CpG ODN聯(lián)合重組乳酸乳球菌鼻內(nèi)免疫BALB/c小鼠的佐劑效應(yīng)

王振華，曾憲垠

(1．成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川溫江611130; 2．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命理學(xué)院原子能應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室，四川雅安625014)

CpG ODN聯(lián)合重組乳酸乳球菌鼻內(nèi)免疫BALB/c小鼠的佐劑效應(yīng)

王振華1，曾憲垠2

(1．成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川溫江611130; 2．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命理學(xué)院原子能應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室，四川雅安625014)

本試驗(yàn)初次建立了CpG ODN聯(lián)合重組乳酸乳球菌滴鼻免疫BALB/c小鼠模型。結(jié)果得出CpG ODN佐劑協(xié)同重組菌抗原組血清中抗PRRSV特異性抗體IgG和呼吸道黏膜抗體s-IgA均高于單獨(dú)重組菌組(P＞0．05)和單獨(dú)佐劑組(P＜0．01)，佐劑CpG ODN協(xié)同重組菌抗原組的Th1型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ及黏膜淋巴因子IL-5的活性高于單獨(dú)抗原組(P＞0．05)及單獨(dú)佐劑組(P＜0．01)。試驗(yàn)結(jié)果說明CpG ODN作為佐劑與重組菌鼻腔免疫小鼠后，可以提高重組菌誘導(dǎo)的黏膜免疫反應(yīng)和Th1細(xì)胞參與的系統(tǒng)免疫反應(yīng)，為研究安全有效的重組菌黏膜疫苗奠定了基礎(chǔ)。

CpG ODN;重組乳酸乳球菌;鼻腔免疫

隨著免疫學(xué)的深入發(fā)展，黏膜免疫以其獨(dú)特的優(yōu)勢在抵抗感染方面占有重要地位，在進(jìn)行疫苗研究時，新型佐劑的作用也受到更多重視，比較理想的黏膜佐劑應(yīng)高效、安全，能激活黏膜免疫系統(tǒng)，在其存在的情況下抗原經(jīng)黏膜供給可引發(fā)抗原特異性系統(tǒng)免疫和黏膜免疫應(yīng)答，同時能避免黏膜免疫耐受的產(chǎn)生。CpG ODN(CpG oligodeoxynucleotide，CpG ODN)是人工合成的含有CpG基序的寡聚脫氧核苷酸，模擬了細(xì)菌DNA結(jié)構(gòu)，可激活T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等，產(chǎn)生大量的多種細(xì)胞因子，與抗原蛋白共同免疫，具有較強(qiáng)的佐劑效應(yīng)，能同時增強(qiáng)抗原特異性體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，尤其是對細(xì)胞免疫應(yīng)答具有更突出的增強(qiáng)作用。目前研究資料顯示，CpG ODN經(jīng)鼻腔免疫接種小鼠是一種有效的黏膜佐劑，既能增強(qiáng)黏膜抗原黏膜免疫應(yīng)答，又可以增強(qiáng)系統(tǒng)免疫應(yīng)答(包括體液免疫和細(xì)胞免疫)的功能，促進(jìn)Thl/Th2型免疫反應(yīng)，另外臨床實(shí)驗(yàn)還證明了CpG ODN對于人類具有安全性［1－5］。

本試驗(yàn)初次建立了CpG ODN聯(lián)合重組乳酸乳球菌滴鼻免疫BALB/c小鼠模型，評價其佐劑效應(yīng)。

1 試驗(yàn)材料

1．1 實(shí)驗(yàn)動物BALB/c小鼠，雌性，體重18～22 g，6～8周齡，購自華西試驗(yàn)動物中心。

1．2 佐劑及免疫原佐劑:CpG ODN(5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

免疫原:重組乳酸乳球菌PNZ8149/NZ3900－M/PRRS(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存)，菌株為乳酸乳球菌NZ3900，表達(dá)載體為pNZ8149，表達(dá)蛋白為豬繁殖與呼吸綜合征病毒0RF6基因片段(即M蛋白)。

1．3 主要試劑HRP-羊抗鼠IgG、HRP-羊抗鼠IgA，購自美國Sigma公司;細(xì)胞因子檢測試劑盒為基因美公司產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

2．1 實(shí)驗(yàn)動物的選取及處理試驗(yàn)將BALB/c小鼠90只隨機(jī)分為3組(n=30)，分別為重組菌對照組(組Ⅰ)、佐劑+重組菌試驗(yàn)組(組Ⅱ)和佐劑對照組(組Ⅲ)具體見表1。各組實(shí)驗(yàn)動物被連續(xù)免疫三次，間隔7天，每次連續(xù)免疫三天(即:1 d，2 d，3 d，11 d，12 d，13 d，21 d，22 d，23 d)［6］。

