活性維生素D類似物對(duì)內(nèi)毒素感染小鼠腎臟細(xì)胞因子的影響

徐櫻溪,趙 晴,孫 燦,車千紅,付 瑜,丁 丁,孔 娟

活性維生素D類似物對(duì)內(nèi)毒素感染小鼠腎臟細(xì)胞因子的影響

徐櫻溪,趙 晴,孫 燦,車千紅,付 瑜,丁 丁,孔 娟*

目的 研究活性維生素D類似物對(duì)內(nèi)毒素感染小鼠腎臟細(xì)胞因子的影響。方法 將C57 BL/6源性野生小鼠(20只)隨機(jī)分為正常對(duì)照組(CON組)、帕立骨化醇組(P組)、脂多糖組(LPS組)、帕立骨化醇+脂多糖組(P+LPS組)。比較各組小鼠一般狀態(tài)，應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血清肌酐含量，實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定小鼠腎臟中細(xì)胞因子水平。結(jié)果 一般狀態(tài)比較，P+LPS組小鼠較LPS組小鼠不良反應(yīng)減輕。各組小鼠腎臟形態(tài)學(xué)及血清肌酐水平未見(jiàn)明顯差異。P+LPS組腎臟組織細(xì)胞因子IL-1β、ICAM、TNF-α、INF-γ表達(dá)比LPS組明顯下降(P<0.05)。結(jié)論 活性維生素D類似物能顯著減少內(nèi)毒素感染小鼠腎臟組織中IL-1β、ICAM、TNF-α、INF-γ的含量，減輕炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)的腎臟損傷，從而起到對(duì)腎臟的保護(hù)作用。

活性維生素D類似物;內(nèi)毒素;細(xì)胞因子

0 引言

維生素D主要通過(guò)作用于骨、腎、甲狀旁腺等組織調(diào)節(jié)鈣磷代謝，維持礦物質(zhì)及骨代謝平衡，其非傳統(tǒng)生物學(xué)效應(yīng)近年來(lái)也受到廣泛的重視。1,25-(OH)2D3是維生素D的活性形式,大多數(shù)維生素D的生物學(xué)效應(yīng)都是通過(guò)1,25-(OH)2D3與維生素D受體(VDR)結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)下位基因的作用實(shí)現(xiàn)的。隨著VDR在不同組織表達(dá)的發(fā)現(xiàn)，其相應(yīng)的生理功能被揭示,活性維生素D及其類似物的作用也得到證實(shí)，在腎臟疾病、心血管疾病、免疫炎性反應(yīng)、腫瘤等方面都有一定作用,其抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用近來(lái)更是受到了廣泛的關(guān)注[1-5]?；钚跃S生素D及其類似物作用于抗原提呈細(xì)胞(APCs)及T淋巴細(xì)胞參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)，其可調(diào)控多種免疫、防御細(xì)胞的功能，包括巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等[6]。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，活性維生素D及其類似物可以延長(zhǎng)腎臟、肝臟、胰腺等存活時(shí)間，降低慢性腎臟病患者尿蛋白[7]、減少足細(xì)胞損傷和丟失[8],增加糖尿病腎病小鼠超氧化物歧化酶活性，抑制腎素受體、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-βl、單核細(xì)胞趨化蛋白l的活性，恢復(fù)nephrin的表達(dá)[9]?；钚跃S生素D及其類似物的缺乏與慢性炎癥及糖尿病腎病的發(fā)生及發(fā)展相關(guān)[10-12]。目前針對(duì)活性維生素D及其類似物對(duì)腎臟作用的研究多為對(duì)慢性損傷腎臟的保護(hù)作用，而活性維生素D及其類似物對(duì)急性炎癥反應(yīng)所致腎臟損傷影響的研究較少。本研究采用活性維生素D類似物干預(yù)內(nèi)毒素感染小鼠模型，以探究活性維生素D類似物對(duì)內(nèi)毒素感染小鼠腎臟細(xì)胞因子的影響，從而進(jìn)一步研究活性維生素D及其類似物對(duì)腎臟應(yīng)激損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理方法 C57 BL/6源性野生小鼠20只，2月齡，體重20～25 g，性別不限，室溫飼養(yǎng)，飼料為普通動(dòng)物飼料，自由飲水進(jìn)食。隨機(jī)分4組，每組5只。正常對(duì)照組(CON組)：腹腔注射60%丙二醇注射液2周，隔日1次，每次200 μL/只。帕立骨化醇組(P組):400 ng/kg帕立骨化醇溶解在60%丙二醇注射液中,每次200 μL/只，腹腔注射2周，隔日1次。脂多糖組(LPS組)：腹腔注射60%丙二醇注射液，隔日1次，每次200 μL/只，2周后予LPS以15 mg/kg腹腔注射,18 h后處死。帕立骨化醇+脂多糖組(P+LPS組)：400 ng/kg帕立骨化醇溶解在60%丙二醇注射液中，每次200 μL/只，腹腔注射，隔日1次，喂養(yǎng)2周后予LPS以15 mg/kg腹腔注射，18 h后處死。

