磁納米粒子對Vs55溶液反玻璃化等溫結晶行為的影響

于紅梅，胥義，柳珂，鈕怡清，程新

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磁納米粒子對Vs55溶液反玻璃化等溫結晶行為的影響

于紅梅1，胥義1，柳珂2，鈕怡清2，程新2

（1上海理工大學生物系統(tǒng)熱科學研究所，上海200093；2上海理工大學制冷技術研究所，上海 200093）

借助差示掃描量熱儀（DSC）和低溫顯微系統(tǒng)，研究了磁納米粒子對典型玻璃化溶液Vs55在反玻璃化過程中等溫結晶行為的影響。結果表明：（1）磁納米粒子經(jīng)過羧酸（CA）和聚乙二醇（PEG）表面修飾后，對Vs55溶液的玻璃化轉變溫度（g）幾乎沒有影響，但對其反玻璃化轉變溫度（d）和反玻璃化結晶焓（Hd）影響較大；（2）在Vs55的反玻璃化溫區(qū)范圍內(nèi)（-85～-60℃），隨著等溫溫度的升高和降溫速率的增大，經(jīng)CA修飾的磁納米粒子均會顯著促進Vs55的反玻璃化現(xiàn)象，在-85℃等溫時的冰晶生長速率為0.37 μm·s-1，-75℃等溫時則為2.19 μm·s-1，而當降溫速率從2℃·min-1增大到100℃·min-1時（在-75℃等溫結晶），其反玻璃化冰晶生長的速率由1.72 μm·s-1增大到3.54 μm·s-1；（3）與Vs55相比，兩種修飾均明顯促進了其反玻璃化，在-80℃等溫結晶時，Vs55溶液的生長速率為0，而CA和PEG修飾分別達到了1.04 μm·s-1和2.31 μm·s-1；與CA修飾相比，PEG修飾后的磁納米粒子更加促進了Vs55溶液的反玻璃化現(xiàn)象，在-85℃等溫時的冰晶生長速率為0.62 μm·s-1，而-75℃等溫時則達到了6.25 μm·s-1，這個結果也充分說明了磁納米粒子表面修飾物質的不同必定會顯著影響Vs55的反玻璃化結晶生長。

結晶；納米粒子；動力學；反玻璃化；Vs55

引 言

實現(xiàn)較大體積生物組織、器官等的長期低溫保存，是目前臨床應用上一個亟待解決的關鍵性問題[1]。迄今為止，玻璃化仍然是細胞、組織或器官長期低溫保存的最好方式[2-3]，已被成功應用于精子、胚胎等的保存，并且獲得了很好的臨床效果[4-6]。但對于較大體積（特征尺寸大于1 mm[7]）的生物組織或器官，至今還沒有在臨床上得到廣泛應用，其主要瓶頸是玻璃態(tài)生物樣本在傳統(tǒng)復溫過程中存在加熱不均勻的現(xiàn)象，并由此引起的熱應力[8-11]和反玻璃化損傷[11-13]。因此，尋求一種快速而均勻的復溫方式是解決此問題的關鍵所在。

長期以來，研究者們對深低溫保存生物樣品的復溫方式進行了大量探索[4-6,14]。從文獻調研來看，主要是采取兩種復溫方式，即外邊界熱源加熱[4]和體積熱源加熱[15]。對于外邊界熱源加熱，由于其傳熱方式的局限性，使得在復溫過程中樣品內(nèi)部溫度分布不均勻而產(chǎn)生熱應力，最終導致生物組織發(fā)生宏觀斷裂[16]。相比較外邊界熱源加熱，體積熱源加熱方式具有加熱均勻和快速的優(yōu)點，其中研究最多的是微波加熱[17-20]。近30多年來，已有許多研究者針對此方法進行了大量探索，但由于趨膚效應、場強的衰減、生物材料介電常數(shù)隨溫度發(fā)生變化等諸多因素的影響，冷凍生物材料微波復溫過程中仍然存在溫度不均勻的問題[17-20]。最近，Wang等[21]通過數(shù)值模擬研究，認為冷凍生物材料中預包埋超順磁納米粒子后，再借助微波加熱方法，很有可能改善較大體積冷凍生物材料微波加熱不均勻的問題。美國科研人員首次進行了基于射頻誘導磁納米粒子快速復溫冷凍溶液的初步探索，并認為這是一種極有可能實現(xiàn)較大器官的快速均勻解凍方法[22]。總體來看，借助磁熱復溫的研究還處于初步探索階段，還有許多科學問題亟待研究。例如，磁納米粒子是否能在生物樣本中均勻分布；磁納米粒子對生物組織中冰晶成核和生長的影響程度的大小等。

