響應(yīng)面優(yōu)化超聲-微波協(xié)同提取石榴葉中總黃酮工藝的研究

滕井通， 詹小龍， 宮 坤， 薛建平， 段永波， 宋迎春， 盛 瑋*

（1.淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000；2.資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 淮北 235000；3.淮北普豪生物科技有限公司，安徽 濉溪234100）

響應(yīng)面優(yōu)化超聲-微波協(xié)同提取石榴葉中總黃酮工藝的研究

滕井通1，2， 詹小龍1， 宮 坤3， 薛建平1，2， 段永波1，2， 宋迎春1， 盛 瑋*1，2

（1.淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000；2.資源植物生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 淮北 235000；3.淮北普豪生物科技有限公司，安徽 濉溪234100）

為確定石榴葉中總黃酮提取的最佳工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化石榴葉中總黃酮的提取條件。結(jié)果表明：微波功率、提取時(shí)間和料液比對黃酮提取率影響極顯著；最佳工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)71.5%（v/v），微波功率662 W，提取時(shí)間262 s，液料質(zhì)量體積比33.5 g/mL，在此條件下提取1次，石榴葉中總黃酮的提取率為89.21%。

超聲-微波協(xié)同萃取；石榴葉；總黃酮；響應(yīng)面法

石榴葉是石榴科植物石榴（Punica granatum L.）的葉，我國石榴以產(chǎn)果為主，重點(diǎn)產(chǎn)區(qū)有安徽懷遠(yuǎn)、淮北，陜西臨潼，山東棗莊，云南巧家，四川會理和新疆和田等地區(qū)。《圖紀(jì)本草》記載：“榴葉者，主咽喉燥渴、止下利漏精、止血之功能”。據(jù)報(bào)道，已從石榴葉中分離出熊果酸、白樺脂酸、甘露醇、菟單寧以及鞣花單寧、沒食子酸、鞣花酸、短葉蘇木酚、木犀草素4′-O-β-葡萄糖苷、黃酮苷類等20多種化合物[1-3]。其黃酮類物質(zhì)的含量較高[4-5]，而天然植物黃酮類化合物具有降脂、抗心血管疾病、消除自由基及抗氧化、抗骨質(zhì)疏松、防癌抗癌等作用[6-8]，可廣泛用于醫(yī)藥[9]、化妝品[10]、食品[11]等行業(yè)，具有極廣的應(yīng)用開發(fā)前景。

超聲-微波協(xié)同萃取，具有操作簡單、能有效提高提取率、縮短提取時(shí)間、降低能耗，節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)，在蛋白質(zhì)、色素、多糖、油脂、葉綠素等提取方面應(yīng)用廣泛[12-18]。作者以石榴葉為原料，采用超聲-微波協(xié)同萃取石榴葉中總黃酮，通過響應(yīng)面法優(yōu)化石榴葉中總黃酮提取工藝，為開發(fā)利用石榴葉黃酮提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石榴葉：十月下旬采收于淮北塔山，干燥、粉碎后過20目篩備用。

體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、濃鹽酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等：均為國產(chǎn)分析純；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：（純度＞98%），中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2 儀器與設(shè)備

CW-2000超聲-微波協(xié)同萃取儀：上海新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司產(chǎn)品；UV–4802型紫外可見分光光度計(jì)：尤尼科上海儀器有限公司產(chǎn)品；JA2003電子天平：上海良平儀器儀表有限公司產(chǎn)品；FDV超微粉碎機(jī)：北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃酮類化合物含量測定 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定是在參考相關(guān)文獻(xiàn)[19]的基礎(chǔ)上適當(dāng)修改，其方法為：準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，其質(zhì)量濃度為 0.200 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL的容量瓶中，再分別加入0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaNO2溶液，搖勻后放6 min，加入0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%Al（NO3）3溶液，搖勻后放置 6 min，加入4.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%NaOH溶液，最后用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇定容至刻度，搖勻，靜置12 min后，在最大吸收峰508 nm處測定各濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，以吸光度對質(zhì)量濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性回歸方程為A=11.201C－0.013 1，R2=0.999 8。

