禽源性大腸桿菌HPI毒力島irp2基因PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

王艷萍，董林，郭時金，2，徐倩倩，莫玲，王金良，劉吉山，沈志強，2

(1．山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600;2．山東省濱州畜禽蜂膠疫苗研究開發(fā)推廣中心，山東濱州256600; 3．山東綠都安特動物藥業(yè)有限公司，山東濱州256600)

禽源性大腸桿菌HPI毒力島irp2基因PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

王艷萍1，2，3，董林1，郭時金1，2，徐倩倩1，2，3，莫玲1，王金良1，劉吉山1，沈志強1，2

(1．山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600;2．山東省濱州畜禽蜂膠疫苗研究開發(fā)推廣中心，山東濱州256600; 3．山東綠都安特動物藥業(yè)有限公司，山東濱州256600)

為了解臨床禽源致病性大腸桿菌中高致病性毒力島(Highpathogenicity island HPI)流行情況和基因特征，根據(jù)GenBank已知禽源irp2基因序列，設(shè)計、合成一對特異性引物，建立irp2基因PCR檢測方法，優(yōu)化、確定PCR擴增特性，進行敏感性、特異性、重復(fù)性檢測評價。對256份臨床分離禽源大腸桿菌進行irp2基因PCR檢測和基因遺傳變異分析。結(jié)果顯示，建立的PCR檢測方法敏感性可達2．14×10－4ng/μL;特異性顯示與雞沙門菌、副雞嗜血桿菌、鴨疫里默菌、禽巴氏桿菌、雞毒支原體、雞新城疫病毒、禽流感病毒(H9N5)核酸均無交叉反應(yīng);重復(fù)性顯示3份陽性樣品重復(fù)5次檢測，變異系數(shù)3．4%～5．0%。256份臨床樣品PCR檢測irp2基因，陽性率30．6%。獲得了9株分離株irp2基因序列，分析顯示，與Gen-Bank已知基因同源性高達96．2%以上。說明建立的禽源大腸桿菌HPI毒力島irp2基因PCR檢測方法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性，可應(yīng)用于臨床致病性大腸桿菌毒力島基因快速檢測。

禽源大腸桿菌;HPI;毒力島;irp2基因

近年來畜禽大腸桿菌病嚴重影響著中國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，雖然采取了強有力的防治措施，但由于大腸桿菌的變異性及耐藥性日益增強，依然沒有找到有效控制大腸桿菌病方法，于是專家們將焦點集中到了針對大腸桿菌的分子生物學(xué)研究上，期望通過對微觀的研究發(fā)現(xiàn)一些解決問題的線索，其中大腸桿菌高致病性毒力島(HPI)就是目前研究的重點之一。

1 試驗材料

1．1 菌株來源試驗菌株:265株禽源大腸桿菌，分離自山東、江蘇、河南、安徽、河北、遼寧等地;大腸桿菌O2標(biāo)準(zhǔn)株由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)教研室饋贈。

1．2 試劑與主要儀器pMD18－T、DL-2 000 DNA Marker、DL-15 000 Marker、Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、dNTP、蛋白酶K、瓊脂糖等，購自寶生物工程(大連)有限公司;營養(yǎng)瓊脂，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;LP0021、LP0042，購自O(shè)XOID LTD;細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、多功能DNA純化回收試劑盒(離心柱型)，均購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

2 試驗方法

2．1 引物設(shè)計與合成根據(jù)GenBank中已發(fā)表的禽源大腸桿菌高致病性毒力島irp2基因序列，選取強保守性區(qū)段，設(shè)計如下特異性引物，用于irp2特異性序列PCR擴增，理論跨度約為521nt。引物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行合成。

表1 irp2引物設(shè)計

2．2 irp2基因PCR檢測方法建立

2．2．1 大腸桿菌O2菌株基因組DNA制備挑取單個菌落，接種LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)10 h后，10 000r/min離心2 min收集菌體，提取細菌基因組DNA，具體操作按北京百泰克生物技術(shù)有限公司細

菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行。

2．2．2 PCR擴增程序以制備的大腸桿菌O2DNA為模板，以PF－irp2、PR－irp2為引物進行PCR擴增，PCR體系:10×PCR Buffer 2．5 μL，dNTP 2．0 μL，PF－irp2/PR－irp2 1．0 μL，DNA模板4．0 μL，ddH2O 14．0 μL，rTaq 0．5 μL，總體系25．0 μL，確定最佳PCR程序。

2．3 PCR檢測方法性能評價

2．3．1 敏感性檢測將制備的大腸桿菌O2模板DNA進行10倍比系列稀釋，測定各組份核酸含量，以不同稀釋度DNA為模板進行irp2基因PCR擴增，檢測其敏感性。

2．3．2 特異性檢測分別提取雞沙門氏菌、副雞嗜血桿菌、鴨疫里默菌、禽巴士桿菌、雞毒支原體、雞新城疫病毒、禽流感病毒(H9N5)和禽源致病性大腸桿菌基因組DNA(其中新城疫和流感病毒提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA)。以制備的各類DNA為模板，進行irp2基因檢測，評價建立的檢測方法特異性。