鑒于此，本文借助低溫顯微系統(tǒng)，重點觀察磁納米粒子對典型玻璃化溶液Vs55在反玻璃化過程中冰晶生長情況的影響，以期為后續(xù)篩選合適的磁納米粒子奠定重要基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Vs55是一種廣泛使用的低溫保護劑溶液，在冷凍過程中非常有利于形成玻璃態(tài)[4]。其濃度為8.4 mol·L-1，由二甲基亞砜（3.1 mol·L-1）、甲酰胺（3.1 mol·L-1）、1,2-丙二醇（2.2 mol·L-1）和EuroCollins溶液配制而成。磁納米粒子為四氧化三鐵（Fe3O4）納米粒子，分別采用羧酸（carboxylic acid，CA）和聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾，粒徑均為10 nm左右（Sigma-Aldrich，美國）。為便于標注，這兩種修飾后的納米粒子在Vs55溶液中分別記為“Vs55-Fe-CA”和“Vs55-Fe-PEG”?？紤]到臨床安全性要求，實驗采用Fe3O4的濃度為0.1 mg·ml-1[23]。所用實驗試劑除特別注明外，均來自上海國藥集團化學試劑有限公司分析純。

1.2 實驗儀器

對低溫保護劑溶液進行熱分析，采用NETZSCH公司差式掃描量熱儀（DSC200 F3，德國），工作溫度范圍為-170～600℃，升降溫掃描速率為0～100℃·min-1，溫度精度為0.1℃，熱焓精度為99.9%。在每次測試之前，都要進行溫度和靈敏度標定。

低溫顯微觀察采用Linkam公司的低溫顯微系統(tǒng)（BCS196 Biological Cryo—stage，英國），工作溫度范圍為-196～125℃，升降溫掃描速率為0.01～150℃·min-1，圖像采集時間間隔為1 s。

1.3 實驗方法

根據(jù)Vs55溶液的反玻璃化特性[24]，首先利用DSC以10℃·min-1進行升降溫掃描，確定樣品的反玻璃化溫區(qū)，接下來采用低溫顯微系統(tǒng)獲取反玻璃化溫區(qū)的冰晶生長圖像信息。低溫顯微實驗采用降溫速率分別為2、5、10、20、50和100℃·min-1，將樣品降溫到-135℃，在此溫度下等溫2 min，消除熱歷史的影響，然后將樣品以10℃·min-1的升溫速率分別升溫到-85、-80、-75、-70、-65和-60℃下保溫5 min，采集不同等溫溫度下的顯微圖像，圖像采集時間間隔為1 s。

2 結果與討論

2.1 反玻璃化溫區(qū)的確定

圖1所示為溶液體系經(jīng)10℃·min-1降溫至-135℃，再以10℃·min-1升溫的DSC熱流曲線。從熱流曲線中獲得的玻璃化溫度g（glass transition temperature）和反玻璃化溫度d（devitrification temperature）等參數(shù)，如表1所示。從表1可以看出，Vs55溶液與兩種含有磁納米粒子的Vs55溶液的玻璃化轉變溫度g幾乎重合，大約在-121℃左右，與文獻值大致相當，這說明磁納米粒子對Vs55的玻璃化轉變溫度幾乎沒有影響。但磁納米粒子對Vs55的反玻璃化轉變溫度d影響程度很大。例如，表1中Vs55的d在-62.29℃左右，Vs55-Fe-CA約為-66.80℃，而Vs55-Fe-PEG則降低到-74.10℃，其對應的反玻璃化結晶焓值（Hd）也呈顯著增大的特點。這一結果充分說明磁納米粒子的表面修飾物質的確會顯著影響Vs55溶液的反玻璃化結晶放熱量。

