瓜蔞薤白半夏湯對ApoE小鼠血脂代謝、氧化應激和主動脈Lox—1表達的影響

郭建恩+米樹斌+閆秀川+辛思源+高飛+梁廣和+李靜華

[摘要] 觀察瓜蔞薤白半夏湯（GXBD）在調(diào)節(jié)血脂代謝、抗氧化、干預ox-LDL/Lox-1通路的作用，探討其抗動脈粥樣硬化（AS）的作用機制。以高脂飼料飼喂雄性Apo-E-/-小鼠42只，建立AS模型。AS模型小鼠隨機分為模型組、辛伐他汀組、GXBD高、低劑量組，以C57BL/6J雄性小鼠作為正常對照組；每組10只，連續(xù)灌胃給藥8周。末次給藥后24 h，檢測血清TC，TG，LDL-C，HDL-C及SOD，MDA，GSH-px，ox-LDL水平；HE染色觀察主動脈組織結(jié)構(gòu)變化，Western blot和PCR分別檢測主動脈Lox-1蛋白表達和mRNA水平。結(jié)果顯示模型組小鼠血脂指標含量及血清MDA，ox-LDL水平顯著高于正常對照組，SOD，GSH-px顯著低于正常對照組，主動脈Lox-1蛋白表達水平及其mRNA水平顯著高于正常對照組（P<0.05），模型組主動脈出現(xiàn)明顯粥樣硬化斑塊；GXBD高、低劑量組和辛伐他汀組小鼠血脂指標含量及MDA，ox-LDL水平顯著低于模型組，SOD，GSH-px顯著高于模型組，主動脈Lox-1蛋白表達水平及其mRNA水平顯著低于模型組（P<0.05），主動脈組織粥樣硬化病變明顯減輕。說明調(diào)節(jié)血脂代謝，抗氧化、抑制Lox-1的表達、干預ox-LDL/Lox-1通路，可能是其抗AS的機制之一。

[關鍵詞] 瓜蔞薤白半夏湯； 動脈粥樣硬化； 抗氧化； 血脂； ox-LDL/Lox-1通路

[Abstract] To observe the functions of Gualou Xiebai Banxia decoction（GXBD） on regulating lipid metabolism， anti-oxidation， and interposing ox-LDL/Lox-1 pathway， and to explore its anti-atherosclerosis （AS） mechanisms. AS models were established by using 42 Apo-E-/- male mice with high fat diet. AS model mice were randomly divided into the model group， simvastatin group， and GXBD high and low dose groups. C57BL/6J male mice were used as the normal control group， n=10 and the treatment lasted for 8 weeks. The levels of TC， TG， LDL-C， HDL-C， SOD， MDA， GSH-px， and ox-LDL in blood serum were tested 24 h after the last administration. The changes of aortic tissues structure were observed by HE staining； the expression levels of Lox-1 protein and the expression levels of mRNA were detected by Western blot and PCR respectively.Results showed that the blood lipid levels and MDA， ox-LDL levels in blood serum of model group were significantly higher than those in the normal control group， but SOD， GSH-px levels were significantly lower than those in the normal control group， and the Lox-1 protein and mRNA expression levels were also significantly higher than those in the control group（P<0.05）， namely aortic atherosclerosis lesions were obvious in model group.The levels of blood lipid and MDA， ox-LDL of GXBD high and low dose groups and simvastatin group were significantly lower than those in model group， while SOD， GSH-px levels were significantly higher than those in model group， and Lox-1 protein and mRNA expression levels were significantly lower than those in model group（P<0.05）， namely the aortic atherosclerosis lesions were significantly relieved. The above results indicated that GXBD was capable of modulating blood lipid， anti-oxidation， and inhibiting the expression of Lox-1， and interposing ox-LDL/Lox-1 pathway in the AS model Apo-E-/- mice， which may be one of the mechanisms of anti-atherosclerosis.