1.2 組織學(xué)處理 脫頸處死各組小鼠，立即冰上取新鮮腎臟組織，應(yīng)用OCT復(fù)合物包埋，-80 ℃冰箱冷凍、切片，蘇木精伊紅(HE)染色,200倍顯微鏡下觀察腎臟組織病變情況。

1.3 各組小鼠血清肌酐測(cè)定 經(jīng)右心室取血，離心后取上清，應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)各組小鼠血清肌酐含量，采用ABCAM公司試劑盒，貨號(hào)Creatinine Assay(ab30719)，依照說(shuō)明操作。

1.4 各組小鼠腎臟組織細(xì)胞因子測(cè)定 實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定小鼠腎臟組織中細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平：提取小鼠腎組織，按照試劑說(shuō)明書用TRizol法提取總RNA，用美國(guó)Invitrogen公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用Primer 3.0設(shè)計(jì)合成特異性引物(如表1)。

表1 細(xì)胞因子引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般狀態(tài)比較 CON組及P組小鼠一般狀態(tài)良好，活動(dòng)情況、進(jìn)食(水)量、尿量、體溫等指標(biāo)無(wú)明顯差異。注射LPS 3 h后，LPS組5只小鼠均逐漸出現(xiàn)皮膚潮濕，倦怠，活動(dòng)能力下降，進(jìn)食及進(jìn)水量進(jìn)行性下降，排便明顯增多，呼吸深大。注射LPS 4 h后，P+LPS組3只小鼠逐漸出現(xiàn)皮膚潮濕，倦怠，活動(dòng)能力下降，進(jìn)食及進(jìn)水量進(jìn)行性下降，腹瀉明顯，呼吸深大，但較LPS組減輕，且其中2只小鼠一般狀態(tài)良好，活動(dòng)情況、進(jìn)食(水)量、尿量、體溫等指標(biāo)較CON組無(wú)明顯差異。

2.2 各組小鼠腎臟形態(tài)學(xué)及組織學(xué)比較 四組小鼠腎臟大小正常，顏色紅潤(rùn)，無(wú)腫脹、出血，光鏡下可見(jiàn)腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常，無(wú)變性壞死，細(xì)胞形態(tài)比較無(wú)明顯差異。

2.3 各組小鼠腎臟功能的比較 經(jīng)右心室取血，離心后取上清，應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)各組小鼠血清肌酐含量。各組小鼠肌酐值比較，P+LPS組較LPS組小鼠血清肌酐值略下降，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖1)。

2.4 各組小鼠細(xì)胞因子水平的變化 用實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定各組小鼠腎臟組織中細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平。P+LPS組IL-1β、TNF-α、

ICAM、INF-γ表達(dá)均低于LPS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；P+LPS組TGFβ-1、MMP3、IL-10較LPS組略有降低，IL-1Ra、IL-6表達(dá)較LPS組略有增加，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果提示，活性維生素D類似物降低腎臟組織中IL-1β、TNF-α、ICAM、INF-γ等炎性細(xì)胞因子在急性感染時(shí)對(duì)腎臟的損傷(見(jiàn)圖2)。

圖1 各組小鼠肌酐值比較

圖2 各組小鼠細(xì)胞因子水平的變化

3 討論

帕立骨化醇是一種活性維生素D類似物，通過(guò)結(jié)合VDR而發(fā)揮相應(yīng)的生理效應(yīng)，同時(shí)具有對(duì)血鈣影響較小的優(yōu)點(diǎn)[13]。感染所致的膿毒癥是引起急性腎損害的常見(jiàn)原因，LPS是G-菌膿毒血癥致病過(guò)程中最重要的介質(zhì)。LPS與細(xì)胞膜上的清道夫受體結(jié)合可激活巨噬細(xì)胞內(nèi)的多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、蛋白激酶c(PKC)通路、核因子(NF)-κB通路等，當(dāng)巨噬細(xì)胞與LPS接觸40～60 min后即分泌大量炎癥介質(zhì)[14]。炎癥介質(zhì)大量釋放及繼之的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成微循環(huán)障礙、組織細(xì)胞缺氧，全身炎癥反應(yīng)失控，最終造成多器官功能衰竭，目前已知多種細(xì)胞因子參與了內(nèi)毒素血癥所引發(fā)的多臟器功能衰竭。

