小麥品種高原115花青素合成代謝的特點(diǎn)

朱雪冰+趙鑫+李建民+魏樂

摘 要：紫色籽粒小麥品種高原115已于2001年通過審定，并在中國西北春麥區(qū)進(jìn)行示范推廣，但目前關(guān)于該品種的花青素合成生理特性研究甚少。本研究以紫色籽粒小麥高原115和白色籽粒小麥opata為材料，通過對紫粒小麥高原115和白粒小麥在花青素類化合物化學(xué)組織、物質(zhì)結(jié)構(gòu)差異、籽粒發(fā)育過程中花青素含量的變化以及對外界環(huán)境反應(yīng)的研究，從而了解高原115紫色籽粒中花青素合成的特點(diǎn)，更好地利用現(xiàn)有品種，為克隆小麥紫色籽?；ㄇ嗨睾铣傻年P(guān)鍵基因打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：紫粒小麥；高原115；花青素；合成代謝

花青素是一種植物特有的水溶性色素，是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物。目前，育種家們已從小麥中選育出了幾種不同籽粒顏色的小麥（紅、紫、黑、藍(lán)），但對其色素形成的代謝途徑及遺傳機(jī)理尚不清楚。本研究的目的是以紫色籽粒小麥品種高原115為主要試驗材料較為系統(tǒng)地分析控制小麥籽粒中花青素積累的生理機(jī)制。

光是影響花青素合成與積累的主要因素之一，它主要從影響植物的形態(tài)建成和生長代謝以及通過激活花青素代謝過程中的調(diào)控酶類，以促進(jìn)花青素的合成。

采用冰凍切片，對紫色籽粒小麥品種高原115花青素的化學(xué)組織進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)高原115籽粒的花青素定位于果皮和種皮。利用HPLC技術(shù)，從高原115籽粒中分離得到五種不同的花青素類化合物，測定高原115與Opata（白粒小麥）開花后籽粒中花青素含量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高原115籽粒中花青素含量高于Opata（白粒小麥）。高原115籽粒中花青素合成開始于開花后14天，到開花后28天籽粒中花青素含量達(dá)到最大。通過研究光對開花后不同時期籽粒花青素合成的影響，揭示了光在高原115紫色籽?；ㄇ嗨睾铣芍械淖饔?。結(jié)果表明光對高原115籽粒的花青素合成具有誘導(dǎo)作用，并影響成熟籽粒的花青素含量。

一、材料與方法

1.材料

紫色籽粒小麥高原115由中國科學(xué)院西北高原生物研究所選育并提供；Opata 由International Triticeae Mapping Initiative（ITMI）惠贈。

2.實(shí)驗方法

（1）冰凍切片。將樣品室的溫度調(diào)整到-20℃并切割樣品到合適的大小，激活Peltier，靜置40秒至制冷機(jī)達(dá)到最大制冷輸出，室溫條件下將足夠的cryocompound添加到樣品盤上，將樣品盤置于快速冷凍架上，使樣品冷凍至低溫。樣品在冷凍過程中，首先將從周邊開始變白，直至中央留下綠豆大小的反光區(qū)，并且會很快隨之消失。此時可將樣品盤插入至切片機(jī)的樣品孔中，在切樣之前應(yīng)先將手輪的手柄鎖死，然后用刀的安全擋板擋住刀刃，且擰松樣品頭的螺絲。將樣品盤的柄插入到樣品頭的定位孔，需保證樣品盤的柄徹底插入到樣品頭的孔中，且與樣品頭充分接觸，擰緊螺絲，將刀插入刀架，且需夾緊刀片；調(diào)整刀架上的角度至2℃且調(diào)整刀架，使其與樣品相對，除去安全擋板，解鎖手輪，旋轉(zhuǎn)手輪將樣品修正到合適的大小。將切片厚度調(diào)整至15?m，勻速轉(zhuǎn)動手輪進(jìn)行切片。將完整的切片用毛筆挑取至樣品室預(yù)冷的載玻片上，滴入甘油，蓋上蓋玻片，置于Laica顯微鏡下觀察。

（2） 花青素含量測定。

①花青素提取。將單粒種子置于2.0 mL離心管中，加入1 mL 0.1% HCl-methanol （12N HCl ： 99.9% MeOH 1 ： 35），4°C，靜置48小時后，于13000rpm離心15 min，吸取上清（500 ?l），用于花青素含量測定。