石榴葉中總黃酮的測定：取石榴葉提取液1.0 mL于10 mL的容量瓶中，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻后放置 6 min，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%NaOH溶液4.0 mL，最后用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇定容至刻度，搖勻后靜置12 min，在508 nm處測定吸光度，根據(jù)線性回歸方程換算成樣品中的總黃酮含量。

1.3.2 石榴葉中總黃酮提取單因素研究 準(zhǔn)確稱取一定量的石榴葉粉，按一定比例加浸提劑，在一定的條件下進(jìn)行超聲-微波輔助浸提后，將提取液過濾定容，測定總黃酮的含量。根據(jù)提取液總黃酮的含量研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率、提取時(shí)間、液料比等因素對石榴葉中總黃酮的提取效果的影響。

問題(8)即為文獻(xiàn)[12]中提出的半正定規(guī)劃問題,文獻(xiàn)[12]已經(jīng)理論證明了該問題中最優(yōu)解Y的秩最高為2,而近似WLS問題的最優(yōu)解的秩應(yīng)為1。顯然,由于松弛的影響,半正定規(guī)劃的解并不一定是近似WLS問題的最優(yōu)解。若要得到秩為1的解,一種自然的想法是通過加入其他有效約束來收緊該問題。觀察約束‖x-s0‖=r0(即y(2k+1)=‖y(1:k)-s0‖),其經(jīng)過松弛可變?yōu)椤瑇-s0‖≤r0,它涉及到優(yōu)化變量y之間的內(nèi)在聯(lián)系。一個(gè)自然的問題是,若在現(xiàn)有半正定規(guī)劃問題中加入此約束,能否起到收緊約束集的作用?下面的命題回答了這個(gè)問題。

1.3.3 石榴葉中總黃酮提取率的計(jì)算

式中，c為每級提取液黃酮的質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為每級提取液的體積（mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的浸提劑對石榴葉中總黃酮提取效果的影響

稱取10.0 g石榴葉粉，按液料體積質(zhì)量比30 mL/g加入不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液，在微波功率600 W下萃取240 s。由圖1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～70%范圍內(nèi)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，石榴葉中總黃酮提取率增加，但乙醇體積分?jǐn)?shù)超過70%時(shí)，石榴葉中總黃酮提取率反而下降，故提取劑的乙醇體積分?jǐn)?shù)以70%左右為宜。

2.2 微波功率對石榴葉中總黃酮提取效果的影響

稱取10.0 g石榴葉粉，按液料體積質(zhì)量比30mL/g加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液，分別在150、300、450、600、750、900 W的微波功率下萃取240 s。由圖2可知，當(dāng)微波功率在150～600 W時(shí)，隨著微波功率的增大，微波的作用逐漸加強(qiáng)，石榴葉中總黃酮得率逐漸增加。當(dāng)微波功率達(dá)到600 W時(shí)，提取率達(dá)到最大，之后呈逐漸下降趨勢，可能是由于較大微波功率使石榴葉中的某些黃酮類成分遭到破壞，從而導(dǎo)致黃酮得率有所下降[20]，因此微波功率以600 W左右為宜。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對石榴葉中總黃酮提取效果的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on extraction

圖2 微波功率對石榴葉中總黃酮提取效果的影響Fig.2 Effects of microwave output power on extraction

圖3 浸提時(shí)間對石榴葉中總黃酮提取效果的影響Fig.3 Effects of extraction time on extraction

圖4 液料體積質(zhì)量比對石榴葉中總黃酮的浸提效果Fig.4 Effects of different ratio of material to solvent on extraction

2.3 浸提時(shí)間對石榴葉中總黃酮提取效果的影響

稱取10.0 g石榴葉粉，按液料體積質(zhì)量比30 mL/g加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液，在微波功率600 W下分別萃取60、120、180、240、300、360、420 s，其結(jié)果如圖3。由圖3可知，在240 s時(shí)間內(nèi)，隨時(shí)間的延長，石榴葉中總黃酮提取率迅速增加。超過240 s后，石榴葉中總黃酮不再增加，反而出現(xiàn)下降，這可能是由于石榴葉中的某些黃酮類成分降解及提取劑揮發(fā)所致。從生產(chǎn)成本考慮，提取時(shí)間越長，能耗越大，故提取時(shí)間以240 s左右為宜。