本實(shí)驗(yàn)研究中，C57 BL/6源性的野生小鼠注射LPS 18 h后小鼠無(wú)死亡，進(jìn)行小鼠腎臟形態(tài)學(xué)及組織學(xué)觀察及血清肌酐測(cè)定，各組未見(jiàn)明顯差異。既往研究中曾發(fā)現(xiàn)，在LPS行腹腔注射18 h后，小鼠的肝臟中巨噬細(xì)胞特異性抗體染色的巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增多[15]，LPS注射12 h后，小鼠后腸道黏膜損傷程度評(píng)分明顯增高[16]，肺上皮細(xì)胞屏障完整性明顯受損[6]。本研究中，LPS組小鼠注射內(nèi)毒素3 h后，5只小鼠均逐漸出現(xiàn)異常表現(xiàn)，以倦怠、排便明顯增加及呼吸深大為主，尿量無(wú)明顯變化，從小鼠的一般狀態(tài)分析，考慮此時(shí)內(nèi)毒素血癥主要影響小鼠肝臟、腸道及呼吸系統(tǒng)，對(duì)腎臟的損傷無(wú)論從組織形態(tài)學(xué)還是腎臟功能肌酐的測(cè)定中均未出現(xiàn)明顯異常。LPS趨化作用來(lái)自于血液循環(huán)中的單核細(xì)胞，LPS腹腔注射后，經(jīng)腸系膜、大小網(wǎng)膜吸收入血，進(jìn)入腸系膜靜脈到達(dá)肝臟,首先對(duì)腸道及肝細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用[15]?？紤]本研究中小鼠出現(xiàn)異常表現(xiàn)的原因多為腸道、肝臟及肺損傷所致，對(duì)腎臟為早期損傷，在腎臟形態(tài)學(xué)上并未明顯變化，對(duì)細(xì)胞因子的影響較為明顯。

本研究為內(nèi)毒素所致腎臟損傷的早期，活性維生素D類似物對(duì)細(xì)胞因子的影響更具有指導(dǎo)意義。IL-1的活性形式有IL-1α、IL-1β、IL-1γ 3種，IL-1β是其在血液和組織液中的主要形式，不僅能夠協(xié)同其他細(xì)胞因子促進(jìn)T、B細(xì)胞活化，而且能夠誘導(dǎo)其他炎癥性介質(zhì)的產(chǎn)生，加強(qiáng)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6的產(chǎn)生[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，活性維生素D類似物可以抑制內(nèi)毒素血癥早期腎臟組織中IL-1β的升高，抑制炎癥反應(yīng)對(duì)腎臟的損傷。血管內(nèi)皮細(xì)胞是內(nèi)毒素作用早期的主要靶細(xì)胞，內(nèi)毒素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷與激活和重度感染后機(jī)體免疫功能紊亂與多器官功能衰竭密切相關(guān)[18]。ICAM-1在增生的血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)最強(qiáng)，ICAM-1促進(jìn)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附可能是誘導(dǎo)血管生成，因此，ICAM在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，活性維生素D類似物可以降低內(nèi)毒素血癥早期腎臟組織中ICAM-1的分泌，使后續(xù)腎缺血再灌注損傷減輕。TNF是細(xì)胞因子系統(tǒng)的關(guān)鍵部分，當(dāng)細(xì)菌或毒素進(jìn)入機(jī)體后，TNF-α在循環(huán)中較早出現(xiàn)并迅速達(dá)到高峰，可以直接損傷組織細(xì)胞，還可以激活中性粒細(xì)胞，使后者進(jìn)一步釋放各種炎癥因子，引起進(jìn)一步損傷，也可以介導(dǎo)IL-1，使損傷進(jìn)一步加重[19]。既往研究發(fā)現(xiàn)，活性維生素D可通過(guò)抑制慢性腎臟損傷中TNF-α的表達(dá)，減輕炎性浸潤(rùn)，減少蛋白尿，進(jìn)而緩解腎損傷[20]。輔助性T淋巴細(xì)胞在細(xì)胞免疫中起主要的作用。IFN-γ是Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子中的代表性因子，能夠促進(jìn)原始T細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，并增強(qiáng)Th1細(xì)胞的活性，同時(shí)能有效抑制原始T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化增殖，也可上調(diào)單核巨噬細(xì)胞的殺菌作用。IFN-γ還是激活并調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞分化的重要細(xì)胞因子之一。Th1和Th2細(xì)胞是決定細(xì)胞免疫類型的主要因素，Th1細(xì)胞選擇性激活引起細(xì)胞免疫，而Th2細(xì)胞選擇性激活體液免疫。IFN-γ抑制Th2細(xì)胞，進(jìn)一步抑制體液免疫，而使免疫應(yīng)答向細(xì)胞免疫應(yīng)答的方向進(jìn)行。急性感染期，Th1細(xì)胞處于激活狀態(tài)，IFN-γ明顯增高[21-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，P+LPS組IFN-γ較LPS組下降明顯，考慮內(nèi)毒素所致的腎臟損傷在腎臟組織學(xué)及腎臟功能尚未發(fā)生異常的早期階段，活性維生素D類似物抑制誘導(dǎo)后續(xù)炎癥及免疫反應(yīng)細(xì)胞因子，對(duì)腎臟起到保護(hù)作用。

