)量均低于對照組；恢復(fù)期高劑量組雌鼠體質(zhì)量低于對照組，見圖1、圖2。低劑量組雌鼠給藥第17日和高劑量組雄鼠給藥第13、17日攝食量低于對照組，見圖3、圖4。

4.2 雙黃連口服液（僅適用于兒童）對大鼠個體發(fā)育的影響

給藥期高劑量組雄鼠脛骨長和恢復(fù)期高劑量組雌鼠頂臀長低于對照組，給藥期和恢復(fù)期其他各給藥組大鼠頂臀長和脛骨長度未見明顯差異。結(jié)果見表1、表2。

4.3 雙黃連口服液（僅適用于兒童）對大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

與對照組比較，給藥期低劑量組RDW、中劑量組PDW、高劑量MCV等指標(biāo)雖有顯著變化，但未見明顯量效關(guān)系，數(shù)值變化也未見明顯的規(guī)律，且變化幅度小（數(shù)值變化小于對照組均值的5%），變化差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。給藥期高劑量組雌鼠和雄鼠LYM比率顯著降低，NEUT比率顯著升高，恢復(fù)期恢復(fù)。結(jié)果見表3、表4。

4.4 雙黃連口服液（僅適用于兒童）對大鼠臟器質(zhì)量和臟器系數(shù)的影響

與對照組比較，大鼠給藥期腎臟、胸腺、肺臟、腎上腺、附睪及恢復(fù)期心臟、脾臟、肺臟、腎上腺、子宮等臟器濕重與臟器系數(shù)有改變，但上述變化未見與藥理相關(guān)的病理改變，臟器系數(shù)無明顯異常，分析認(rèn)為數(shù)值變化與藥物無關(guān)。結(jié)果見表5～表8。

4.5 雙黃連口服液（僅適用于兒童）對臟器組織病理的影響

給藥期對照組大鼠肝臟出現(xiàn)微小肉芽腫（10/20），肺被膜下或肺小葉內(nèi)見微小炎性結(jié)節(jié)（5/20），腎小管內(nèi)見蛋白管型（6/20），皮質(zhì)部近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)玻璃樣小滴變性（2/20）；高劑量組大鼠肝臟出現(xiàn)微小肉芽腫（7/20），肺被膜下或肺小葉內(nèi)見微小炎性結(jié)節(jié)（2/20），腎皮質(zhì)或髓質(zhì)個別腎小管內(nèi)形成蛋白管型（1/20），皮質(zhì)部近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)玻璃樣小滴變性（2/20）。恢復(fù)期，對照組大鼠肝臟出現(xiàn)微小肉芽腫（6/10），肺被膜下見微小炎性結(jié)節(jié)（3/10），腎皮質(zhì)部近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)玻璃樣小滴變性（4/10）；高劑量組大鼠肝臟出現(xiàn)微小肉芽腫（5/10），肺被膜下見微小炎性結(jié)節(jié)（1/10），腎皮質(zhì)部近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)玻璃樣小滴變性（1/10）。高劑量組與對照組比較無明顯差異，且大多為動物的自發(fā)性病變，與藥物的毒性無關(guān)。endprint

5 討論

本實(shí)驗結(jié)果顯示，給藥期各給藥組大鼠體質(zhì)量均保持增長趨勢，表明雙黃連口服液（僅適用于兒童）對幼鼠的總體營養(yǎng)狀態(tài)、生理狀態(tài)和健康狀況無明顯影響。作為動物體各項生理功能的具體執(zhí)行者，動物臟器系數(shù)可近似反映該臟器的功能狀態(tài)和病變情況[3]，各給藥組大鼠脾臟、腎臟、腎上腺、子宮濕重有升高或降低的現(xiàn)象，但未見與藥物相關(guān)的病理改變，其臟器系數(shù)也無明顯異常，分析認(rèn)為數(shù)值變化與藥物無關(guān)，雙黃連口服液（僅適用于兒童）在長期服用中未見明顯毒性靶器官。血常規(guī)檢測顯示，給藥期雌鼠和雄鼠高劑量組LYM比率降低、NEUT比率升高，提示高劑量雙黃連口服液（僅適用于兒童）可能引起幼鼠機(jī)體炎癥反應(yīng)及肝臟脂質(zhì)化損傷[4-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，雙黃連口服液中有效成分之一綠原酸作為一種可疑的致敏因子在高劑量時會引起促炎因子白細(xì)胞介素（IL）-6和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)的增加，并引起組織中大量炎性細(xì)胞的浸潤，造成組織結(jié)構(gòu)破壞，使機(jī)體發(fā)生炎性損傷；而高劑量綠原酸同樣能誘發(fā)氧化應(yīng)激，包括促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生和降低抗氧化酶的活性，引起組織脂質(zhì)氧化物的損傷；雙黃連口服液具有與綠原酸相同的促氧化作用及劑量依賴性，兩者均可上調(diào)組織中核因子-κB的表達(dá)、引起IL-10/TNF-α比率下降，破壞機(jī)體抗/促炎反應(yīng)的平衡[7-10]。這可能是雙黃連口服液（僅適用于兒童）高劑量組給藥期引起LYM比率降低、NEUT比率升高的原因，但這種現(xiàn)象在恢復(fù)期恢復(fù)正常，顯示此種毒性作用可逆。

綜上，雙黃連口服液（僅適用于兒童）無明顯毒性反應(yīng)，潛在可能毒性靶器官為肝臟，而此種毒性反應(yīng)可逆，基本無毒作用劑量為28.5、57.0 g原藥材/kg（相當(dāng)于臨床劑量15.8、31.7倍）。目前其毒性作用機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)尚未明確，雙黃連口服液（僅適用于兒童）眾多有效成分中主要毒性物質(zhì)還未闡明，今后仍需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 莫紅櫻，賴克方，江永南，等.雙黃連及其拆方抗呼吸道合胞病毒作用的藥效學(xué)研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2005，11（3）：194-196.

[2] 劉勤.兒童生理特點(diǎn)與藥物不良反應(yīng)[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2011， 5（1）：121-122.

[3] 陳賢鈞，趙紅剛.鹽制杜仲對小鼠生長發(fā)育與臟器系數(shù)的影響[J].四川中醫(yī)，2005，23（11）：29-31.

[4] 趙毓梅，鄭定仙，黃業(yè)宇，等.SD大鼠血常規(guī)、血液生化指標(biāo)、臟體比正常參考值范圍研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2002，12（2）：165-167.

[5] 熊小敏.中性粒細(xì)胞指數(shù)在膿毒血癥患者外周血中的表達(dá)及臨床意義的研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

[6] 肖婧，申丹，劉永革，等.以流式細(xì)胞術(shù)建立中國漢族健康兒童外周血淋巴細(xì)胞亞群相對計數(shù)的正常參考值[J].中國循證兒科雜志，2010， 5（4）：245-249.

[7] 都文淵.高劑量綠原酸及其中藥注射劑引微循環(huán)障礙的機(jī)制研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

[8] 張信岳，陳愛君，李欽，等.綠原酸主動全身過敏與被動皮膚過敏的實(shí)驗研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2011，18（2）：127-128.

[9] 葉正良，周大靜，岳洪水，等.中藥注射劑安全性研究的思考[J].毒理學(xué)雜志，2007，21（4）：297.

[10] 趙玉斌，肖穎，謝雁鳴，等.雙黃連注射液過敏原研究進(jìn)展及其重要致敏原的易感基因研究策略[J].中國中藥雜志，2011，36（8）：1106-1108.endprint