2.4 液料體積質(zhì)量比對石榴葉中總黃酮提取效果的影響

稱取10.0 g石榴葉粉，按不同液料體積質(zhì)量比比分別加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液，在微波功率600 W下萃取240 s。由圖4可知，石榴葉中總黃酮提取率隨液料體積質(zhì)量比的增加顯著提高，其原因可能是隨著液料體積質(zhì)量比的增加，黃酮的傳質(zhì)動力也增加，使得原料中更多的黃酮融入提取劑中。當(dāng)液料體積質(zhì)量比超過30 mL/g時(shí)，黃酮的提取率沒有顯著變化，綜合考慮浸提效果、溶劑用量和濃縮負(fù)荷3方面，選擇液料體積質(zhì)量比為30 mL/g左右為宜。

2.5 超聲-微波協(xié)同提取石榴葉中總黃酮的工藝優(yōu)化

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、微波功率（X2）、提取時(shí)間（X3）和液料體積質(zhì)量比（X4）4個(gè)因素為自變量，以石榴葉總黃酮提取率為響應(yīng)值，每一個(gè)自變量的低、中、高試驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼（表1），根據(jù)相應(yīng)的試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)后，對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到包括一次項(xiàng)、二次項(xiàng)、交互項(xiàng)的二次方程，分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，最后在一定水平范圍內(nèi)求取最佳值，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表1 Box-Benhnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素與水平Table1 Factorsand levelsin theBox-Benhnken experimental design

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

由表3可以看出，回歸方程具有高度的顯著性（P≤0.01），失擬項(xiàng)具有不顯著性（P=0.07＞0.05），R2= 99.33%，表明響應(yīng)值石榴葉總黃酮提取率實(shí)際值與（X1-70）/10，x2=（X2-600）/150，x3=（X3-240）/60，x4=（X4-30）/5。

2.5.2 模型方程的建立與顯著性檢驗(yàn) 通過Minitab 15統(tǒng)計(jì)軟件分析，獲得石榴葉總黃酮提取率對編碼自變量乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率、提取時(shí)間和液料比的二次多項(xiàng)回歸。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果建立的數(shù)學(xué)模型為：A=88.39-0.075 8x1+2.868 3x2+1.273 3x3+ 3.346 7x4-4.296 73x12-3.082 9x22-1.780 4x32-2.419 2x42+2.705x1x2+1.587 5x1x3-0.09x1x4-0.907 5x2x3-0.192 5x2x4+0.245x3x4。預(yù)測值之間具有較好的擬合度。為檢驗(yàn)方程的有效性，對石榴葉中總黃酮提取的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。由表4可知，一次項(xiàng)X2、X3和X4極顯著（P≤0.01），說明微波功率、提取時(shí)間和液料體積質(zhì)量比對石榴葉中總黃酮提取率有極顯著影響。交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X2X3極顯著（P≤0.01），說明乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間、微波功率和提取時(shí)間交互項(xiàng)對石榴葉中總黃酮提取率有極顯著的影響。二次項(xiàng)X12、X22、X32和X42對石榴葉中總黃酮提取率也有極顯著的影響（P≤0.01）。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

表4 回歸方程偏回歸系數(shù)的估計(jì)值Table 4 Estimated valuesofthe partialregression coefficients of the regression model

2.5.3 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對應(yīng)于試驗(yàn)因素X1、X2、X3和X4所構(gòu)成的三維空間的曲面圖及其在二維平面上的等高線圖，可以直觀地反映各因素及他們之間的交互作用對響應(yīng)值的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乙醇體積分?jǐn)?shù)，液料體積質(zhì)量比，微波功率對總黃酮提取率的影響較顯著。另外，乙醇體積分?jǐn)?shù)與微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料體積質(zhì)量比及微波功率與提取時(shí)間的交互作用較強(qiáng)，對總黃酮提取率影響顯著。