[Key words] Gualou Xiebai Banxia decoction； atherosclerosis； antioxidant； blood lipid； ox-LDL/Lox-1 pathway

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是冠心病、心肌梗死及腦梗死等多種心腦血管病的主要病理基礎，是多種因素共同作用于不同環(huán)節(jié)的疾病[1]。脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應激、炎癥反應等均不同程度參與了AS的病理過程，氧化低密度脂蛋白（oxidized-low density lipoprotein，ox-LDL）及其受體血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體1（lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1，Lox-1）是影響AS 早期發(fā)病的主要因素[2]。瓜蔞薤白半夏湯（GXBD）是張仲景在《金匱要略》中創(chuàng)立的治療胸痹（冠心?。┑闹絼F(xiàn)代臨床主要用于各種類型冠心?。o癥狀型、心絞痛型、心肌梗死型、心力衰竭型等）等缺血性心臟病的治療[3]。藥理研究證實，該方能夠抗冠脈痙攣、擴張冠狀動脈、保護血管內(nèi)皮、抑制心肌細胞凋亡等，部分揭示了該方保護缺血心肌的機制[4-6]。但是，在該方調(diào)節(jié)血脂方面作用尚存爭議[7]，對抗氧化作用尚有不同意見[8]，保護血管內(nèi)皮機制尚不完全清楚，且尚未見到該方通過抗AS機制進而抗心肌缺血的報道。本研究擬對GXBD調(diào)節(jié)血脂、抗氧化及干預 ox-LDL/Lox-1信號通路的作用進行研究，揭示該方通過以上機制抗早期AS的作用，為該方臨床應用提供理論基礎。

1 材料

1.1 藥品 瓜蔞薤白半夏湯：全瓜蔞12 g，薤白9 g，半夏12 g，黃酒（適量）。薤白顆粒（河北祁新中藥顆粒飲片有限公司，批號110102）；瓜蔞顆粒（河北安國振宇藥業(yè)有限公司，批號130301）；半夏顆粒（河北祁新中藥顆粒飲片有限公司，批號110903）；辛伐他汀片（涿州東樂制藥有限公司，國藥準字號H20083227）。

1.2 動物 SPF級Apo-E-/-雄性小鼠42只，6～8周齡，體重18～20 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號SCXK（京）2012-0001。SPF級雄性C57BL/6J小鼠12只，6～8周齡，體重18～20 g，實驗動物許可證號SCXK（京）2012-0001。

1.3 儀器 ESJ200-4型電子分析天平（沈陽龍騰電子有限公司）；日立7180全自動生化分析儀（日本日立株式會社）；D-37520高速冷凍離心機（sorvall公司）；Multiskan MK3酶標儀（芬蘭Thermo公司）；Rotor-gene 3000 Real-time PCR儀，Cycler PCR儀（Bio-Rad公司）；TE 77 PWR干轉(zhuǎn)儀（Amersham Bioscience公司）；復日FR-980生物電泳圖像分析系統(tǒng)、復日Smart view生物電電泳圖像分析軟件（上海復日科技有限公司）；Western電泳系統(tǒng)（164-5051，Bio-Rad公司）；PCR擴增儀（美國PE公司）；彩色病理圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.4 試劑 高脂飼料（配方：1%膽固醇、0.5%膽酸鈉、10%豬油、10%蛋黃粉和78.5%基礎飼料，批號20150612，北京科澳協(xié)力飼料有限公司）；總膽固醇（TC）試劑盒，批號637456- 01，甘油三脂（TG），批號638873-01，以上試劑由日本日立株式會社生產(chǎn)；低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒，批號分別為020307，2400507，以上試劑生產(chǎn)廠家為北京利德曼生化股份有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）測試盒（WST-1法），貨號A001-3，南京建成生物工程研究所；丙二醛（MDA）測試盒，貨號A001-3，南京建成生物工程研究所；微量還原型谷胱甘肽（GSH）測試盒（微量酶標法），貨號A006-2，南京建成生物工程研究所；小鼠氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒，貨號20150716，廈門慧嘉生物科技有限公司；硝酸纖維素膜，Amersham Bioscience公司產(chǎn)品；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），Bio-Rad公司；40% Acrylamide/Bis solution，Bio-Rad公司產(chǎn)品；化學熒光增強試劑盒（lumin enhanced chemiluminecent kit），BCA protein assay kit，ThermoFisher公司產(chǎn)品；蛋白Marker，F(xiàn)amentas公司產(chǎn)品；醫(yī)用X光膠片（12.7 cm×18.7 cm），購自上?？逻_膠片有限公司；Lox-1抗體購自美國Santa Cruz公司?？俁NA抽提試劑盒，RNeasy Mini Kit，QIAGEN公司產(chǎn)品；cDNA合成試劑盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit， Fermentas 公司；SYBR Green PCR 試劑，SYBR Premix Ex TaqTM，Takara公司產(chǎn)品；無水乙醇，分析純，異丙醇，分析純；引物由TaKaRa公司設計并合成鑒定。

