藥效學(xué)結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)選參連顆粒劑的醇提工藝

王敏+杜守穎+陳笑南+田志浩+陸洋+白潔+武慧超+張勤帥+萬潔

[摘要] 對參連方中醇提部分工藝進(jìn)行優(yōu)選。在以致豚鼠心律失常時(shí)哇巴因的消耗量為藥效指標(biāo)，考察全方水提，全方水提醇沉，黨參等水提醇沉，丹參等醇提和黨參等水提、丹參等醇提4種不同提取工藝路線的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以不同實(shí)驗(yàn)方案的出膏率及丹酚酸B、丹參酮ⅡA、小檗堿3種指標(biāo)成分的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)因素對醇提部分提取工藝的影響，應(yīng)用綜合評(píng)分法優(yōu)選最佳提取工藝，并進(jìn)行工藝驗(yàn)證試驗(yàn)。所得最佳提取工藝為加入60%乙醇共提取2次，分別加入10，9倍量、提取2.0 h，丹酚酸B、丹參酮ⅡA、小檗堿提取量分別為42.01，0.41，40.15 mg·g-1。優(yōu)選的工藝穩(wěn)定、可行，可為參連顆粒的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 參連方； 醇提； 正交試驗(yàn)； 多指標(biāo)加權(quán)綜合評(píng)分法

[Abstract] To optimize the ethanol extraction process for Shenlian formula. On the basis of the pharmacodynamics index for different extraction process routes， the contents of salvianolic acid B， tanshinone ⅡA and berberine， as well as the extraction ratio in different experimental schemes were used as the ethanol extraction examining indexes， and multi-criterion synthesizing grading method was used for data analysis to optimize and verify the ethanol-extraction process conditions in orthogonal experiment. The optimum ethanol extraction process was as follows： adding 60% ethanol， 10 times amount， extracting for 2.0 h each time for a total of 2 times. This extraction process showed good stability and availability.

[Key words] Shenlian formulaion； ethanol-extraction； orthogonal test； multi-index comprehensive weighted score evaluation

參連方為北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院經(jīng)驗(yàn)方，由丹參、黃連、川芎等11味藥組成，具有益氣活血、清熱化痰、安神復(fù)脈的功效，用于治療冠心病室性期前收縮屬氣虛血瘀、痰熱擾心證，癥見心悸心煩、怕熱喜凉、氣短、舌暗苔膩。該方臨床效果顯著：2010—2013年使用該方治療的總有效率為82.2%，前期研究表明，其具有明顯抗烏頭堿、氯化鈣和異丙腎所致大鼠心律失常作用[1-2]。

因該方臨床治療效果顯著，本課題組擬按照《藥品注冊管理辦法》的要求，對參連處方進(jìn)行新藥開發(fā)。藥效學(xué)試驗(yàn)對處方工藝路線進(jìn)行了初選，對方中醇提部分丹參、黃連、川芎、遠(yuǎn)志等藥味的提取工藝進(jìn)行研究，選擇丹酚酸B、丹參酮ⅡA、小檗堿為考察指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，采用多指標(biāo)加權(quán)評(píng)分法優(yōu)選最佳提取工藝。為參連顆粒的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料

LC-20AD島津高效液相色譜儀（SPD-M20A，PDA檢測器，LC Solution色譜工作站）；Purospher RP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；賽多利斯BT 25S電子分析天平（北京賽多利斯公司，1/10萬）；KQ5200型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；SHB-Ⅲ型水循環(huán)多用真空泵（上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；FE20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；ZNHW型智能控溫電熱套（北京中儀泓瑞科技發(fā)展有限公司）；DZF-6051真空干燥箱（利康達(dá)圣科技發(fā)展有限公司）。

丹酚酸B對照品（批號(hào)111562-201313，純度97.0%），丹參酮ⅡA（批號(hào)110766-200619，純度98.0%），鹽酸小檗堿對照品（批號(hào)110713-201212；86.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院。