2.5.4 石榴葉中總黃酮最佳提取條件的確定和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 在選取的各因素范圍內(nèi)，根據(jù)回歸模型通過Minitab 15軟件分析得出，石榴葉中總黃酮最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)為71.515%，微波功率為662.121 W、超聲-微波協(xié)同萃取時(shí)間為262.424 s、液料體積質(zhì)量比33.485 mL/g，石榴葉中總黃酮提取率的預(yù)測值為90.38%。考慮到實(shí)際操作的便利，確定石榴葉中總黃酮的超聲-微波協(xié)同波提取工藝條件為超聲-微波協(xié)同提取時(shí)間262 s、微波功率662 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)為71.5%、液料體積質(zhì)量比33.5 mL/g。為了證實(shí)預(yù)測的結(jié)果，用試驗(yàn)中得到的最佳提取工藝條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，石榴葉中總黃酮平均提取率為（89.21±2.67）%，與預(yù)測值90.38%基本一致（相對誤差1.31%），說明該方程與實(shí)際情況擬合很好，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性，說明響應(yīng)曲面法適用于對石榴葉中總黃酮的超聲-微波協(xié)同提取工藝進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

2.6 浸提次數(shù)對石榴葉中總黃酮提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取石榴葉粉，每次按液料體積質(zhì)量比33.5 mL/g加入71.5%乙醇溶液為浸提劑，微波功率為662 W，超聲-微波協(xié)同萃取時(shí)間為262 s。由表5可知，第1次的提取率高達(dá)89.21%，第2次的提取率7.32%，2次總的提取率達(dá)到96.53%?？紤]到溶劑成本及濃縮過程能量的消耗，石榴葉中總黃酮浸提次數(shù)以1次為宜。

3 結(jié)語

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Minitab 15，采用響應(yīng)面法建立了石榴葉中總黃酮提取工藝條件的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，對各因子對響應(yīng)值的影響進(jìn)行了分析。結(jié)果表明模型擬合程度高，試驗(yàn)誤差較小。優(yōu)化得到的石榴葉中總黃酮提取工藝條件為超聲-微波協(xié)同萃取時(shí)間為262 s、微波功率為662 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)為71.5%、液料體積質(zhì)量比為33.5 mL/g。在此工藝條件下，對石榴葉提取1次，黃酮提取率為89.21%。

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Optimization of Ultrasonic-Microwave Synergistic Extraction of Total Flavonoids from Leaves of Punica granatum L. by Response Surface Methodology

TENG Jingtong1，2， ZHAN Xiaolong1， GONG Kun3， XUE Jianping1，2，DUAN Yongbo1，2， SONG Yingchun1， SHENG Wei*1，2
（1.College of Life Sciences，Huaibei Normal University，Huaibei 235000，China；2.Anhui Key Laboratory of Plant Resources and Biology，Huaibei 235000，China；3.Huaibei Puhao Biological Technology Co.，Ltd.，Suixi 234100，China）

To optimize the extraction technology of total flavonoids from Leaves of Punica granatum L.，response surface methodology was applied on the basis of single factor tests.The results showed that microwave power，extraction time and liquid-to-material ratio had extremely significant effect on the extraction rate of total flavonoids.Ethanol concentration of 71.5%（v/v），microwave power of 662 W，extraction time of 242 s and solid/liquid ratio of 33.5（g/mL）were found optimum.Under the optimized conditions，the extraction rate of total flavonoids from Leaves of Punica granatum L.was 89.21%by extracting once.

ultrasonic-microwave synergistic extraction，leaves of Punica granatum L.，total flavonoids，response surface methodology

TS 225.4

A

1673—1689（2015）07—0744—07

2014-07-21

安徽省科技計(jì)劃項(xiàng)目（12070303032）；安徽省教育廳自然基金項(xiàng)目（KJ2012A255）。

滕井通（1975—），男，蒙古族，江蘇徐州人，理學(xué)碩士，講師，主要從事食品及保健品研究。E-mail：tt7510@163.com

*通信作者：盛瑋（1963—），男，河南信陽人，理學(xué)碩士，教授，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：biosw2006@126.com