雞源HPI+大腸桿菌的鑒定及黃連連翹對(duì)其的聯(lián)合抑制作用研究

王艷萍，董林，郭時(shí)金，3，徐倩倩，苗立中，李風(fēng)葉，莫玲，謝金文，沈志強(qiáng)

(1．山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600;2．山東省濱州畜禽蜂膠疫苗研究開發(fā)推廣中心，山東濱州256600; 3．山東綠都安特動(dòng)物藥業(yè)有限公司，山東濱州256600;4．山東省濱州市畜牧獸醫(yī)局，山東濱州256600)

雞源HPI+大腸桿菌的鑒定及黃連連翹對(duì)其的聯(lián)合抑制作用研究

王艷萍1，2，3，董林1，郭時(shí)金1，3，徐倩倩1，2，3，苗立中1，李風(fēng)葉4，莫玲1，謝金文1，沈志強(qiáng)1

(1．山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600;2．山東省濱州畜禽蜂膠疫苗研究開發(fā)推廣中心，山東濱州256600; 3．山東綠都安特動(dòng)物藥業(yè)有限公司，山東濱州256600;4．山東省濱州市畜牧獸醫(yī)局，山東濱州256600)

為了研究黃連和連翹對(duì)HPI+大腸桿菌的聯(lián)合抑菌作用，采用PCR方法對(duì)已知血清型的9株雞源大腸桿菌進(jìn)行了HPI毒力島攜帶情況檢測(cè)，檢測(cè)出7株HPI陽(yáng)性，2株陰性;采用微量稀釋法和微量棋盤法對(duì)這7株HPI+大腸桿菌進(jìn)行了黃連、連翹的提取物單獨(dú)與聯(lián)合抑菌試驗(yàn)。結(jié)果表明，黃連、連翹單用時(shí)，對(duì)HPI+大腸桿菌的MIC分別為125.0 mg/mL和714 mg/mL，當(dāng)兩者聯(lián)合使用時(shí)，黃連、連翹的MIC分別為125.0 mg/mL和89.25 mg/mL，聯(lián)合抑菌指數(shù)FIC=1.125，表現(xiàn)出了無(wú)關(guān)作用。提示，黃連、連翹提取物不適合作為藥物對(duì)其進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

黃連;連翹;聯(lián)合抑菌;HPI+大腸桿菌

隨著畜牧業(yè)和動(dòng)物醫(yī)療事業(yè)的發(fā)展，社會(huì)各界對(duì)嚴(yán)格使用抗生素的呼聲越來(lái)越高。毒力島最早發(fā)現(xiàn)于耶爾森菌屬，因與該屬菌的小鼠致死表型密切相關(guān)，故被命名為耶爾森菌強(qiáng)毒力島(HPI)［1－3］，與致病性大腸桿菌的毒力進(jìn)化密切相關(guān)，可水平傳播［4－6］。特選取中藥黃連和連翹對(duì)HPI+大腸桿菌的聯(lián)合抑菌作用來(lái)篩選高效抗菌中藥。

1 材料與方法

1．1 藥材黃連、連翹，購(gòu)自安國(guó)伊康藥業(yè)有限公司;DNA Marker DL-2 000，由寶生物工程(大連)有限公司提供;0．5麥?zhǔn)媳葷峁?、MH瓊脂、MH肉湯，均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1．2 菌株大腸桿菌O2標(biāo)準(zhǔn)株由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)饋贈(zèng)，臨床分離的大腸桿菌血清型分別為O2、O112、O91、O11、O46、臨床分離20號(hào)菌、O109和O45。由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院分離鑒定。

1．3 儀器RE－52AAA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海嘉鵬科技有限公司;SH－B 95A型循環(huán)水式多用真空泵，上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司;ST16R離心機(jī)，美國(guó)ThermoFisher ST 16R;臺(tái)式小型離心機(jī)，Sigma; PCR儀，TAKARA TP100。

1．4 試驗(yàn)方法

1．4．1 黃連、連翹的提取及濃縮稱取30 g黃連，粉碎，后加入10倍、8倍、8倍水，煎煮提取3次，每次2 h，3 000 r/min離心10 min，－0．08 Mpa濃縮。稱取25 g連翹，粉碎，加入10倍、8倍40%乙醇，超聲提取2次，每次2 h，3 000 r/min離心10 min，－0．08 Mpa濃縮。