處方中丹參、黃連、川芎等飲片均購自北京本草方源藥業(yè)有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定均符合2015年版《中國藥典》飲片標(biāo)準(zhǔn)，含量測定結(jié)果均合格。

乙腈（Fisher公司，色譜級(jí)）；磷酸（TED公司，色譜純）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；哇巴因（Sigma-Aldrich公司）磷酸二氫鉀、十二烷基硫酸鈉等固體試劑為分析級(jí)；其他試劑為色譜級(jí)；95%藥用乙醇（北京高華偉業(yè)食品添加劑有限公司）。

普通級(jí)豚鼠60只，體重240～320 g，北京芳元緣養(yǎng)殖場，許可證號(hào)SCXK（京）2009-0014。

2 方法

2.1 丹酚酸B、丹參酮ⅡA、小檗堿含量測定的色譜條件[3]

丹酚酸B：乙腈-0.1%磷酸（22∶78），檢測波長286 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積為10 μL，流速1.2 mL·min-1，色譜圖見圖1。

丹參酮ⅡA：流動(dòng)相A為乙腈，B為0.02%磷酸，梯度洗脫（0～6 min，39%B；6～20 min，39%～10%B；20～20.5 min，10%～39%B；20.5～25 min，39%B），流速1.0 mL·min-1，檢測波長270 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣體積20 μL。隱丹參酮、丹參酮Ⅰ含量測定方法同丹參酮ⅡA：以丹參酮ⅡA對照品為參照，以其相應(yīng)峰為S，計(jì)算隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的相對保留時(shí)間，相對保留時(shí)間應(yīng)在該規(guī)定值的±5%。以丹參酮ⅡA的峰面積為對照，分別乘以校正因子，計(jì)算隱丹參酮、丹參酮Ⅰ含量。隱丹參酮：相對保留時(shí)間為0.75S，校正因子1.18；丹參酮Ⅰ：相對保留時(shí)間為0.79S，校正因子1.31，色譜圖見圖2。

小檗堿：流動(dòng)相乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀（50∶50，每100 mL中加入十二烷基硫酸鈉0.4 g，磷酸調(diào)pH 3.85），檢測波長345 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積10 μL，流速1.0 mL·min-1。表小檗堿、黃連堿、巴馬汀含量測定方法同小檗堿：以小檗堿的峰面積為對照，計(jì)算表小檗堿、黃連堿、巴馬汀的含量，用待測成分相對保留時(shí)間確定峰的位置。與小檗堿的保留時(shí)間T對照，則表小檗堿、黃連堿、巴馬汀的相對保留時(shí)間分別為0.71T，0.78T，0.91T。相對保留時(shí)間在規(guī)定值的±5%，色譜圖見圖3。

2.2 哇巴因致豚鼠心律失常試驗(yàn)及指標(biāo)成分含量測定

2.2.1 分組與給藥 動(dòng)物隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為對照組（生理鹽水組），參連提取物Ⅰ（水提組），參連提取物Ⅱ（水提醇沉組），參連提取物Ⅲ（黨參等水提醇沉，丹參等醇提組），參連提取物Ⅳ（黨參等水提，丹參等醇提組）。豚鼠麻醉后，經(jīng)十二指腸給藥。給藥60 min后，分離左側(cè)頸外靜脈，以微量注射泵恒速給入哇巴因（100 g·mL-1，0.1 mL·min-1），觀察動(dòng)物出現(xiàn)室性早搏、室性心動(dòng)過速（室動(dòng)過速）、心室顫動(dòng)及心臟停搏的時(shí)間，并計(jì)算哇巴因消耗量。

2.2.2 提取物含量測定 取浸膏約0.1 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加入甲醇5 mL，超聲20 min，甲醇定容至刻度線，混勻，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，測定丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿的含量。

2.3 正交試驗(yàn)

