紫蘇葉揮發(fā)油化學(xué)型和組分影響因素探究Ⅰ——不同生長(zhǎng)發(fā)育期

魏長(zhǎng)玲+張琛武+郭寶林+李衛(wèi)萍+高占祥+張芬+田景

[摘要] 該論文以普遍存在的PK型、PA型及稀有的PL型3種紫蘇種質(zhì)為研究對(duì)象。在紫蘇生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)期、開(kāi)花期、果熟期3個(gè)時(shí)期進(jìn)行紫蘇成熟葉樣品采集，同時(shí)分為1 d之中早7點(diǎn)、午12點(diǎn)、晚18點(diǎn)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)其揮發(fā)油進(jìn)行了提?。ㄋ羝麴s法）和GC-MS分析，3種化學(xué)型的樣品揮發(fā)油得率在0.08%～0.96%，不同生長(zhǎng)時(shí)期揮發(fā)油得率大致為營(yíng)養(yǎng)期>開(kāi)花期>落葉期，營(yíng)養(yǎng)期揮發(fā)油得率：PA型>PK型>PL型。各化學(xué)型類別不受生長(zhǎng)發(fā)育影響，表明遺傳因素決定了化學(xué)型。PA和PK型的特征成分和主要成分相對(duì)含量都比較穩(wěn)定，而PL型的特征成分隨生長(zhǎng)發(fā)育大幅度降低，組成中還存在大量各類成分代謝的上游化合物，表明該化學(xué)型可能具有原始性和多變性。PA型特征成分紫蘇醛相對(duì)含量各個(gè)時(shí)期基本上從早到晚逐漸降低。PK型特征成分紫蘇酮在營(yíng)養(yǎng)期和開(kāi)花期中午相對(duì)含量高于早晚樣品，果熟期則相反。PL型特征成分紫蘇烯相對(duì)含量在營(yíng)養(yǎng)期和果熟期都是中午最高，開(kāi)花期則是傍晚樣品最高。綜合揮發(fā)油得率和主要成分相對(duì)含量，PA型的最佳采收時(shí)間在營(yíng)養(yǎng)期的早晨采收；PK型的最佳采收期在各期午前均可；PL型的最佳采收期在營(yíng)養(yǎng)期的晚上采收最好。

[關(guān)鍵詞] 紫蘇； 揮發(fā)油； 紫蘇醛型； 紫蘇酮型； 紫蘇烯型； 生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期； 相對(duì)含量變化

[Abstract] This experiment researched on three kinds of Perilla frutescens including the widespread PK， PA and rare PL chemotype. The Perilla samples were the mature leaves collected in nutrition， flowering and frutescence three different phenological periods， and at 7 am， 12 pm and 6 pm three day time. The volatile oil was extracted by steam distillationand analyzed by GC-MS， as a result， the three chemotype samples′volatile oil yield was between 0.08% and 0.96%； volatile oil yield of different growth period was as follow： nutrition>flowering>fructescence， and the volatile oil yield of nutrition period： PA type>PK type>PL type. Each chemotype was not affected by the growth and development， indicating that the chemotype is determined by genetic factors. Characteristic and main components of PA and PK type are relatively stable， and the characteristic components of PL type are significantly decreased with the growth. There are still a large number of upstream metabolism components， and the chemical type may have their primitiveness and changeability. The relative content of perillaldehyde， characteristic components of PA type， is basically decreased from morning to night， in all the period. The relative content of perillaketone， characteristic components of PK type， in nutrition and flowering period， when samples were collected at 12 noon is relatively higher than that at 7 am and 6 pm， and contrary to samples collected in frutescence period. The relative content of perillene， characteristic components of PL type， in nutrition and frutescence period are highest at 12 noon， while in flowering period is highest at 6 pm. According to the volatile oil yield and relative content of maincomponents， the best harvest time of PA type is in the morning of the nutrition period； the best harvest time of PK type is in the morning of all the period； and the best harvest time of PL type is at dusk of the nutrition period.