IL-6是單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，在正常情況下可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，在炎癥反應(yīng)和抗感染防御中起重要作用，而在病理狀態(tài)下，其過(guò)度升高可造成機(jī)體的病理性損傷。IL-6可刺激腎小球系膜細(xì)胞的活化和增生，分泌大量的細(xì)胞因子，如IL-1、TGF-I、IL-6等，導(dǎo)致腎小球硬化。IL-6亦可活化B細(xì)胞，產(chǎn)生大量的IgE和IgA，形成循環(huán)免疫復(fù)合物，沉積于腎小球系膜區(qū)，引起局部炎癥反應(yīng)。既往研究中證明，活性維生素D可降低糖尿病腎病小鼠腎臟組織中的IL-6，抑制糖尿病腎病腎組織炎癥狀態(tài)，減少蛋白尿，進(jìn)而保護(hù)腎臟。本研究表明，應(yīng)用活性維生素D小鼠腎臟組織中IL-6較LPS組增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為急性炎癥反應(yīng)時(shí)活性維生素D對(duì)腎臟的保護(hù)作用，糖尿病腎病小鼠的炎癥狀態(tài)為慢性炎性過(guò)程，而且IL-6濃度不同對(duì)組織器官的作用也存在差異。有研究提示，低濃度的IL-6預(yù)先提示炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織復(fù)蘇;而較高濃度的IL-6可導(dǎo)致組織出現(xiàn)瀑布鏈?zhǔn)窖装Y損傷反應(yīng)[24]。IL-10通過(guò)抑制Th1細(xì)胞的增殖和IL-2、IFN等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而抑制Th1免疫應(yīng)答，降低患者的細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)Treg的增殖和活化，從而有利于誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)外來(lái)病原的耐受。IL-1Ra是主要由單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種IL-1的內(nèi)源抑制劑，可與Ⅰ型和Ⅱ型IL-1R結(jié)合，但不啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其結(jié)合IL-1受體，與IL-1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，在阻礙IL-1促炎效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。IL-10、IL-1Ra為體內(nèi)重要的抗炎性細(xì)胞因子，在應(yīng)用活性維生素D類似物后，在腎臟表達(dá)出現(xiàn)增加趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮可能與本實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)較小有關(guān)，因此，后續(xù)研究中應(yīng)進(jìn)一步關(guān)注活性維生素D對(duì)抗炎性細(xì)胞因子的影響。

綜上所述，活性維生素D類似物能顯著減少內(nèi)毒素感染小鼠腎組織中IL-1β、ICAM、TNF-α、INF-γ的含量，減輕炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)的腎臟損傷，保護(hù)腎臟功能，本研究進(jìn)一步證明了維生素D受體及其信號(hào)系統(tǒng)在感染早期對(duì)腎臟的保護(hù)作用。

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Effects of active vitamin D analogues on cytokines in kidney of mice with endotoxin infection

XU Ying-xi,ZHAO Qing,SUN Can,CHE Qian-hong,FU Yu,DING Ding,KONG Juan*

(Department of Clinical Nutrition，Shengjing Hospital of China Medical University，Shenyang 110004，China)

Objective To study the protective effect of active vitamin D analogue on cytokines in kidney of mice with endotoxin infection.Methods Twenty C57 BL/6 mice were randomly divided into four groups:normal control group (CON group),paricalcitol group (P group),lipopolysaccharide group (LPS group),and paricalcitol+lipopolysaccharide group (P+LPS group).The general status was compared,the levels of serum creatinine in the kidneys were measured by ELISA kit,and the levels of cytokines in the kidneys were determined by real-time PCR methods in the four groups.Results The general state of P+LPS group was better than that of LPS group.There was no significant difference in renal morphology and serum creatinine level between the two groups.The expression of IL-1β,ICAM,TNF-α and INF-γ in renal tissue of P+LPS group was significantly lower than that of LPS group (P<0.05).Conclusion Active vitamin D analogues can significantly reduce the levels of IL-1β,ICAM,TNF-α and INF-γ in renal tissue of mice induced by LPS,reduce inflammatory cytokine-mediated kidney damage,and protect the kidney function.

Active vitamin D analogues;LPS;Cytokines

2016-10-17

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)科，沈陽(yáng) 110004

國(guó)家自然科學(xué)基金(81570811)；遼寧省攀登學(xué)者計(jì)劃；遼寧省十百千計(jì)劃

10.14053/j.cnki.ppcr.201703002

*通信作者