2.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 對處方中丹參、黃連、川芎等飲片進(jìn)行乙醇回流提取，設(shè)置乙醇濃度、乙醇倍量、提取時(shí)間、提取次數(shù)3個(gè)因素，采用L9（34）正交表設(shè)計(jì)優(yōu)選最佳提取工藝。因素水平表見表1。

2.3.2 吸醇倍量考察 稱取處方量的丹參、黃連、川芎等飲片，加入6倍量不同濃度乙醇，密封浸泡12 h，濾過，量取濾液體積，平行操作3份，考察飲片的吸醇倍量。

2.3.3 正交試驗(yàn) 稱取處方量的醇提組飲片，按照正交方案表進(jìn)行試驗(yàn)。加熱回流提取，濾過，合并濾液，濃縮，將濃縮液定容至1 000 mL，混勻，取樣離心，過0.45 μm微孔濾膜進(jìn)行含量測定。加權(quán)公式為M=（0.5O/Omax+0.2P/Pmax +0.3Q/Qmax）×100（O為小檗堿，P為丹參酮ⅡA，Q為丹酚酸B，Omax，Pmax，Qmax分別為各成分的最高含量）對指標(biāo)性成分的含量進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)分析軟件為SAS 8.2。

另取處方量藥液，濃縮至清膏，轉(zhuǎn)移至已知質(zhì)量的蒸發(fā)皿，水浴濃縮至稠膏，至真空干燥箱中，60 ℃，0.09 MPa條件下減壓干燥，稱重，計(jì)算出膏率。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 將軟件分析出的最佳工藝組合和正交表綜合評(píng)分最高的組分別進(jìn)行提取。提取方法同2.3.3項(xiàng)下方法，含量測定方法同2.1。對于提取次數(shù)為3次的，采取合并前2次提取液定容至1 000 mL，第3次單獨(dú)定容至400 mL，分別進(jìn)行含量測定。3次提取含量為前2次測得的含量與第3次的含量之和。每組平行3份。

3 結(jié)果

3.1 藥效試驗(yàn)

提取物Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ含生藥量分別為3.26，4.36，3.67，3.04 g·g-1，為使豚鼠所給生藥劑量相等，提取物Ⅰ組給予1.86 g·kg-1，Ⅱ組1.38 g·kg-1，Ⅲ組1.66 g·kg-1，Ⅳ組2.00 g·kg-1，折合生藥量均為6.0 g·kg-1。哇巴因?yàn)橹滦穆墒С５乃幬?，與對照組（模型組）比較，參連不同工藝組發(fā)生室性早搏、室動(dòng)過速、心室顫動(dòng)及心臟停搏等各種不同程度心律失常時(shí)哇巴因消耗量均明顯增加（P<0.05或P<0.01），但是各組之間無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明參連方對哇巴因致豚鼠心律失常具有顯著效果，見表2。

3.2 各組提取物含量

因醇提部分飲片有效成分含量測定為工藝Ⅲ和Ⅳ較高，即單獨(dú)醇提取較優(yōu)，見表3。水提部分Ⅳ（水提）較Ⅲ（水提醇沉）有效成分含量較高，轉(zhuǎn)移率也較高。藥效學(xué)雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但Ⅳ具有明顯變好的趨勢，優(yōu)選工藝Ⅳ，即黨參等部分飲片水提取，丹參等部分醇提取，并對醇提取部分進(jìn)行優(yōu)化。

3.3 正交出膏率測定

正交試驗(yàn)方案出膏率的測定結(jié)果見表4，出膏率最大為3號(hào)，最小為1號(hào)。

3.4 吸收溶劑倍量考察

飲片可吸取自身質(zhì)量1倍的溶劑量，見表5。

3.5 正交試驗(yàn)