[Key words] Perilla frutescens； volatile oil； perillaldehyde chemotype（PA）； perillaketone chemotype（PK）； perillene chemotype（PL）； phenological period； changes of relative content

紫蘇葉因存在不同的揮發(fā)油化學(xué)型從而導(dǎo)致藥用時(shí)活性存在差異。本實(shí)驗(yàn)在前期對(duì)國(guó)內(nèi)紫蘇資源調(diào)查和化學(xué)型歸類分析的基礎(chǔ)上[1-2]，選擇了國(guó)內(nèi)資源中普遍存在的紫蘇醛型（PA型）和紫蘇酮型（PK型），以及《中國(guó)藥典》藿香正氣液項(xiàng)下的紫蘇葉油標(biāo)準(zhǔn)中涉及的紫蘇烯型（PL型）3種不同化學(xué)型的紫蘇[3]，研究它們不同在生長(zhǎng)發(fā)育期、一天不同時(shí)間段的葉中揮發(fā)油化學(xué)型和構(gòu)成揮發(fā)油組分的變化，并探討可能的規(guī)律。

1 材料

1.1 儀器和試劑 GC-MS（7890B-5977A）氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀器（Agilent安捷倫公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELA N-1100 上海愛(ài)朗儀器有限公司）；分析天平（FA2014N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；循環(huán)式真空泵（CA-1111上海愛(ài)朗儀器有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

蒸餾水，石油醚（分析純，北京化工廠）；正己烷（色譜純，fisher公司）無(wú)水乙醇（分析純，北京化工廠）。

1.2 樣品 3份不同揮發(fā)油化學(xué)型的紫蘇種子均來(lái)自經(jīng)調(diào)查后確定的栽培紫蘇主產(chǎn)區(qū)：PK型種子來(lái)自甘肅省慶陽(yáng)市，PA型和PL型種子均來(lái)自重慶市，收集于2015年3月，種植于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所栽培實(shí)驗(yàn)田。3份種子以其對(duì)應(yīng)的化學(xué)型名稱為編號(hào)。播種期5月8日，出苗期5月17日左右。3個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期采集成熟葉樣品，①營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期（簡(jiǎn)稱營(yíng)養(yǎng)期）：營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛時(shí)期，植株高度約達(dá)最終高度的2/3，PK型樣品采集于7月23日，PA型和PL型樣品采集于8月20日；②開(kāi)花期：花序上半數(shù)以上花開(kāi)放，PK型樣品采集于9月15日，PA型和PL型樣品采集于10月8日；③果熟期：果序上半數(shù)果實(shí)成熟，植株下部葉片開(kāi)始發(fā)黃和脫落，PK型樣品采集于10月8日，PA型和PL型樣品采集于10月19日，每1個(gè)生長(zhǎng)期，又分為早晨7時(shí)（簡(jiǎn)稱早）、中午12時(shí)（簡(jiǎn)稱午）和傍晚18時(shí)（簡(jiǎn)稱晚）3個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣。葉片均采集自植株中部的成熟葉片，每個(gè)樣品約60個(gè)單株的混合，陰干，陰涼處存放。

2 方法

揮發(fā)油提取和GC-MS分析參見(jiàn)文獻(xiàn)[2]。

3 結(jié)果和討論

紫蘇葉PA，PK，PL 3個(gè)化學(xué)型在營(yíng)養(yǎng)期、開(kāi)花期、果熟期3個(gè)時(shí)期揮發(fā)油得率及GC-MS分析結(jié)果分別見(jiàn)表1～3。

3.1 揮發(fā)油得率的變化 PA型各生長(zhǎng)時(shí)期揮發(fā)油得率均表現(xiàn)為：生長(zhǎng)發(fā)育期對(duì)揮發(fā)油得率影響很大，營(yíng)養(yǎng)期開(kāi)花期>果熟期；從1 d的不同時(shí)間點(diǎn)看，營(yíng)養(yǎng)期：早中≈晚；而開(kāi)花期和果熟期：早≈中>晚。