表1 樣品特征轉變溫度和反玻璃化結晶焓值

基于以上測試結果，為確保后續(xù)低溫顯微觀察實驗的順利進行，選擇反玻璃化溫區(qū)的范圍為-85～-60℃，并著重觀察此溫區(qū)反玻璃化過程冰晶的生長情況。

2.2 等溫溫度對反玻璃化結晶行為的影響

在討論低溫保護劑的反玻璃化結晶動力學時，常常要分析反玻璃化溫區(qū)內(nèi)的等溫溫度對其結晶生長的影響[25]。

圖2(a)所示為等溫溫度分別為-85、-80、-75和-70℃時，經(jīng)過羧酸（CA）修飾磁納米粒子對Vs55反玻璃化溫區(qū)冰晶生長的影響(升降溫速率為10℃·min-1)。對其冰晶尺寸測量結果如圖2(b)所示，其中，在-70℃等溫時的冰晶生長速度非常快，且過于密集，導致無法測量單個冰晶生長的直徑，因此在圖2(b)中并未呈現(xiàn)其數(shù)據(jù)。

從圖2(a)中可以看出，隨著等溫溫度的升高，復溫過程初始狀態(tài)的冰晶尺寸增大，且冰晶密度增大。而從圖2(b)可知，在-85℃等溫，180 s時的冰晶尺寸從0增大到70.80 μm，而在-75℃等溫，其尺寸從72.82 μm增大到468.30 μm。因此，隨著等溫溫度的升高，冰晶的生長速度會顯著增大，且呈典型的線性增長，采用式(1)進行數(shù)據(jù)擬合。

(1)

很明顯，在-85℃等溫時，其冰晶生長速率（圖中擬合直線的斜率值）只有0.37 μm·s-1，而在-80℃和-75℃等溫時，其生長速率分別顯著提高到1.04 μm·s-1和2.19 μm·s-1。這充分說明了在反玻璃化溫區(qū)的等溫溫度越高，其反玻璃化過程冰晶的生長能力越強，溶液反玻璃化現(xiàn)象越明顯。

事實上，玻璃態(tài)溶液復溫過程中的溫度越接近反玻璃化峰溫d，則反玻璃化結晶程度越顯著[1]。而從表1可知，經(jīng)羧酸（CA）修飾的磁納米粒子使得Vs55溶液體系的反玻璃化溫度峰溫d降為-66.80℃。所以，在低于d的溫度范圍內(nèi)，等溫溫度越高，冰晶生長能力越強，這樣也解釋了圖2(a) 中-70℃等溫時冰晶快速生長的原因。

2.3 降溫速率對反玻璃化溫區(qū)結晶行為的影響

一般認為，降溫速率對溶液的玻璃化程度影響至關重要，同時也對其復溫過程的反玻璃化程度有非常重要的影響[26]。將Vs55-Fe-CA溶液體系以不同的降溫速率降溫至-135℃后，再以10℃·min-1升溫至-75℃等溫，觀察其反玻璃化冰晶生長現(xiàn)象，如圖3(a)所示。

從圖3(a)可以看出：隨著降溫速率的增大，冰晶的密度呈現(xiàn)先增大后減小又增大的趨勢，導致這種現(xiàn)象的原因目前尚不清楚，需要進一步深入研究。對圖3(a)中冰晶生長尺寸測量的結果如圖3(b)所示。其中，當以100℃·min-1降溫時，由于等溫過程的冰晶生長非?？欤?0 s以后就無法測量其直徑，因而圖3(b)中不再呈現(xiàn)其數(shù)據(jù)。

對圖3(b)中各工況下的數(shù)據(jù)按照式（1）進行擬合，得到擬合參數(shù)如表2所示。很顯然，盡管圖3(a)冰晶密度會隨著降溫速率的增大而發(fā)生波動，但表2中和值隨著降溫速率提高而變大，亦即說明冰晶的生長速率是隨著升溫速率提高而增大的。例如，當以2℃·min-1降溫時，冰晶初始直徑為48.72 μm，冰晶生長速率為1.72 μm·s-1，而以100℃·min-1降溫時，這兩個值則分別為124.41 μm和3.54 μm·s-1。綜上，在Vs55中添加磁納米粒子后，隨著降溫速率的增加，其反玻璃化溫區(qū)的冰晶生長能力增強，反玻璃化現(xiàn)象越發(fā)顯著。但是已有研究表明[27-28]：降溫速率越快，越是有利于避免Vs55玻璃態(tài)的反玻璃化現(xiàn)象。很顯然，在Vs55中添加磁納米粒子后，降溫速率對Vs55的反玻璃化影響趨勢與以上文獻呈現(xiàn)出相反的結果。目前還沒有相關文獻報道，亟待進一步探究其根本原因。

表2 不同降溫速率下Vs55-Fe-CA冰晶生長擬合系數(shù)（-75℃）

Note: CR/WR represents cooling rate/warming rate.