1．4．2 HPI+菌株的鑒定大腸桿菌基因組DNA制備:分別挑取瓊脂平板上的O2標(biāo)準(zhǔn)株、O2、O112、O109、O45、O91、O11、O46和臨床分離20號(hào)菌單個(gè)菌落，接種LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)10 h后，10 000 r/min離心2 min收集菌體，提取細(xì)菌基因組DNA，具體操作按百泰克生物技術(shù)(北京)有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)步驟進(jìn)行。

引物設(shè)計(jì)與合成:根據(jù)GenBank中已發(fā)表的禽源大腸桿菌高致病性毒力島irp2基因序列，選取強(qiáng)保守性區(qū)段，設(shè)計(jì)如下特異性引物，用于irp2特異性序列PCR擴(kuò)增，理論跨度約為521 bp。引物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行合成。

表1 irp 2引物設(shè)計(jì)

PCR擴(kuò)增程序:以制備的大腸桿菌DNA為模板，以設(shè)計(jì)的PF－fyuA、PR－fyuA為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，組合優(yōu)化PCR反應(yīng)體系見表2。

表2 PCR反應(yīng)體系

確定最佳PCR程序:95℃4 min，94℃1 min，55℃40 s，72℃45 s，30個(gè)循環(huán)，72℃10 min，4℃終止。PCR程序結(jié)束，取5．0 μL產(chǎn)物用1．0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察結(jié)果。

1．4．3 制備HPI+大腸桿菌菌液將已經(jīng)純化并鑒定為HPI+的大腸桿菌菌株，挑取平板上的單菌落，接種至肉湯培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)箱中，過夜培養(yǎng)，稀釋至每毫升含細(xì)菌1．5×105CFU。

1．4．4 測(cè)定黃連、連翹最低抑菌濃度以微量稀釋法進(jìn)行:取U形底96孔板，在第1～9孔中每孔加入MH肉湯50 μL，第1孔加入藥物原液50 μL，混合均勻后，依次倍比稀釋至第9孔，自第9孔中吸取50 μL棄去。第10孔加入MH肉湯100 μL作為空白對(duì)照，第11孔加入藥物原液100 μL作為藥物對(duì)照，第12孔為菌液對(duì)照，加入MH肉湯50 μL，第1至9孔和12孔加入以上制備好的菌液，每孔50 μL，加完液后蓋上蓋，振蕩混勻，置入墊有濕潤(rùn)紗布的方形盤內(nèi)，于36℃培養(yǎng)18h～24 h后，觀察結(jié)果。

表3 微量稀釋法藥物加入方法

1．4．5 黃連、連翹聯(lián)合抑菌效果的測(cè)定微量棋盤稀釋法，基本方法同微量稀釋法。用滅菌后的96孔微孔板，在第1～6行沿X軸方向(從左到右)每孔中依次加入:普通肉湯，1/2MIC、1MIC、2MIC、4MIC、8MIC的黃連藥液各25 μL，以同樣的方法在第A～F列沿Y軸方向(從上到下)每孔中依次加入8MIC、4MIC、2MIC、1MIC、1/2MIC的連翹提取物液、普通肉湯各25 μL，將兩藥混合均勻。然后加入制備好的菌液50 μL，使最終抗菌藥物濃度與計(jì)劃稀釋度相同，加液完畢，蓋上蓋，振蕩混勻，放入墊有濕紗布的方盤內(nèi)，36℃培養(yǎng)18 h～24 h，觀察結(jié)果。棋盤稀釋法藥物加入方法按表3，并設(shè)立平行樣。兩種藥物組合后每孔的最終濃度則為原藥物濃度的1/4。

1．4．6 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)將U型底96孔聚乙烯微孔板放置于黑色背景下觀察，孔底如有圓點(diǎn)樣的渾濁沉淀物表明有細(xì)菌生長(zhǎng)，孔內(nèi)液體如不顯渾濁表明細(xì)菌被抑制生長(zhǎng)。細(xì)菌的生長(zhǎng)完全被抑制的抗菌藥物最低的稀釋度即為該藥物的MIC值。

2 結(jié)果

2．1 黃連、連翹提取結(jié)果將黃連提取液濃縮至30 mL，濃度為1．0 g/mL，連翹濃縮至35 mL，0．71 g/mL。

2．2 HPI+大腸桿菌篩選結(jié)果共篩選出6株irp2陽(yáng)性菌株，分別為臨床分離株大腸桿菌O2、O112、O91、O11、O46、臨床分離20號(hào)菌和大腸桿菌O2標(biāo)準(zhǔn)菌株，O109和O45未檢出irp2基因。結(jié)果如圖1所示。