2．3．3 重復(fù)性檢測用3株已知irp2陽性禽源致病性大腸桿菌，2株已知irp2陰性禽源大腸桿菌，提取細菌基因組，每一樣品進行5次PCR檢測，檢測建立的檢測方法重復(fù)性。

2．4 禽源大腸桿菌毒力島irp2基因檢測應(yīng)用建立的PCR方法對265例2014－2015年間來自遼寧、山東、江蘇、河南、安徽、河北等地臨床分離的禽源性大腸桿菌進行irp2毒力島基因檢測。檢測病例病理剖檢多表現(xiàn)為大腸桿菌病特征性病變，大腸桿菌性敗血癥表現(xiàn)為纖維素性心包炎，肝臟有白色被膜、有纖維素性附著物，有時有白色壞死性結(jié)節(jié)，脾臟腫脹、充血;卵黃性腹膜炎及輸卵管炎、出血性腸炎，幼雛表現(xiàn)為臍帶炎等，個別產(chǎn)蛋雞癥狀不明顯等等。

2．5 irp2毒力島基因遺傳特性分析回收PCR檢測陽性樣品DNA，連接pMD18－T，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR和酶切鑒定后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。用Clustalx8．3、MEGA5．10軟件進行基因同源性及遺傳變異分析。

3 結(jié)果

3．1 irp2基因PCR擴增結(jié)果確定的PCR條件為:95℃4 min，94℃1 min，55℃40 s，72℃45 s，30個循環(huán)，72℃10 min，4℃終止。大腸桿菌O2標(biāo)準(zhǔn)株DNA為模板經(jīng)PCR擴增后，產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，可看見大約521 bp的特異性目的條帶(圖l)，與預(yù)期結(jié)果相符。回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)DNA序列測定分析，與已知的禽類大腸桿菌毒力基因irp2同源性在98．2%以上，說明建立的irp2基因PCR檢測方法可特異性擴增目的irp2基因。

3．2 敏感性檢測提取大腸桿菌O2DNA經(jīng)10倍比稀釋后取2．14×101ng/μL、2．14×100ng/μL、2．14×10－1ng/μL、2．14×10－2ng/μL、2．14×10－3ng/μL、2．14×10－4ng/μL、2．14×10－5ng/μL濃度DNA為模板進行PCR敏感性檢測，結(jié)果顯示，在2．14×10－4ng/μL濃度以上檢測目的條帶清晰可見，2．14×10－5ng/μL濃度時檢測條帶出現(xiàn)模糊(圖2)，確定建立的PCR檢測方法最高檢測敏感性為2．14×10－4ng/μL。

圖1 irp2基因PCR擴增結(jié)果1～3:腸桿菌O2標(biāo)準(zhǔn)株;4:性對照; M:DNA Markers DL－2000

圖2 PCR敏感性檢測結(jié)果M:DNA Markers DL-2 000;1～8:2．14×102、2．14×1012．14×100、2．14×10－1、2．14×10－2、2．14×10－3、2．14×10－4、2．14×10－5ng/μL;9:陰性對照

3．3 特異性檢測特異性檢測結(jié)果顯示，僅以禽致病性大腸桿菌基因組為模板的PCR擴增呈陽性，在約521bp有特異性目的條帶，而以雞沙門氏菌、副雞嗜血桿菌、鴨疫里默菌、禽巴氏桿菌、雞毒支原體、雞新城疫病毒、禽流感病毒(H9N5)核酸為模板，PCR擴增均無特異性條帶出現(xiàn)，說明建立的檢測方法特異性良好(圖3)。

圖3 PCR特異性檢測結(jié)果M:DNA Markers DL-2 000;1:沙門氏菌;2:副雞嗜血桿菌; 3:鴨疫里默菌:4:禽巴氏桿菌;5:雞毒支原體;6:雞新城疫病毒; 7:禽流感病毒(H9N5);8:陰性對照;9:禽致病性大腸桿菌

3．4 重復(fù)性檢測3份陽性樣品、2份陰性樣品分別重復(fù)5次檢測，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，3份陽性樣品檢測結(jié)果見圖4，薄層灰度分析顯示，陽性樣品變異系數(shù)在3．4%～5．0%，陰性樣品5次重復(fù)均為陰性結(jié)果，說明建立的PCR檢測方法重復(fù)性良好。

圖4 重復(fù)性試驗結(jié)果M:DNA Markers DL-2 000;1－5:陽性樣品1; 6～10:陽性樣品2;11～15:陽性樣品3;16:陰性對照

3．5 臨床樣品檢測應(yīng)用應(yīng)用建立的PCR方法檢測了臨床病例，結(jié)果irp2陽性數(shù)81份，陽性率為30．6%，不同地域、不同宿主來源對毒力島基因無明顯區(qū)別。irp2陽性樣品PCR產(chǎn)物，電泳檢測均出現(xiàn)約521 bp特異性目的條帶(圖5)，說明建立的檢測方法具有良好的臨床實用性。

圖5 部分臨床樣品檢測結(jié)果1－12:陽性樣品結(jié)果;13:陰性結(jié)果;14:陽性對照;15:陰性對照;M:DNA Markers DL-2 000