2.4 磁納米表面改性對反玻璃化結晶行為的影響

有研究表明，對非磁性納米粒子進行表面改性后，有可能影響溶液中納米粒子和羥基之間氫鍵的形成，這很可能影響其凍結過程的結晶行為[29]。因此，本部分重點觀察了采用羧酸（CA）和聚乙二醇（PEG）修飾后的磁納米粒子對Vs55溶液在反玻璃化溫區(qū)結晶行為的影響。

圖4（a）、圖5（a）和圖6（a）分別為Vs55 (Ⅰ)、Vs55-Fe-CA (Ⅱ) 以及Vs55-Fe-PEG (Ⅲ) 3種溶液體系在不同溫度下的（分別為-85℃、-80℃和-75℃）等溫結晶生長情況（升降溫速率均為10℃·min-1）。顯然，在這3個溫度下，Vs55溶液均無冰晶的形成和生長。一旦添加了經(jīng)CA和PEG修飾的磁納米粒子后，在反玻璃化溫區(qū)均出現(xiàn)了明顯的冰晶生長現(xiàn)象，且經(jīng)過CA修飾的冰晶密度小于經(jīng)過PEG修飾的冰晶密度。

圖4（b）、圖5（b）和圖6（b）分別呈現(xiàn)了等溫過程冰晶的尺寸變化情況。在-85℃等溫時，Vs55-Fe-CA中還沒有冰晶的出現(xiàn)（即0 μm），而Vs55-Fe-PEG在此溫度下冰晶的直徑已經(jīng)達到了21.40 μm；而直接復溫到-75℃等溫時，兩者的初始冰晶尺寸分別為72.82 μm和207.13 μm。很顯然，在相同的等溫結晶溫度下，Vs55-Fe-PEG體系的反玻璃化冰晶生長速率明顯高于Vs55-Fe-CA體系。這些結果說明PEG修飾磁納米粒子對Vs55反玻璃化結晶的影響更明顯。這與表1中DSC測量的Vs55-Fe-PEG修飾的反玻璃化結晶焓值（41.46 J·g-1）高于Vs55-Fe-CA修飾（25.26 J·g-1）是一致的。

以上結果充分說明：一旦在Vs55中添加磁納米粒子后，反玻璃化區(qū)間的結晶現(xiàn)象更為明顯，此外，納米粒子表面修飾物質種類對其溶液體系的反玻璃化結晶程度影響也是有顯著差異的。

目前，有關納米粒子對冰晶生長機理研究的文獻還不多，且都局限于非磁性納米粒子。呂?？鄣萚30]的研究認為，納米微粒改變了低溫保護劑溶液的熱擴散系數(shù)、黏度等物性參數(shù)，進而影響了凍結過程組成晶格的速率。依此觀點，本文中使用的磁納米粒子也可能改變Vs55溶液體系的熱擴散系數(shù)、黏度等，使冰晶的生長速率增加。與此同時，添加磁納米粒子后，改變了原有溶液體系凍結過程的結晶成核條件，降低了Vs55溶液成核所需要的Gibbs自由能，為晶胚的形成提供了場所，所以更加容易形成冰晶。這就不難解釋為何添加磁納米粒子后，促進了Vs55溶液體系的反玻璃化結晶程度。