圖1 HPI檢測(cè)PCR電泳結(jié)果

2．3 最小抑菌濃度(MIC)

2．3．1 單藥的最小抑菌濃度結(jié)果顯示，黃連單用時(shí)的對(duì)10株細(xì)菌的最小抑菌濃度均為62．5 mg/mL，連翹單獨(dú)使用時(shí)的最小抑菌濃度均為714 mg/mL，可見，相同條件下，黃連的抑菌作用強(qiáng)于連翹。

2．3．2 黃連提取物與連翹提取物的聯(lián)合抑菌濃度兩藥聯(lián)合使用時(shí)，黃連提取物的MIC為62．5 mg/mL;連翹提取物的MIC為89．25 mg/mL;可見，兩藥聯(lián)用后，黃連的MIC和單用時(shí)相同，連翹的MIC降為原來(lái)的1/8。

黃連和連翹的聯(lián)合抑菌指數(shù)為:FIC指數(shù)=A藥聯(lián)合時(shí)的MIC/A藥單測(cè)時(shí)的MIC+B藥聯(lián)合時(shí)的MIC/B藥單測(cè)時(shí)的MIC=125mg/mL/125mg/mL+ 89．25mg/mL/714mg/mL=1．125，說明連翹和黃連為無(wú)關(guān)作用。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):FIC指數(shù)＜0．5為協(xié)同作用;0．5～1為相加作用;1～2為無(wú)關(guān)作用;＞2為拮抗作用。注:A:連翹，B:黃連。

表4 黃連與連翹提取物對(duì)HPI+大腸桿菌體外聯(lián)合MIC

3 討論

黃連為毛莨科植物，黃連、三角葉黃連或云連的干燥根莖，秋季采挖，除去須根和泥沙，干燥，撞去殘留須根。具有清熱燥濕，瀉火解毒之功效。連翹為木犀科植物連翹的干燥、成熟的果實(shí)，具有清熱解毒、消熱散結(jié)的功效。黃連和連翹對(duì)大腸桿菌均有抑菌效果，2010年李國(guó)旺［7］等采用藥敏紙片法做了黃連和連翹對(duì)雞大腸桿菌的體外抑制試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者對(duì)雞大腸桿菌均有抑制作用，且黃連抗菌活性強(qiáng)于連翹。這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

胡文舉［8］發(fā)現(xiàn)黃連素對(duì)1x105CFU濃度的4株大腸桿菌的MIC分別為0．75、0．5、0．375 mg/mL和1．0 mg/mL;陳志華［9］等做了黃連素對(duì)大腸桿菌O78和臨床分離株的MIC，結(jié)果為384 μg/mL和512 μg/mL。白云娥［10］等在2003年對(duì)以試管倍比稀釋法對(duì)連翹做了體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，連翹水提物對(duì)大腸桿菌的MIC為73．63 mg/mL，與本文的試驗(yàn)結(jié)果稍有差異，這或許與所采取的試驗(yàn)方法有關(guān)。

試驗(yàn)表明，黃連水提物和連翹水提物雖各自對(duì)大腸桿菌有抑制作用，但兩者聯(lián)合卻呈現(xiàn)出不相關(guān)作用，說明兩者在用作抗菌藥物時(shí)不適合配伍使用，這與王婷婷［11］研究的結(jié)果相沖突，這可能與提取方法有關(guān)，本文中的連翹提取方法為超聲，而王婷婷所用方法為對(duì)黃連－連翹藥對(duì)進(jìn)行索氏提取，且提取溶媒均為無(wú)水乙醇，不同的提取方法和提取溶媒提取出不同的藥物成分，這或許是兩者的區(qū)別所在。

從以上結(jié)果可知，黃連、連翹的抑菌作用對(duì)不同血清型的大腸桿菌沒有選擇性，僅從抗菌作用這方面來(lái)說，兩者呈現(xiàn)出無(wú)關(guān)作用，但要從機(jī)體方面來(lái)說兩者是否配伍使用，有待于更深入的研究。

［1］金文杰，鄭志明，王倩倩，等．禽源性大腸桿菌HPI irp2基因序列的擴(kuò)增及比較［J］．揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2005，26(3):5－7．