PK型各生長(zhǎng)時(shí)期揮發(fā)油得率均表現(xiàn)為：營(yíng)養(yǎng)期≈開(kāi)花期>果熟期，下降幅度不大。從1 d的不同時(shí)間點(diǎn)看，營(yíng)養(yǎng)期：早≈中>晚，而開(kāi)花期和果熟期：早<中，中>晚，開(kāi)花期早晚差不多，而果熟期的早晨揮發(fā)油很低0.08%，是較為特殊的結(jié)果。

PL型在各生長(zhǎng)時(shí)期揮發(fā)油得率大體表現(xiàn)為：營(yíng)養(yǎng)期>開(kāi)花期≈果熟期，下降幅度不大。從1 d的不同時(shí)間點(diǎn)看，營(yíng)養(yǎng)期：早>午晚，開(kāi)花期：早≈午晚，果熟期：早≈午<晚，在2個(gè)發(fā)育期表現(xiàn)為晚上得率最高，是有意思的現(xiàn)象。

本結(jié)果支持紫蘇葉采集時(shí)間一般應(yīng)為營(yíng)養(yǎng)期或花前期，而不應(yīng)在果熟期采集，其中PA型對(duì)采集時(shí)期非常敏感，而PL型次之，PK型紫蘇則營(yíng)養(yǎng)期直至花期采集均可。在適合采集期里，PA型應(yīng)該在早晨采集，PK型則從早到午采集均可，PL型卻在傍晚采集最好。

3.2 揮發(fā)油組成變化 3種化學(xué)型樣品，在各生長(zhǎng)發(fā)育期的化學(xué)型類型是穩(wěn)定的，且石竹烯（caryophyllene）為3個(gè)化學(xué)型各時(shí)期共有的較高含量成分，與以往關(guān)于PA型和PK型的報(bào)道一致[4-7]。

PA型揮發(fā)油組成可分為4個(gè)主要部分，第一部分是該化學(xué)型的特征成分紫蘇醛（perillaldehyde）、D-檸檬烯（D-limonene），以及和該化學(xué)型代謝相關(guān)的幾個(gè)單萜： trans-shisool、紫蘇醇（perilla alcohol），紫蘇醛的相對(duì)含量大多在50%左右，花期的相對(duì)含量稍高，D-檸檬烯是紫蘇醛代謝直接上游化合物，在3個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期大致是逐漸降低的趨勢(shì)，其中在開(kāi)花期和果熟期的傍晚都低于2%；其他幾個(gè)成分中，紫蘇醇和trans-shisool則在果熟期增加較多，如trans-shisool在其他時(shí)期1.45%～3.36%，果熟期則為3.84%～4.95%，紫蘇醇在營(yíng)養(yǎng)期未檢測(cè)到，花期低于1%，到果熟期傍晚則達(dá)到8.14%；第二部分是倍半萜類成分，包括石竹烯、α-佛手柑油烯（α-bergamotene）、葎草烯（humulene）、大根香葉烯D（germacrene D）、γ-欖香烯（γ-elemene）、石竹烯氧化物