②標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱取花青素1 mg （Sigma，43725），并加入0.1% HCl-methanol溶解，定容至25 mL。配成標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10mL并分別置于10 mL容量瓶中，以0.0 mL為空白，分別置于其最大吸收處測定吸收度，以吸收度（A）對濃度（C， ?g/mL）進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程。

③樣品測定。為了補(bǔ)償葉綠素對花青素含量測定的影響，花青素含量計算用公式：A530 -（0.25 × A657）（Hasegawa et al. 2001）。

（3）高效液相色譜（HPLC）。

① 樣品提取。利用液氮將樣品冰凍，并進(jìn)行研磨至變成粉末，加入500 ?l 0.1%鹽酸/甲酸溶液，室溫震蕩器24小時，12000rpm離心20 min，吸取上清，0.45 ?m纖維濾膜過濾。4°C保存。

② 儀器及色譜條件。高效液相色譜分析在WATERS515，監(jiān)測器為WATERS2996PAD，數(shù)據(jù)收集和分析是在WATERS工作站下進(jìn)行（分離柱：C18 反相柱；流動相：1%甲酸（A）和色譜級甲醇（B）；進(jìn)樣量：20 ?l；高壓限制：4000；開始波長： 190 nm；結(jié)束波長： 800 nm；采樣速率： 1.0 mL/min；分離度：1.2）

（4）活體條件下，光對高原115籽粒花青素合成的誘導(dǎo)作用。開花后7天、14天、21天，不同時期將高原115同一穗的同一面或相對的一排籽粒，除其穎殼，使其受到陽光的照射，進(jìn)行光處理（Light），以沒有去除穎殼作為對照，進(jìn)行暗處理（Dark），每個處理6個重復(fù)。24、48、36小時后，取下暗處理和光處理的種子，拍照后-70℃保存，并測定花青素含量。

（5）離體條件下，光對高原115籽?；ㄇ嗨睾铣傻恼T導(dǎo)作用。取開花后14天高原115的籽粒，徒手剝離后平整擺放在培養(yǎng)皿上，將培養(yǎng)皿放置到光照培養(yǎng)間（光強(qiáng)為100 ?mol/s/m2，23 ℃，16 / 8 h）作為光處理（Light）。將培養(yǎng)皿用錫箔紙包裹，放置到光照培養(yǎng)間（光強(qiáng)為100 ?mol/s/m2，23 ℃，16 / 8 h）中作為對照，進(jìn)行暗處理（Dark）。處理7天后，取出籽粒進(jìn)行照相，并進(jìn)行花青素含量的測定。

（6）光對高原115成熟籽?；ㄇ嗨睾康挠绊?。開花后14天，用黑布將高原115幼穗包裹作為暗處理（Dark）的對象，將同一株不同分蘗的幼穗作為對照，進(jìn)行光照處理（Light）。每個處理6次重復(fù)。籽粒成熟后對籽粒按單株收獲進(jìn)行拍照，并進(jìn)行花青素含量測

3.結(jié)果與分析

（1）小麥高原115與Opata成熟籽粒冰凍切片的比較。從圖1冰凍切片比較結(jié)果顯示，高原115籽粒中花青素在果皮及種皮中都有積累，其糊粉層與Opata的顏色相似。Opata中，果皮呈明顯的透明狀，而種皮有明顯的致密顏色發(fā)暗物質(zhì)的存在，可能是黃酮或其它類黃酮類物質(zhì)。

（2） 高原115與Opata籽粒中花青素組分的HPLC分析。對高原115籽粒的花青素進(jìn)行高效液相色譜分析，得到了至少5種不同的花青素類成分，這五種物質(zhì)占到了高原115紫色籽粒色素含量的98%。對這五種物質(zhì)進(jìn)行紫外掃描圖譜分析，發(fā)現(xiàn)都有一個528 nm左右的特征峰，故推斷這五種物質(zhì)是花青素類物質(zhì)。

（3） 高原115與Opata開花后籽?；ㄇ嗨睾孔兓ｉ_花后不同天數(shù)對高原115和Opata籽粒取樣，照相并存放在-70冰箱中，用于測定花青素含量。發(fā)現(xiàn)高原115在14-21天間后開始進(jìn)行花青素的合成，以后顏色逐漸加深，到35天時顏色深度達(dá)到了最大；而Opata沒有明顯的花青素的合成。21天后，高原115與Opata的差異逐漸加大。