2 方法

2.1 藥液制備 取瓜蔞顆粒12 g，薤白顆粒9 g，半夏顆粒12 g，以上藥物與200 mL黃酒混勻，煎煮過濾合并藥液，減壓濃縮至含生藥1 g·mL-1。辛伐他汀以蒸餾水配制成1 g·L-1溶液。

2.2 AS模型建立 Apo-E-/-雄性42只、C57BL/6J小鼠12只，適應喂養(yǎng)1周，Apo-E-/-雄性小鼠飼喂高脂飼料（60Co γ滅菌照射處理），C57BL/6J小鼠喂飼普通飼料。8周后，隨機解剖Apo-E-/-小鼠及C57BL/6J小鼠各2 只，眼眶取血，3 000 r·min-1離心10 min，檢測血脂水平，取小鼠主動脈，HE染色觀察主動脈組織結(jié)構(gòu)，確定模型成功建立。

2.3 分組及給藥 C57BL/6J小鼠10只作為正常對照組（NS）；制備成功的40只AS模型小鼠隨機分為模型組（MS）、辛伐他汀組（XFTT，5 mg·kg-1）和GXBD-Ⅰ（20 g·kg-1），GXBD-Ⅱ（10 g·kg-1）組，每組10只。給藥組按上述劑量灌胃（ig）給藥，給藥體積20 mL·kg-1；正常對照組及模型組ig等體積的生理鹽水，每日1次，連續(xù)8周。

2.4 標本獲取及處理 末次給藥后24 h，以4%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，眼眶靜脈取血，分離血清，-20 ℃保存用于血清學分析。取血后開胸剝離主動脈全長（從主動脈弓起始到腹主動脈分叉處），生理鹽水沖洗后，用于常規(guī)形態(tài)學檢測；其余標本-80 ℃保存，Western blot和RT-PCR法檢測組織Lox-1蛋白及其mRNA表達水平。

2.5 小鼠血清血脂指標和氧化應激指標的檢測 應用全自動生化分析儀檢測各組動物血脂指標TC，TG，LDL-C，HDL-C，氧化應激指標SOD，MDA，GSH-px及ox-LDL水平，按產(chǎn)品說明書要求操作。

2.6 小鼠主動脈粥樣斑塊病理檢測 取主動脈弓部5 mm放入10%甲醛固定，常規(guī)乙醇脫水、石蠟包埋、切片，用于常規(guī)病理檢查。

2.7 小鼠主動脈Lox-1蛋白表達測定 取100 mg主動脈組織，提取總蛋白，制備SDS聚丙烯酰胺凝膠，對處理后的蛋白樣品進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜70 min，將膜取出，麗春紅染色，水洗脫色后，5%脫脂奶粉TBST液封閉，室溫震蕩1 h，棄封閉液，加入一抗Lox-1（1∶1 000）稀釋液孵育，4 ℃過夜，TTBS洗5 min，3次，然后根據(jù)一抗的性質(zhì)加入相應辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液孵育，室溫震蕩1 h，TTBS洗5 min，3次，除去未結(jié)合的二抗，加發(fā)光液，曝光。應用復日FR-980生物電泳圖像分析系統(tǒng)分析底片中目的條帶，并分析條帶密度值。作為內(nèi)參照。每個實驗重復3批以上不同樣本。

