路路通酸對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞和宮頸癌C-33A細(xì)胞增殖的影響

穆曉婷，錢 平，蔣璐璐，王 玥，靳 鑫，張東方

路路通酸對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞和宮頸癌C-33A細(xì)胞增殖的影響

穆曉婷，錢 平，蔣璐璐，王 玥，靳 鑫，張東方*

目的 研究路路通酸(BTA)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞及宮頸癌C-33A細(xì)胞增殖的影響。方法 采用MTT法檢測(cè)不同濃度BTA作用不同時(shí)間后對(duì)MCF-7細(xì)胞、C-33A細(xì)胞的增殖抑制作用；流式細(xì)胞儀檢測(cè)BTA處理后細(xì)胞周期的變化。結(jié)果 BTA作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞24、48、72 h后的IC50分別為(37.62±1.72)、(27.32±0.99)、(19.19±0.90)μmol/L。BTA作用于宮頸癌C-33A細(xì)胞24、48、72 h后的IC50分別為(34.55±0.88)、(27.20±1.03)、(16.74±0.79)μmol/L，BTA對(duì)2種細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，且呈濃度時(shí)間依賴性(P<0.05)，流式結(jié)果顯示，BTA將MCF-7細(xì)胞阻滯在S期，并誘導(dǎo)其凋亡；BTA將C-33A細(xì)胞阻滯在G1-S期。結(jié)論 BTA對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞和宮頸癌C-33A細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖抑制作用，其機(jī)制與細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

路路通酸；乳腺癌；宮頸癌；增殖抑制

0 引言

路路通為金縷梅科植物楓香樹(LiquidambarformosanaHance)的干燥成熟果實(shí)，是臨床常用中藥，具有祛風(fēng)活絡(luò)、利水、通經(jīng)的功效，用于治療關(guān)節(jié)痹痛、麻木拘攣、水腫脹滿、乳少經(jīng)閉等證[1]?，F(xiàn)代臨床研究表明，路路通用于治療乳腺炎、卵巢囊腫、痛經(jīng)、閉經(jīng)等疾病療效顯著[2-3]。但是否可用于乳腺癌、宮頸癌的治療尚未見(jiàn)明確報(bào)道。路路通酸(Betulonic acid,BTA)，又稱樺木酮酸，為路路通的主要有效成分[4]，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，BTA具有良好的抗腫瘤活性，對(duì)卵巢癌、前列腺癌,人肝癌HepG-2細(xì)胞、人胃癌SGC-7901細(xì)胞和抗動(dòng)物移植性S180、H22荷瘤細(xì)胞等的增殖有明顯抑制作用[5-8]，對(duì)乳腺癌和宮頸癌的研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)就BTA對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞及宮頸癌C-33A細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制進(jìn)行研究，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 路路通酸(BTA)(純度≥98%)，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥與生藥學(xué)教研室提供；人乳腺癌(MCF-7)細(xì)胞、人宮頸癌(C-33A)細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室提供。BTA溶解于二甲基亞砜(DMSO)后配制成10 mmol/L儲(chǔ)備液于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(MODEL 3111，美國(guó)Thermo)；垂直層流潔凈工作臺(tái)(HCB-1300V，中國(guó)海爾)；酶標(biāo)儀(14495，日本BIO-RAD)；流式細(xì)胞分選儀(FACSCAN，美國(guó)BD)；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(AAJ307791，美國(guó)GE)；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基(AAK308935，美國(guó)GE)；胰酶(03050-1A，以色列Bioind)；胎牛血清(TBD31HB，天津?yàn)?；溴化四氮唑藍(lán)(MTT)(JT343-250MG，美國(guó)Genview)；二甲基亞砜(DMSO)(MB-D4253，杭州柯氏)；PI染液(CF0031，北京鼎國(guó))；其余有機(jī)試劑為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，人宮頸癌C-33A細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)傳代。