表1 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理

2．2 免疫用免疫原的制備將重組菌PNZ8149/ NZ3900－M/PRRS誘導(dǎo)后離心收集菌體，用0.01 mol/L無菌PBS洗滌懸浮，使細(xì)菌含量為1×1011CFU/mL，并將重組菌PNZ8149/NZ3900－M/PRRS與免疫佐劑充分乳化，佐劑劑量為10 μg/只。

2．3 樣品采集及指標(biāo)檢測

2．3．1 呼吸道黏膜s-IgA檢測分別于最后一次免疫后0 d、7 d、14 d、21 d、28 d處死小鼠6只，取肺臟，收集沖洗液，采用間接ELISA方法檢測呼吸道黏膜s-IgA水平。

2．3．2 血清中特異抗體IgG檢測分別于最后一次免疫后0 d、7 d、14 d、21 d、28 d眼眶靜脈采集6只小鼠血液，收集血清，采用間接ELISA方法檢測血清特異性抗體。

2．3．3 細(xì)胞因子檢測分別于最后一次免疫后14 d，處死后取鼠脾臟，制備脾臟淋巴細(xì)胞懸液，收集脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-5及IFN-γ的活性。

3 結(jié)果分析

3．1 血清IgG抗體由表2得出，佐劑+重組菌小鼠血清中特異性IgG抗體含量高于重組菌對照組(P＞0．05)，及佐劑對照組組(P＜0．01)。結(jié)果表明，佐劑CpG ODN通過鼻腔免疫可以增加重組乳酸乳球菌體液免疫水平。

3．2 呼吸道黏膜s-IgA由表3可出，在整個免疫測定時間內(nèi)，佐劑+重組菌組小鼠呼吸道黏膜中s-IgA含量高于單獨(dú)佐劑組(P＜0．01)和單獨(dú)重組菌組(P＞0．05)。同時所有組小鼠黏膜中的特異性s-IgA都處于平穩(wěn)狀態(tài)，可能是檢測時間比較晚或檢測周期相對較短導(dǎo)致。表明黏膜免疫佐劑CpG ODN經(jīng)鼻腔免疫接種可以提高重組菌刺激呼吸道黏膜產(chǎn)生s-IgA的含量。

3．3 細(xì)胞因子佐劑CpG ODN聯(lián)合重組菌PNZ8149/NZ3900－M/PRRS鼻內(nèi)免疫小鼠后，小鼠脾臟細(xì)胞懸液中Th1型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和黏膜淋巴因子IL-5的活性高于重組菌PNZ8149/ NZ3900－M/PRRS單獨(dú)免疫組(P＞0．05);Th2型細(xì)胞因子IL-4水平在各組之間差異不顯著(P＞0.05)(見表4)。結(jié)果表明，佐劑CpG ODN通過鼻腔免疫能夠提高重組菌的抗原應(yīng)答。

4 討論

佐劑CpG ODN是一種有效的黏膜佐劑，經(jīng)鼻腔免疫接種小鼠既能增強(qiáng)黏膜抗原黏膜免疫應(yīng)答，又可以增強(qiáng)系統(tǒng)免疫應(yīng)答(包括體液免疫和細(xì)胞免疫)的功能，促進(jìn)Thl/Th2型免疫反應(yīng)［1－5］。1998年，Moldoveanu等以CpG佐劑協(xié)同滅活流感病毒抗原滴鼻免疫小鼠，測得血清中IgG和鼻腔、生殖道黏膜中s-IgA的滴度比單獨(dú)抗原組顯著增高，首次證明CpG具有黏膜佐劑作用;Kodama等以CpG ODN為佐劑，與抗原P6聯(lián)合鼻內(nèi)免疫小鼠，結(jié)果血清和鼻腔沖洗液中均檢出高滴度的IgG和s-IgA［7］;史彤等以幽門螺桿菌超聲粉碎物作為抗原，以CpG ODN作為佐劑，得出CpG ODN作為鼻黏膜免疫佐劑激活Thl型免疫應(yīng)答和IFN-γ的分泌在抗感染中起著重要作用［8］。石蓉等將弓形蟲可溶性速殖子抗原(STAg)與不同劑量(1 μg、5 μg、10 μg)的CpG ODN聯(lián)合滴鼻免疫小鼠，得出CpG ODN可作為STAg的鼻腔免疫的黏膜佐劑［9］;張曉文等在H5N2型禽流感滅活抗原中添加佐劑CpG ODN，證實(shí)CpG ODN佐劑能夠增加羅曼公雞呼吸道s-IgA分泌細(xì)胞面積和IgG分泌細(xì)胞數(shù)量，提高局部呼吸道體液免疫應(yīng)答水平［10］。Kumar等評價了CpG ODN佐劑對鼠源瘧原蟲19 kD膜表面蛋白表達(dá)抗原的免疫增強(qiáng)作用，結(jié)果顯示CpG ODN主要產(chǎn)生Thl型免疫反應(yīng)［11］。本研究在目前的研究基礎(chǔ)上，采用10 μg的CpG ODN作為佐劑，以重組菌PNZ8149/NZ3900－M/ PRRS為抗原，鼻腔免疫小鼠，佐劑CpG ODN協(xié)同重組菌經(jīng)鼻腔免疫小鼠能提高抗原誘導(dǎo)的黏膜免疫和h1型細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)，為黏膜免疫的廣泛應(yīng)用提供了良好基礎(chǔ)。