（4） 高原115花青素合成受光誘導(dǎo)特性的研究。在高原115種子的發(fā)育過程中，在穗子上去除一排籽粒的穎殼，受到光的照射，而相對側(cè)籽粒則保留穎殼作為暗處理，48小時后取下暗處理和光處理的種子拍照并進(jìn)行花青素含量的測定。從開花后7天開始，籽粒中花青素的合成就能受到光的誘導(dǎo)。隨著籽粒的發(fā)育時間，籽粒受光誘導(dǎo)的活性增強(qiáng)，7天時，光照48小時后僅能使籽粒的胚的周圍產(chǎn)生花青素，花青素含量變化較小。14天時差異增大，受光誘導(dǎo)的高原115籽粒花青素合成顯著上升，花青素合成布滿整粒種子。

高原115籽粒開花后14天，剝離籽粒，平整放置在滅菌的培養(yǎng)皿上。密封好培養(yǎng)皿，放到光照培養(yǎng)間中，7天后觀察籽粒并拍照。光照條件下，籽粒變成了紫紅色，而暗處理的籽粒變成了淡黃色，與Opata成熟籽粒的顏色相似。7天后，離體的種子已經(jīng)失去了大量的水分，并且細(xì)胞已經(jīng)開始死亡。光照處理后的花青素含量比對照增加了33倍，而暗處理的籽?；ㄇ嗨睾颗c對照無明顯差異，所以得出結(jié)論，離體條件下，光照處理促進(jìn)了花青素的合成。

4.討論

本章研究對小麥高原115紫色籽粒中花青素的組織定位、化合物的分離、光誘導(dǎo)特性進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，從而為更好地利用現(xiàn)有品種和克隆花青素合成的關(guān)鍵基因打好基礎(chǔ)。

Abdel-Aal等認(rèn)為紫粒小麥的花青素合成主要在籽粒的果皮。孫群等認(rèn)為河?xùn)|烏麥526的色素分布在糊粉層中，而漯珍l號、黑粒小麥76的色素分布在果皮和種皮中。因為花青素易溶于水和有機(jī)溶劑，所以石蠟切片和樹脂切片在固定的過程中都會將花青素洗脫。前人研究是用徒手切片，難以獲得足夠薄的切片，且所用材料有所差異，所以得到了不同的結(jié)論。本章研究采用冰凍切片的方法，將高原115紫色籽粒的色素定位到籽粒的種皮和果皮。

高建偉等從藍(lán)粒小麥中分離到8種花青素化合物。但以飛燕草素（Delphinidin）和矢車蒲素（Cyanidin）為主。而Hu等從藍(lán)黑小麥河?xùn)|烏麥分離到了分離了6種花青素化合物，以Cyanidin-3-glucoside 為主 。Abdel-Aal 的研究結(jié)果表明紫粒小麥中花青素的主要成分是Cyanidin-3-glycoside 。本研究中初步分離出五種花青素類化合物。對已經(jīng)分離到5種花青素進(jìn)行質(zhì)譜分析，將有利于進(jìn)一步了解紫粒小麥中花青素的種類和分子結(jié)構(gòu)。

光對許多植物的花青素的合成具有誘導(dǎo)作用[2，3，7]，但是在小麥紫色籽?；ㄇ嗨睾铣芍械淖饔脹]有得到研究與證明。本章研究在離體和活體的條件下，對高原115紫色籽?；ㄇ嗨睾铣晒庹T導(dǎo)特性進(jìn)行了研究，得出結(jié)論：光誘導(dǎo)籽粒中花青素的合成。Weiss和Halevy認(rèn)為光對離體花冠的花青素合成至關(guān)重要的，而對活體花冠的花青素的合成起促進(jìn)作用，沒有光花青素仍然能夠合成，這與本章研究相吻合。離體條件下，光對高原115紫色籽粒的花青素合成至關(guān)重要，而活體條件下，高原115籽粒避光后仍有痕量花青素的合成。

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作者簡介：朱雪冰（1992—），女，在讀碩士研究生，主要從事藥用植物研究。

通信作者：李建民，學(xué)士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥用植物研究。

基金項目：中國科學(xué)院知識創(chuàng)新工程重要方向項目：小麥新品種培育及資源高效利用；國家自然科學(xué)基金：典型高產(chǎn)區(qū)小麥產(chǎn)量及其相關(guān)性狀的QTL分析及育種利用（31260322）；中國科學(xué)院西部之光項目。