2.8 Real-time PCR測定主動脈Lox-1 mRNA表達 按照QIAGEN公司RNeazy Mini Kit說明提取主動脈組織總RNA，酶標儀檢測260 nm和280 nm波長吸光度，以計算A260/A280估計RNA純度（正常值1.8～2.0），質(zhì)量濃度=A260×40×100（稀釋倍數(shù)）（g·mL-1）。在冰浴的無核酸酶的離心管中加入反應混合物進行逆轉(zhuǎn)錄反應。于PCR反應管中加入反應混合物進行Real-time PCR：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物（5 μmol·L-1）各1 μL（Lox-1上游引物5′-ACGGTTCTCCTTTGATGC-3′，下游引物5′-CTCTTAGGTTTGCCTTCTTC-3′；GAPDH上游引物5′-GGCATTGTGGAAGGGCTC-3′，下游引物5′-GACCTTGCCCACAGCCTT-3′），模板cDNA 1 μL、去離子水7 μL；反應條件：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，56 ℃ 20 s，40個循環(huán)進行擴增。

2.9 數(shù)據(jù)處理 使用SPSS 17.0數(shù)據(jù)處理軟件包進行統(tǒng)計學分析，計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 t 檢驗，以 P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 瓜蔞薤白半夏湯對小鼠血清血脂水平的影響 模型組小鼠血清TG，TC，LDL-C水平高于對照組，HDL-C水平低于對照組（P<0.05）。各給藥組小鼠血清TG，TC，LDL-C水平低于模型組，HDL-C水平高于模型組（P<0.05），見表1。

3.2 瓜蔞薤白半夏湯對Apo-E-/-小鼠SOD，GSH-px，MDA，ox-LDL的影響 模型組小鼠血清SOD，GSH-px水平低于對照組，MDA，ox-LDL含量高于對照組（P<0.05）。各給藥組小鼠血清SOD，GSH-px水平高于模型組，MDA，ox-LDL含量低于模型組（P<0.05），見表2。

3.3 瓜蔞薤白半夏湯對小鼠主動脈Lox-1蛋白及mRNA表達的影響 模型組主動脈組織中Lox-1蛋白表達水平高于對照組（P<0.05）。各給藥組主動脈組織中Lox-1蛋白表達低于模型組（P<0.05）。各給藥組主動脈組織中Lox-1 mRNA表達低于模型對照組（P<0.05），見圖1，表3。

3.4 瓜蔞薤白半夏湯對小鼠主動脈組織形態(tài)學的影響 對照組：動脈內(nèi)膜完整且平滑，動脈內(nèi)膜表面的內(nèi)皮細胞呈褶皺狀均勻排列；模型組：血管內(nèi)壁有殘損，管腔出現(xiàn)粥樣硬化斑塊，斑塊表面可見由大量膠原纖維以及少量的平滑肌纖維帽，斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量豐富，纖維帽下方散在大量泡沫細胞和一些炎細胞[9]；GXBD低劑量組：血管內(nèi)壁偶有殘損，血管腔可見粥樣硬化斑塊，斑塊面積較模型組小，脂質(zhì)含量也較模型組少，斑塊內(nèi)可見少量泡沫細胞及炎性細胞；GXBD高劑量組及他汀組：血管內(nèi)壁較為光滑，偶見內(nèi)膜殘損，偶見泡沫細胞聚集和炎細胞浸潤，見圖2。

4 討論

中醫(yī)無AS一說，據(jù)其臨床表現(xiàn)，多與中醫(yī)之“胸痹”、“真心痛”、“中風”、“眩暈”、“頭痛”等病證相聯(lián)系，痰濁是AS發(fā)病的主要病理因素之一[9]?！督饏T要略》認為，胸痹之病機為“陽微陰弦”，胸陽不足、痰濁水濕痹阻，表現(xiàn)為喘息咳唾，胸背痛，短氣等，治以宣痹通陽。瓜蔞薤白半夏湯為治療“胸痹不得臥，心痛徹背”為主要表現(xiàn)的方劑，由全瓜蔞、薤白、半夏、白酒（低度米釀酒）組成，具有行氣解郁，通陽散結(jié)，祛痰寬胸之效。現(xiàn)代藥理研究顯示，該方可通過降低CK，LDH，調(diào)解Bcl-2，Box 蛋白表達，抑制炎癥信號通路NF-κB、誘導提高JAK-STAT信號通路表達，干預（IL）-1β，IL-6，IL-10基因表達等多方面保護缺血心肌[10-12]。但是，現(xiàn)代臨床多將本方用于無癥狀型、心絞痛型等冠心病的治療[3]，而冠心病的病理基礎為AS，故從本方抗AS機制入手進行研究，更能揭示該方抗心肌缺血的機制，更接近于臨床應用之實際。