（caryphyllene oxide）和α-法尼烯（α-farnesene），石竹烯在全部樣品中相對(duì)含量變化不大，15.61%～17.77%，α-佛手柑油烯在果熟期較其他時(shí)期相對(duì)含量高，其他幾個(gè)成分大多是果熟期略有增加，α-法尼烯含量較低（0～1.11%）；第三部分為該化學(xué)型中一般不會(huì)出現(xiàn)的單萜成分，如PK型的紫蘇酮（perillaketone）、PL型的紫蘇烯（perillen）僅在開(kāi)花期檢出紫蘇酮（開(kāi)花期午1.05%，晚4.39%）和紫蘇烯（開(kāi)花期晚1.16%）；第四部分是芳香類化學(xué)型PP型的構(gòu)成成分及相關(guān)成分，肉豆蔻醚（myristicin）及其上游代謝成分丁香酚（eugenol），肉豆蔻醚則在3個(gè)發(fā)育時(shí)期的9個(gè)時(shí)間點(diǎn)中6個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢出，且含量大小沒(méi)有規(guī)律，如開(kāi)花期僅在傍晚檢出，而含量卻最高（7.61%），丁香酚僅在開(kāi)花期和果熟期的中午和傍晚檢出。另有紫蘇中所有單萜類成分代謝的共同上游成分芳樟醇（linalool），在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有檢出（0.72%～3.76%），相對(duì)含量大致呈現(xiàn)隨發(fā)育期逐漸降低。

PK型揮發(fā)油組成可分為3個(gè)主要部分，第一部分是該化學(xué)型的特征成分紫蘇酮（perillaketone），以及代謝相關(guān)的白蘇烯酮（egomaketone），紫蘇酮的相對(duì)含量在48%～70%，營(yíng)養(yǎng)期（約50%）<開(kāi)花期（約60%）<果熟期（67%以上），一天的不同時(shí)間點(diǎn)，則營(yíng)養(yǎng)期和開(kāi)花期是中午最高，果熟期反而是中午最低，白蘇烯酮是紫蘇酮代謝的前體化合物，相對(duì)含量正好與紫蘇酮相反，且變化幅度比較大，營(yíng)養(yǎng)期（36%以上）>開(kāi)花期（大約22%）>果熟期（大約15%）；第二部分也是倍半萜類成分，包括與PA型共有的石竹烯、α-法尼烯、葎草烯、石竹烯氧化物，以及2-丁烯二環(huán)庚烷（2-（1-buten-3-yl）-bicyclo[2.2.1]heptane）和保留時(shí)間為11.01的未知成分（經(jīng)GC/MS軟電離分子量分析，為倍半萜成分），均相對(duì)含量變化不大。第三部分為該化學(xué)型中一般不會(huì)出現(xiàn)的單萜類，如PA型的D-檸檬烯，僅在開(kāi)花期的中午檢測(cè)出，微量（0.13%）。未檢出芳香類化合物。另外上游單萜成分芳樟醇在開(kāi)花期和果熟期檢測(cè)到，相對(duì)量均小于1%。另有一種在植物揮發(fā)油中常存在的1-辛烯-3-醇（1-octen-3-ol），又叫蘑菇醇，在開(kāi)花期和果熟期檢出，相對(duì)量也均小于1%。

PL型揮發(fā)油組成可分為4個(gè)主要部分，第一部分是該化學(xué)型的特征成分紫蘇烯，其含量在不同生長(zhǎng)發(fā)育期表現(xiàn)為極大的差異，營(yíng)養(yǎng)期（大于75%）>開(kāi)花期（54.51%～60.70%）>果熟期（3.57%～24.36%）；第二個(gè)部分是倍半萜類成分，包括和PA， PK共有的石竹烯、α-佛手柑油烯、葎草烯、石竹烯氧化物、α-法尼烯，以及和PA共有的大根香葉烯D、還有反式橙花叔醇（trans-nerolidol），石竹烯、α-佛手柑油烯和大根香葉烯D在生長(zhǎng)發(fā)育期均表現(xiàn)為營(yíng)養(yǎng)期<開(kāi)花期<果熟期，且變化幅度很大，如石竹烯從營(yíng)養(yǎng)期的大約7.52%～9.31%變?yōu)楣炱诘?9.02%～25.71%，其他幾種倍半萜或者在營(yíng)養(yǎng)期、或者在花期未檢出，或相對(duì)含量很低，而果期均相對(duì)含量均增加，且大多高于在PA和PK型中的同期情況；第三部分為其他化學(xué)型中的單萜成分，如紫蘇醛、D-檸檬醛，紫蘇酮，薄荷酮，均在部分時(shí)間點(diǎn)的樣品中檢出，含量不高，也未見(jiàn)明顯規(guī)律；第四部分為芳香類化學(xué)型中的成分，如細(xì)辛腦（asarone）、丁香酚，且含量較高。在PL型中還發(fā)現(xiàn)紫蘇單萜成分代謝過(guò)程中的多個(gè)上游化合物，除了芳樟醇，還有順勢(shì)牻牛兒醇（cis-geraniol）、順式檸檬醛（cis-citral）、反式檸檬醛（trans-citral），均是在部分時(shí)間點(diǎn)檢出。此外PL型中還檢出了一些植物揮發(fā)油中常見(jiàn)成分，除了1-辛烯-3-醇，還有鄰二甲苯（O-xylene）、甲基水楊酸（methyl-salicylate），也是在部分時(shí)間點(diǎn)檢出。