3．6 同源性分析獲得了9株禽致病性大腸桿菌毒力島irp2基因序列，經(jīng)Clustalx8．3、MEGA5．10軟件進行基因同源性，結(jié)果顯示，其與GenBank中已知基因同源性高達96．2%以上，顯示其在遺傳進化保守性較強。遺傳進化分析，顯示不同分離株irp2基因存在差異性，分屬不同基因分支，同源性高的毒株間存在相似基因序列特征變異(圖6)。

4討論

隨著養(yǎng)殖方式和規(guī)模不斷變化，細菌性疾病，特別是由大腸桿菌病導(dǎo)致的損失，在禽類養(yǎng)殖中愈顯重要，同時，由于抗生素在養(yǎng)殖中濫用致臨床大腸桿菌變異性和耐藥性日益增強，使得現(xiàn)有防控手段和技術(shù)不能有效應(yīng)對威脅。因此，開展大腸桿菌相關(guān)毒力因子研究，從微觀分子水平探索其致病機開展大腸桿菌相關(guān)毒力因子研究，從微觀分子水平探索其致病機理對臨床大腸桿菌病的預(yù)防和治療具有一定現(xiàn)實意義。大腸桿菌高致病性毒力島(HPI)作為重要致病因子，在E．coli致病過程中發(fā)揮作用。irp2作為鐵調(diào)節(jié)蛋白，是檢測毒力島的標(biāo)志基因。

圖6 irp2基因遺傳進化分析結(jié)果irp2－3/4/6/8/9/12/14/20/21標(biāo)號為自己分離株irp2基因序列;其他標(biāo)號為GenBank中已知序列

本試驗針對毒力島標(biāo)志毒力因子irp2在禽致病性大腸桿菌中的基因分布特征和遺傳變異進行相關(guān)研究。建立了快速、特異、靈敏和可重復(fù)的irp2基因PCR檢測方法，對265份臨床禽源致病性大腸桿菌進行irp2進行檢測，陽性率30．6%(81/265)，這與Schubert［11］(27%)結(jié)果一致，高于張冬梅［12］(14%)和陳偉［13］(21．6%)，低于許麗［14］的(44%)和王鑫［15］的(47．8%)。這可能與臨床樣品選取及流行毒株區(qū)域差異性有一定相關(guān)性。獲得了9株禽致病性大腸桿菌HPI irp2基因序列，與GenBank中參考毒株基因同源性高達96．2%以上，顯示irp2基因在不同毒株間具有很高的保守性，這與董炳敏(97%)和程伯鯤(95．5%)等報道的同源性結(jié)果一致，irp2等毒力島基因高度保守性可能與其在不同宿主菌株間的水平轉(zhuǎn)移有關(guān)，具體原因有待進一步研究。

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Establishment and application of PCR detection method for HPI irp2 gene of avian Escherichia coli

WANG Yan-ping1，2，3，DONG Lin1，GUO Shi-jin1，2，XU Qian-qian1，2，3，MO Ling1，WANG Jin-liang1，LIU Ji-shan，SHEN Zhi-qiang1
(1．BinZhou animal Science and Veterinary Medicine institude，Binzhou 256600，China;2．Shandong Binzhou Research，development and promotion center for Livestock and poultry propolis vaccine，Binzhou 256600，China;3．Shandong lvduante Animal Medicine Co．，Ltd，Binzhou 256600，China)

The purpose of this paper is to establish the PCR detection method of irp2．To understand the clinical poultry pathogenic escherichia coli High pathogenicity island(HPI)prevalence and genetic traits，a pair of specific primers were designed and synthesised according to gene sequence of irp2 and the PCR detection method was established，evaluation about optimization，determining the PCR amplification characteristics，sensitivity，specificityor and repeatability were studied．Irp2 gene was detected and genetic variation was analyed on 256 E．coli strains isolated from clinical avian．Results showed that the sensitivity was 2．14×10－4ng/ μL;Specificity displayed that there was no cross reaction between salmonella，vice chicken haemophilus，Riemerella anatipestifer，poultry pasteurella，Mycoplasma gallisepticum，Newcastle disease virus，and avian influenza virus(H9N5);Repetitive showed that the variation coefficient was 3．4～5．0%if three positive samples repeated 5 times testing．Irp2 gene was detected by PCR from 256 clinical samples，and positive rate was 30．6%．The analysis of 9 strain irp2 gene sequences revealed that the homology was more than 96．2%when compared with Genbank known gene．The method of E．coli HPI irp2 gene PCR detection has a good specificity，sensitivity and repeatability，and it can be applied to clinical gene rapid detection of HPI．

Avian Escherichia coli;HPI pathogenicity island;irp2 gene

SHEN Zhi－qiang

A

0529-6005(2017)01-0086-04

2015－11－26

山東省自然科學(xué)基金資助項目(ZR2014CQ012)

王艷萍(1979－)女，助理研究員，碩士，從事中獸藥和畜禽細菌性疫病研究，E-mail:xiaowangyanping 213@163．com

沈志強，E-mail:1292986799@qq．com