脂質(zhì)代謝異常、氧化應激（OS）是早期AS重要的危險因素[13]。在長期HLP的情況下，增高的脂蛋白和膽固醇可對動脈內(nèi)膜造成功能性和結(jié)構(gòu)性損傷，盧志順等[14]研究證實，血漿中游離膽固醇達到一定濃度時，可引起內(nèi)皮細胞膜結(jié)構(gòu)的改變。同時，正常機體內(nèi)活性氧的生成和清除處于一種動態(tài)平衡，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）等是維持體內(nèi)氧化與抗氧化平衡的重要活性物質(zhì)。在氧化平衡被打破的情況下，脂質(zhì)發(fā)生過氧化，產(chǎn)生毒性代謝終產(chǎn)物如丙二醛（MDA），能破壞細胞結(jié)構(gòu)及功能，導致局部血管病理損傷和血管機能異常。另外，通過損傷的內(nèi)皮細胞滲透進入動脈內(nèi)膜下的LDL，在氧自由基（ROS）氧化修飾下變?yōu)閛x-LDL。目前認為，ox-LDL具有細胞毒性作用，能夠誘發(fā)動脈內(nèi)皮功能和結(jié)構(gòu)的損傷，在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用[15]。以上多個環(huán)節(jié)共同造成了動脈內(nèi)皮功能和結(jié)構(gòu)的持續(xù)性損傷。

Lox-1是一種在內(nèi)皮細胞豐富表達的Ⅱ型單鏈跨膜蛋白，可以結(jié)合、吞噬并降解ox-LDL，是介導血管內(nèi)皮細胞攝取ox-LDL的主要受體之一。研究發(fā)現(xiàn)[16]，Lox-1結(jié)合ox-LDL后可迅速誘發(fā)內(nèi)皮細胞ROS升高，特別是超氧陰離子和H2O2顯著升高，升高的ROS除作為第二信使外，還直接作用于內(nèi)皮細胞，使NO失活和NF-κB活化，胞膜脂質(zhì)過氧化[12，17]。而ox-LDL通過Lox-1與血管內(nèi)皮細胞相互作用，引起如前所述的內(nèi)皮細胞損傷及內(nèi)皮功能障礙，是觸發(fā)AS病理過程的重要因素。同時，Lox-1尚可激活許多信號轉(zhuǎn)導途徑，參與AS病理的進展過程。因此，調(diào)節(jié)血脂代謝、抗氧化、調(diào)節(jié)Lox-1表達水平都是AS治療中的重要環(huán)節(jié)。

本研究以Apo-E小鼠復制AS病理模型，觀察GXBD對AS小鼠血脂代謝、氧化應激、血管內(nèi)皮功能等的影響。研究結(jié)果顯示，GXBD各組和辛伐他汀組小鼠血清TG，TC，LDL-C水平顯著低于模型組（P<0.05），HDL-C水平顯著高于模型組（P<0.05），說明GXBD可降低AS小鼠血脂水平。HE染色顯示GXBD各組和辛伐他汀組主動脈組織粥樣硬化病變較模型組減輕，說明GXBD可抑制AS小鼠動脈粥樣硬化形成，并且與辛伐他汀片療效相當。GXBD各組和辛伐他汀組小鼠血清SOD，GSH-px水平高于模型組（P<0.05），MDA，ox-LDL水平低于模型組，說明GXBD通過干預氧化應激分子水平，降低AS小鼠氧化應激反應。GXBD各組和辛伐他汀組小鼠主動脈Lox-1蛋白及其mRNA表達低于模型對照組（P<0.05），說明GXBD可以通過干預Lox-1表達，降低氧化應激對AS小鼠的影響，從而改善AS小鼠血管內(nèi)皮功能。綜上所述，瓜蔞薤白半夏湯能夠調(diào)節(jié)AS小鼠血脂代謝、抗氧化、干預ox-LDL/Lox-1通路，可能是其抗AS的部分機制。

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