1.2.2 MTT法檢測(cè)BTA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響 取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞和C-33A細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每孔4 000～5 000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)12 h使細(xì)胞貼壁。向每孔內(nèi)加入用對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基稀釋后的BTA儲(chǔ)備液，使終濃度分別為2、4、6、8、10、15、20、25、30、40 μmol/L，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行孔。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照孔(含DMSO的培養(yǎng)基溶液)和空白對(duì)照孔(只含培養(yǎng)基溶液)。共同培養(yǎng)24、48和72 h后，分別于每孔加入MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸凈上清液并棄掉，每孔加入DMSO 200 μL，37 ℃培養(yǎng)20 min后震蕩使結(jié)晶完全溶解。酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處各孔的光密度值(OD值)，繪制生長(zhǎng)曲線，并按以下公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(Inhibition rate,IR)：IR=(陰性對(duì)照組OD值-加藥組OD值)/陰性對(duì)照組OD值×100%。以IR值對(duì)藥物濃度的對(duì)數(shù)值進(jìn)行Sigmoidal擬合，計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BTA對(duì)細(xì)胞周期的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞和C-33A細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，37 ℃、5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)12 h使細(xì)胞貼壁。加入BTA溶液，使藥物終濃度達(dá)到40 μmol/L，每組設(shè)3個(gè)對(duì)照孔。培養(yǎng)24 h后胰酶消化細(xì)胞并收集，加入PBS混勻，1 000 r/min離心5 min后棄去上清，重復(fù)2遍后移入1.5 mL離心管，注入0.8 mL預(yù)冷的70%乙醇溶液，4 ℃過(guò)夜固定細(xì)胞。PBS沖洗細(xì)胞2次除凈乙醇，將細(xì)胞重懸于1 mL PI染液，37 ℃避光孵育30 min染色后，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用雙樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BTA對(duì)2種細(xì)胞增殖的影響 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，BTA作用MCF-7細(xì)胞24、48、72 h的IC50分別為(37.62±1.72)、(27.32±0.99)、(19.19±0.90)μmol/L。BTA作用C-33A細(xì)胞24、48、72 h的IC50分別為(34.55±0.88)、(27.20±1.03)、(16.74±0.79)μmol/L，隨著BTA濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞受到的抑制作用逐漸增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 BTA對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率曲線

圖2 BTA對(duì)C-33A細(xì)胞的增殖抑制率曲線

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BTA對(duì)2種腫瘤細(xì)胞周期的影響 從圖3可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組G1期細(xì)胞分布分別為(44.17%±1.32%) vs.(54.75%±3.23%)；S期分別為(45.32%±3.56%) vs.(31.46%±3.78%)；G2期分別為(10.5%±2.87%) vs.(13.79%±2.37%)；用BTA處理MCF-7細(xì)胞后，G1期的細(xì)胞比例減少，S期細(xì)胞比例增加，細(xì)胞阻滯在S期，并且在G0/G1峰前出現(xiàn)凋亡峰。相同濃度下，BTA對(duì)C-33A細(xì)胞周期抑制情況與MCF-7細(xì)胞不同，由圖4可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組G1期細(xì)胞分布分別為(83.74%±1.49%) vs.(79.53%±2.18%)；S期分別為(6.55%±0.57%) vs.(12.8%±1.65%)；G2期分別為(9.71%±1.19%) vs.(8.33%±0.89%)，與對(duì)照組相比，G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例減少，G1-S期進(jìn)程受阻，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 流式檢測(cè)BTA作用MCF-7細(xì)胞24 h后細(xì)胞周期的變化