Nitta等通過(guò)雜交實(shí)驗(yàn)推測(cè)了紫蘇葉揮發(fā)油中主要化學(xué)型構(gòu)成成分單萜類和芳香類兩類成分的生物合成途徑，單萜類以甲羥戊酸（mevalonic acid）途徑合成，芳香類終產(chǎn)物以莽草酸（shikimic acid）途徑合成，兩途徑之間因基因控制而發(fā)生切換[8]。從生源合成途徑來(lái)看，本實(shí)驗(yàn)的3個(gè)化學(xué)型樣品均以甲羥戊酸途徑合成，但在PA型樣品全生長(zhǎng)期均檢出芳香類成分肉豆蔻醚、開(kāi)花期和果熟期檢出芳香類成分的前體化合物丁香酚，PL型樣品的全生長(zhǎng)期均檢出丁香酚、果熟期檢出芳香類成分細(xì)辛腦，而PK型樣品各時(shí)期均未檢出芳香類成分，故作者認(rèn)為對(duì)于PA型和PL型，單萜類和芳香類2個(gè)合成途徑之間可能并非嚴(yán)格的單基因控制。紫蘇烯是紫蘇酮的前體化合物，但自然界PK型為最普遍的化學(xué)型，在已有報(bào)道的PK型紫蘇揮發(fā)油中一般無(wú)紫蘇烯成分或微量存在（0.8%）[9-12]，說(shuō)明紫蘇烯很容易轉(zhuǎn)化為紫蘇酮。PA型和PL型中均檢出紫蘇酮，而PK型中僅檢出極微量的PA型特征成分D-檸檬烯，說(shuō)明PK型較PA和PL型為優(yōu)勢(shì)（顯性）化學(xué)型[10]，另外從種類和相對(duì)含量上，PK型中較少代謝上游單萜成分，而PA型較多、PL型更多，其他文獻(xiàn)也支持這樣的狀況[13]，表明幾種化學(xué)型中可能PL較為原始、PA適當(dāng)進(jìn)化，PK更為進(jìn)化，本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討紫蘇單萜類成分的代謝控制，以及不同化學(xué)型之間的進(jìn)化關(guān)系，有一些不錯(cuò)的提示[13]。

3.3 主要成分相對(duì)含量變化 本實(shí)驗(yàn)選擇了每種化學(xué)型的相對(duì)含量在前5位的化合物，比較它們?cè)诓煌l(fā)育期（早晨）相對(duì)含量的變化，結(jié)果參見(jiàn)圖1。

PA型揮發(fā)油中主要成分單萜類的紫蘇醛、D-檸檬烯和trans-shisool，以及倍半萜類的石竹烯、α-佛手柑油烯均表現(xiàn)為在不同發(fā)育期內(nèi)相對(duì)含量的穩(wěn)定性，表明單萜類的幾種成分的轉(zhuǎn)化不受生長(zhǎng)發(fā)育影響。