按照正交表方案進(jìn)行試驗(yàn)，測定各成分的含量，含量結(jié)果以每克飲片提取出成分的質(zhì)量表示，以綜合值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表6，方差分析見表7。方差分析結(jié)果表明，A（乙醇濃度）、B（乙醇倍量）、C（提取時(shí)間）與D（提取次數(shù)）均有較顯著性影響，故選擇A2B2C3D3，與正交表含量最高3號(hào)A1B3C3D3進(jìn)行驗(yàn)證。

3.6 驗(yàn)證工藝

按照A2B2C3D3、A1B3C3D3因素水平表進(jìn)行驗(yàn)證，提取方法同2.3.3。含量測定同2.1項(xiàng)下方法。含量測定結(jié)果見表8，軟件分析結(jié)果見表9。3份樣品含量測定結(jié)果無明顯差異，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果表明，A2B2C3D3與A1B3C3D3無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。根據(jù)生產(chǎn)成本，選擇使用乙醇濃度較低的，選擇A1B3C3D3，比較煎煮2次和煎煮3次，即A1B3C3D3和A1B3C3D2，無顯著型差異，故選擇煎煮2次，即A1B3C3D2。即最終選擇60%乙醇，第1次加入10倍量，煎煮2.0 h，第2次加入9倍量，煎煮2.0 h，共煎煮2次。

4 討論

參連方由11味中藥組成，處方較大，主要以黨參、丹參、黃連、赤芍、白芍為主，治療冠心病室性期前收縮導(dǎo)致的心律失常，臨床應(yīng)用形式為湯劑。故設(shè)計(jì)工藝Ⅰ（全方水提）；為減少出膏率，富集有效成分，設(shè)計(jì)工藝Ⅱ（全方水提醇沉）；因黨參、白芍、赤芍、甘草等主要藥效成分在水中溶解度較大，丹參等藥效成分在水中溶解度較大[4-7]，故設(shè)計(jì)工藝Ⅳ（黨參等水提，丹參等醇提）為減少水提出膏率，設(shè)計(jì)工藝Ⅲ（黨參等水提醇沉，丹參等醇提）。通過藥效學(xué)初選提取工藝路線。2015年版《中國藥典》丹參含量測定內(nèi)容為丹酚酸B（單獨(dú)測定），丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ（一測多評(píng)），黃連測定內(nèi)容為小檗堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬?。ㄒ粶y多評(píng)），故在工藝路線篩選時(shí)對這幾種成分均進(jìn)行了含量測定。正交試驗(yàn)中，為減少加權(quán)評(píng)分時(shí)的復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)選擇了與藥效相關(guān)性較強(qiáng)，且含量較高的君藥和臣藥中的成分丹酚酸B、丹參酮ⅡA、小檗堿為工藝優(yōu)選的指標(biāo)成分[8-9]。

丹酚酸B穩(wěn)定性較差[10]，為避免長時(shí)間干燥對指標(biāo)成分含量測定的影響，實(shí)驗(yàn)中采取提取液濃縮至一定程度后，定容到一定體積，直接進(jìn)行含量測定。正交綜合評(píng)分中，因各成分的含量不在一個(gè)數(shù)量級(jí)別，采取歸一化法進(jìn)行加權(quán)評(píng)分，丹酚酸B和丹參酮ⅡA均為丹參飲片成分，故二者共賦0.5，又丹酚酸B較丹參酮ⅡA治療冠心病療效更顯著，所以丹酚酸B權(quán)重系數(shù)為0.3，丹參酮ⅡA為0.2。雖然正交試驗(yàn)篩選結(jié)果均為提取3次，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)提取便捷性，在不影響藥效成分含量的前提下，應(yīng)盡可能減少提取次數(shù)，故對提取3次和2次進(jìn)行了比較。結(jié)果表明提取2次和3次指標(biāo)成分含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，最終選擇提取2次[11]。通過實(shí)驗(yàn)研究，本文確定了參連顆粒劑的醇提組最佳工藝，為后續(xù)的制劑工藝研究奠定了基礎(chǔ)。

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