圖4 流式檢測(cè)BTA作用C-33A細(xì)胞24 h后細(xì)胞周期的變化

3 討論

乳腺癌和宮頸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，位居全球女性發(fā)病和死亡的前2位，治療多以手術(shù)和放化療為主，對(duì)患者不良反應(yīng)較大[9]。近年來(lái)，隨著對(duì)中醫(yī)中藥抗腫瘤治療的深入研究，對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制作用的中藥成分逐漸受到人們的重視[10]。BTA是從中藥路路通中分離得到的天然產(chǎn)物，文獻(xiàn)報(bào)道BTA對(duì)人鼻咽癌HONE-1細(xì)胞、人口腔表皮樣癌細(xì)胞KB、人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞有細(xì)胞毒作用[11]。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，BTA能抑制人肝癌HepG-2細(xì)胞和人胃癌SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)，并可促進(jìn)小鼠肝癌H22細(xì)胞凋亡[12]。本研究結(jié)果表明，BTA對(duì)MCF-7細(xì)胞及C-33A細(xì)胞的增殖均有較強(qiáng)的抑制作用，并能誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下自動(dòng)結(jié)束生命的過(guò)程，受內(nèi)在遺傳機(jī)制調(diào)控，主要通過(guò)外源性途徑、內(nèi)源性途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激觸發(fā)[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，BTA可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，Yang等[10]報(bào)道，BTA對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞和前列腺癌PC3細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BTA通過(guò)激活p53蛋白，上調(diào)Bax，Caspase-3、Caspase-9蛋白的活性，觸發(fā)線粒體凋亡通路引起MGC-803細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。張秀娟等[11]通過(guò)對(duì)H22荷瘤小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，BTA可能通過(guò)上調(diào)p53蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)H22細(xì)胞凋亡，并能阻斷G2期、S期細(xì)胞向M期的進(jìn)程，其機(jī)制可能與通過(guò)抑制PI3K/Akt存活通路有關(guān)。細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的破壞與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，本研究結(jié)果顯示，BTA可引起MCF-7細(xì)胞凋亡，使其S期阻滯，與文獻(xiàn)報(bào)道BTA對(duì)H22細(xì)胞作用結(jié)果一致，推測(cè)BTA可激活凋亡蛋白，使細(xì)胞停滯在有絲分裂開始之前，從而產(chǎn)生增殖抑制作用；而BTA作用于C-33A細(xì)胞后，將其阻滯于G1-S期，使其DNA復(fù)制過(guò)程受阻，BTA作用于不同細(xì)胞系所引起的相關(guān)基因或周期蛋白表達(dá)的不同，表現(xiàn)在細(xì)胞周期被阻滯在不同的階段，以及是否有凋亡的發(fā)生[15]。目前，BTA的抗腫瘤機(jī)制研究尚不全面，其對(duì)不同成因和發(fā)病部位的腫瘤細(xì)胞作用靶點(diǎn)不同，由此帶來(lái)的影響和內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，BTA可以抑制MCF-7細(xì)胞以及C-33A細(xì)胞增殖，其機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞周期有關(guān)，具體機(jī)制還需深入研究，以期為BTA應(yīng)用于臨床治療提供依據(jù)。

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Effect of betulonic acid on proliferation of human breast cancer MCF-7 cells and human cervical cancer C-33A cells

MU Xiao-ting,QIAN Ping,JIANG Lu-lu,WANG Yue,JIN Xin,ZHANG Dong-fang*

(Department of Pharmacognosy,School of Pharmacy,China Medical University,Shenyang 110122,China)

Objective To study the effect of betulonic acid on proliferation of human breast cancer MCF-7 cells and human cervical cancer C-33A cells.Methods MTT assay was used to observe the effect of BTA on growth of cell MCF-7 and cell C-33A in various concentrations for different time periods.Cell cycle and cell apoptosis of these cells were assessed by flow cytometry.Results MTT results showed that the IC50on MCF-7 cells were (37.62±1.72),(27.32±0.99) and (19.19±0.90) μmol/L after being cultured for 24 h,48 h,and 72 h,while on C-33A cells they were (34.55±0.88)，(27.20±1.03) and (16.74±0.79)μmol/L.BTA could significantly inhibit the proliferation of MCF-7 cells and C-33A cells in a dosage-and time-dependent manner (P<0.05).Flow cytometry analysis showed that BTA could induce MCF-7 cells arrest at S phase,and induce apoptosis,while it induced MCF-7 cells arrest at G1-S phase.Conclusion BTA can inhibit the proliferation of MCF-7 cells and C-33A cells;the change of cell cycle and apoptosis may be involved in the process of inhibition.

Betulonic acid;Breast cancer;Cervical cancer;Proliferation inhibition

2016-09-19

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥與生藥學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201703004