PK型揮發(fā)油中主要成分單萜類的紫蘇酮和白蘇烯酮表現(xiàn)為隨生長(zhǎng)發(fā)育前者上升，后者下降的趨勢(shì)，而二者之和相對(duì)穩(wěn)定，而倍半萜類的石竹烯、α-法呢烯和石竹烯氧化物表現(xiàn)穩(wěn)定，表明白蘇烯酮轉(zhuǎn)化為有條件轉(zhuǎn)化，紫蘇酮受生長(zhǎng)發(fā)育較大影響。由于白蘇烯酮存在于PK型紫蘇中的情況較少，因此本實(shí)驗(yàn)樣品表現(xiàn)出了一種特殊性，可作為一種特殊研究材料。

PL型揮發(fā)油中主要單萜成分紫蘇烯，隨生長(zhǎng)發(fā)育呈現(xiàn)出相對(duì)含量大幅度減少的趨勢(shì)。而倍半萜成分α-佛手柑油烯、石竹烯、大根香葉烯D不同于PA和PK型，相對(duì)含量均呈增加趨勢(shì)。芳香類成分丁香酚相對(duì)含量也呈增加趨勢(shì)。PL型中主要特征成分隨生長(zhǎng)發(fā)育的相對(duì)含量巨幅減少，而其他成分的相對(duì)含量增加，都表明PL型的化學(xué)構(gòu)成的特殊性，這為闡明紫蘇葉揮發(fā)成分的生物合成具有重要的價(jià)值。

4 小結(jié)

綜合生長(zhǎng)發(fā)育期和一天不同時(shí)間點(diǎn)的揮發(fā)油得率和揮發(fā)油中特征成分相對(duì)含量（得率×相對(duì)含量）的變化，PA的最佳采收時(shí)間在營(yíng)養(yǎng)期的早晨采收；PK型的最佳采收期在開(kāi)花期的中午，營(yíng)養(yǎng)期和開(kāi)花期的午前均可；PL型的最佳采收期在營(yíng)養(yǎng)期的晚上采收最好。由于本項(xiàng)目設(shè)定的營(yíng)養(yǎng)期為植株尚未長(zhǎng)到最終高度的時(shí)期，且本論文各類型均只涉及一個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品，因此有必要對(duì)更多的紫蘇種質(zhì)進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)期至開(kāi)花期的主要特征成分含量變化的研究，以確定最佳的采收時(shí)間，以及適合的采收期范圍。

各化學(xué)型類別不受生長(zhǎng)發(fā)育影響，表明遺傳因素決定了化學(xué)型。PA和PK型的特征成分和主要成分相對(duì)含量都比較穩(wěn)定，而PL型的特征成分隨生長(zhǎng)發(fā)育大幅度降低，倍半萜類成分和芳香類成分的相對(duì)含量在生長(zhǎng)發(fā)育期呈現(xiàn)較大變化，而且組成中還存在大量各類成分代謝的上游化合物，表明該化學(xué)型可能具有原始性和多變性。

一天之中，PA型特征成分紫蘇醛相對(duì)含量各個(gè)時(shí)期基本上從早到晚逐漸降低，D-檸檬烯相對(duì)含量早晨較傍晚高。PK型特征成分紫蘇酮在營(yíng)養(yǎng)期和開(kāi)花期中午相對(duì)含量高于早晚樣品，果熟期則相反。PL型特征成分紫蘇烯相對(duì)含量在營(yíng)養(yǎng)期和果熟期都是中午最高，開(kāi)花期則是傍晚樣品最高。

揮發(fā)油中組分的含量無(wú)論是隨生長(zhǎng)發(fā)育還是一天的變化包括了合成、降解、轉(zhuǎn)化和散發(fā)幾個(gè)同時(shí)作用的過(guò)程，本研究通過(guò)對(duì)3個(gè)紫蘇單萜類化學(xué)型組成變化的初步研究有助于找到一些特殊的類型和變化階段，為后續(xù)深入的合成生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

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