表2 佐劑CpG ODN聯(lián)合重組菌鼻內(nèi)免疫小鼠后血清中特異性IgG檢測結(jié)果

表2 佐劑CpG ODN聯(lián)合重組菌鼻內(nèi)免疫小鼠后血清中特異性IgG檢測結(jié)果

注:同列肩標(biāo)不同字母表示組間差異顯著(P＜0．05)，相同字母表示組間差異不顯著(P＞0．05);大寫字母表示(P＜0．01)水平，小寫字母表示(P＜0．05)水平，下表同

表3 佐劑CpG ODN聯(lián)合重組菌鼻內(nèi)免疫小鼠后呼吸道黏膜特異性s-IgA檢測結(jié)果

表3 佐劑CpG ODN聯(lián)合重組菌鼻內(nèi)免疫小鼠后呼吸道黏膜特異性s-IgA檢測結(jié)果

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表4 佐劑CpG ODN聯(lián)合重組菌鼻內(nèi)免疫小鼠脾細(xì)胞懸液分泌的細(xì)胞因子檢測結(jié)果

表4 佐劑CpG ODN聯(lián)合重組菌鼻內(nèi)免疫小鼠脾細(xì)胞懸液分泌的細(xì)胞因子檢測結(jié)果

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5 結(jié)論

CpG ODN佐劑協(xié)同重組乳酸乳球菌鼻腔免疫小鼠后，具有明顯的黏膜佐劑的效應(yīng)，由此表明，CpG ODN作為重組乳酸乳球菌疫苗免疫佐劑的有效性，為病原體疫苗提供了新的免疫策略。

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［11］Kumar S，Jones T R，Oakley M S，et al．CpG oligodeoxynucleotide and Montanide ISA 51 adjuvant combination enhanced the protective efficacy of a subunit malaria vaccine［J］．Infection and immunity，2004，72(2):949-957．

The Adjuvant CpG ODN Enhance the Recombinant Lactococcus lactis Antigen Elicited Mucosal and Systemic Immunity in Mice by Intranasal Immunization

WANG Zhen-hua1，ZENG Xian-yin2
(1．Department of Animal and Veterinary Science，Chengdu Vocational College of Agricultural Science and Technology，Wenjiang 611130，China;2．Isotope Research Laboratory，College of Life and Basic Sciences，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China)

In order to evaluate the effect of CpG ODN adjuvant，we investigated whether co－administration intranasally of the antigen of the recombinant Lactococcus lactis(L．1actis)expressing ORF6 gene of PRRSV and the adjuvant CpG ODN can enhance mucosal and systemic immune responses in mice．The results showed that the level of mucosal s－IgA in lung lavage fluid and IgG in serum of the mice immunized with the recombinant L．1actis plus adjuvant CpG ODN significantly increased compared with the control group immunized with the recombinant L．1actis plus(P＞0．05)and adjuvant CpG ODN alone(P＜0．01)．Interestingly，The activity of Th1－type cytokines IL-2，IFN-γ and mucosal lymphokine IL-5 in splenocytes were higher than those of the control group immunized with the recombinant L．1actis plus(P＞0．05)and adjuvant CpG ODN alone(P＜0．01)．Taken together，the results demonstrate that intranasal delivery of CpG ODN as a mucosal adjuvant can enhance the antigen－specific mucosal and Th1－typ systemic immune response．

CpG oligodeoxynucleotide;recombinant Lactococcus lactis;Intranasal immunization

ZENG Xian-yin

P392

A

:0529-6005(2017)01-0034-03

2015-08-31

王振華(1975-)，女，博士，副教授，主要從事動物微生態(tài)學(xué)及動物疫病防控的研究，E-mail:363150834@qq．com

曾憲垠，E-mail:616920885@qq．com