［2］Carniel E，Guilvout I，Prentice M．Characterization of a large chromosomal/high－pathogenicity island0in biotype1BYersinia entero-colitica［J］．J Bacteriol，1996，178(23):6743－6751．

［3］Mokracka J，Koczura R，Kaznowski A．Yersiniabactinand other siderophores produced by clinical isolates of Enterobacter spp．And Citrobacter spp［J］．FEMS Immunology and Medical Microbiology，2004，40(1):51－55．

［4］Schubert S，Rakin A，F(xiàn)ischer D，et al．Characterization of the integration site ofYersiniahigh－pathogenicity island inEscherichia coli［J］．FEMS Microbiol Lett，1999，179(2):409－414．

［5］Rakin A，Urbitsch P，Heesemann J．Evidence for two evolutionary lineages of highly pathogenicYersiniaspecies［J］．J Bacteriol，1995，177(9):2292－2298．

［6］Rakin A，Schubert S，Guilvout I，et al．Local hopping of IS3 elements into the A+T－rich part of the high－pathoge－nicity island inYersinia enterocolitica1B，O:8［J］．FEMS Microbiol Lett，2000，182(2):225－229．

［7］李國(guó)旺，趙恒章，苗志國(guó)．5種中藥對(duì)雞大腸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)［J］．貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(10):141－143．

［8］胡文舉，宋艷畫，吳伶俐．黃連素和黃芪多糖對(duì)雞源大腸桿菌的體外聯(lián)合抑菌作用［J］．中獸醫(yī)學(xué)雜志，2013(6):8－10．

［9］陳志華，陳曉生，繆小群，等．黃連素與抗菌藥物聯(lián)用對(duì)大腸桿菌體外抗菌活性的影響［J］．中國(guó)獸醫(yī)雜志，2004，40(12): 36－37．

［10］白云娥，漆小梅，楊國(guó)紅，等．連翹提取物的體外抗菌試驗(yàn)［J］．山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，34(6):506－507．

［11］王婷婷．黃連、連翹協(xié)同抑菌配方優(yōu)化及保鮮應(yīng)用研究［D］．泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011．

Identification of E．coli HPI+and Associated Bacteriostasis of Rhizoma Coptidis and Fructus Forsythiae research

WANG Yan-ping1，2，3，DONG Lin1，GUO Shi-jin1，3，XU Qian-qian1，2，3，MIAO Li-zhong1，LI Feng-ye4，MO Ling1，XIE Jin-wen1，SHEN Zhi-qiang1
(1．Binzhou animal Science and Veterinary Medicineinstitude，Binzhou 256600，China;2．Shandong Binzhou Research，development and promotion center for Livestock and poultry propolis vaccine，Binzhou 256600，China; 3．Shandong lvduante Animal Medicine Co．，Ltd，Binzhou 256600，China; 4．Shandong province Binzhou city Animal Science＆Veterinary Medicine office，Binzhou 256600，China)

To study the MIC of Rhizoma coptidis and fructus forsythiae when used in combination on HPI+E．coli，polymerase chain reaction(PCR)was used to detect the HPI virulence island of the 9 strains E．coli of known serotype from chickens 7 strains of HPI was detected positive and 2 strains were negative．Bacteriostatic test alone and in combination of Rhizoma coptidis and fructus forsythiae extract were performed on seven HPI+E．coli by microdilution method or microdilution checkerboard．The results showed that the MIC of Rhizoma coptidis and fructus forsythiae was 125 mg/mL and 714 mg/mL on HPI+E．coli when used alone．The MIC of Rhizoma coptidis and fructus forsythiae was 125 mg/mL and 89．25 mg/mL when used in combination，and Joint antibacterial index was FIC=1＜1．125＜2

Coptis chinensis;Forsythia suspense;Associated bacteriostasis;Escherichia coli of HPI+

SHEN Zhi-qiang

S852．61

A

0529-6005(2017)01-0056-04

2016－03－18

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2014CQ012);國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31402243);山東省家禽產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)濱州綜合試驗(yàn)站(SDAIT－11－16)

王艷萍(1979-)，女，獸醫(yī)師，碩士，從事動(dòng)物疫病及綜合防治研究工作，E-mail:xiaowangyanping213@163.com

沈志強(qiáng)，E-mail:1297986799@qq.com