至于納米粒子表面改性對低溫保護劑溶液結晶影響的機理研究，目前還鮮有文獻報道。不過，從圖7可以看出，PEG兩端含有大量羥基，而CA則有1個羥基和1個甲基。已有研究認為[31-32]，甲基保護效果要好于羥基，主要是因為甲基與甲基之間沒有相互作用，而只與水鍵合，而羥基除了與水鍵合外，自身也有鍵合，必然減少了溶質與溶劑之間鍵合的機會，從而會弱化對冰晶的抑制效果，只有那些與水分子形成氫鍵的羥基才是低溫保護所需要的羥基。而且，最近也有研究表明[29]：CA中存在的羧基可以促進溶液中磁納米粒子和羥基之間氫鍵的形成?；谝陨线@些理論分析，不難解釋為何上述實驗中PEG修飾磁納米粒子更能促進Vs55反玻璃化結晶的程度了。不過，進行磁納米粒子表面修飾物種類對典型玻璃化溶液反玻璃化的影響程度（包括抑制或是促進）的深入研究，是開展磁熱快速復溫深低溫保存生物樣本的關鍵基礎問題之一，亟需系統(tǒng)性的深入研究。

3 結 論

采用差示掃描量熱儀（DSC）和低溫顯微系統(tǒng)，結合等溫結晶動力學的研究方法，較為系統(tǒng)地探索了在Vs55中添加磁納米粒子的反玻璃化結晶現(xiàn)象，得到以下主要結論。

（1）DSC的研究結果表明，本文所采用的磁納米粒子對Vs55的玻璃化轉變溫度幾乎沒有影響，但對其反玻璃化溫度和結晶焓值有較為顯著的影響。

（2）在反玻璃化溫區(qū)，等溫溫度越高，冰晶生長速率越大；并且，隨著降溫速率的增大，含磁納米粒子的Vs55溶液體系的反玻璃化現(xiàn)象越明顯，相關機理還有待進一步研究。

（3）磁納米粒子的表面改性對Vs55溶液的反玻璃化現(xiàn)象有較為顯著的影響。這充分說明研究磁納米粒子的表面改性材料是探索冷凍生物材料磁熱復溫的關鍵因素之一。

符 號 說 明

B——初始冰晶尺寸，μm K——冰晶的生長速率，μm·s-1 t——時間，s X——冰晶尺寸，μm

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Effect of magnetic nanoparticles on isothermal crystallization behaviors of devitrified Vs55

YU Hongmei1, XU Yi1, LIU Ke2, NIU Yiqing2, CHENG Xin2

(1Institute of Biothermal Science and Technology,University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China;2Institute of Refrigeration Technology, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China)

The effect of magnetic nanoparticles(MNPs) on the devitrification isothermal crystallization of typical vitrification solution Vs55 in the process of glass crystallization was systematically explored by Differential Scanning Calorimetry (DSC) and cryomicroscope system. The results show that: (1)The MNPs coated by both Carboxylic Acid (CA) and Polyethylene Glycol (PEG) have little effect on the glass transition temperature(g) of Vs55, but significant effect on the devitrification transition temperature(d) and devitrification enthalpy(Hd)；(2)At the range of the devitrification area (-85～-60℃), the MNPs coated by CA can significantly promote the devitrification of Vs55 as increasing of the isothermal temperatures and the cooling rates, and the ice growth rate was 0.37 μm·s-1at the isothermal temperature of-85℃, but it is about2.19 μm·s-1for-75℃. Also, the ice growth rates raised from 1.72 μm·s-1to 3.54 μm·s-1when the cooling rates were increased from 2℃·min-1to 100℃·min-1(at the isothermal temperature of-75℃); (3) Compared with Vs55, magnetic nanoparticles coated by both PEG and CA could promote the devitrification of Vs55. The crystal growth rates at the isothermal temperature of-80℃were 0 for Vs55, but 1.04 μm·s-1and 2.31 μm·s-1for CA and PEG respectively. Compared with CA coating, the MNPs coated by PEG promoted the much more devitrification of Vs55, and the ice growth rates were 0.62 μm·s-1and 6.25 μm·s-1for the isothermal temperature of-85℃ and-75℃, respectively, which means that the surface coating of MNPs can significantly affect the crystallization of Vs55.

crystallization; nanoparticles; kinetics; devitrification; Vs55

10.11949/j.issn.0438-1157.20161440

O 63

A

0438—1157（2017）03—1262—07

國家自然科學基金項目（51576132）。

2016-10-11收到初稿，2016-11-24收到修改稿。

聯(lián)系人：胥義。第一作者：于紅梅（1989—），女，碩士研究生。

2016-10-11.

Prof.XU Yi, xuyi@usst.edu.cn

supported by the National Natural Science Foundation of China (51576132).