基于1H—NMR及LC—MS技術(shù)研究金鈴子散對(duì)炎癥大鼠模型調(diào)節(jié)機(jī)制的影響

沈淑潔+水素芳+肖炳坤+楊建云+黃榮清

[摘要]為探索金鈴子散在治療炎癥過(guò)程中對(duì)生物體內(nèi)炎癥機(jī)制的調(diào)節(jié)作用，該研究采用了核磁和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，將各組大鼠血清樣本采用1HNMR和LCMS聯(lián)用的代謝組學(xué)分析方法，通過(guò)分析角叉菜膠致大鼠足腫脹模型中不同組別炎癥大鼠體內(nèi)代謝物差異的變化，發(fā)現(xiàn)并篩選與炎癥模型相關(guān)的生物標(biāo)記物，從而推測(cè)金鈴子散對(duì)角叉菜膠致炎的調(diào)節(jié)機(jī)制。通過(guò)分析相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果，篩選出與炎癥相關(guān)的差異性代謝物有18個(gè)：鳥(niǎo)苷、9順視黃酸、三磷酸、肌苷5′磷酸、二磷酸肌苷、三聚磷酸鹽、無(wú)機(jī)磷酸、甘油磷酸膽堿、21脫氧皮質(zhì)醇、檸檬酸、谷氨酸、琥珀酸、賴氨酸、?；撬帷⒈?、蘋(píng)果酸、2酮戊二酸、甘氨酸等。相關(guān)的代謝通路有檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)），乙醛酸和二羧酸代謝，甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝，丙酮酸代謝。從代謝網(wǎng)絡(luò)圖顯示金鈴子散在調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)炎癥方面，可通過(guò)調(diào)節(jié)檸檬酸，琥珀酸，甘氨酸的含量，進(jìn)而減少氧自由基攻擊程度，降低細(xì)胞的損傷，從而下調(diào)機(jī)體組織產(chǎn)生炎性因子起到抗炎的作用。

[關(guān)鍵詞]金鈴子散； 抗炎； 代謝組學(xué)； 液質(zhì)聯(lián)用

Antiinflammation effect of Jinlingzi San in rat metabonomics based on

1HNMR and LCMS technology

SHEN Shujie1， SHUI Sufang2， XIAO Bingkun1， YANG Jianyun1， HUANG Rongqing1， 2*

（1 Institute of Radiation Medicine， Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100850， China；

2 Anhui Medical University， Hefei 230032， China）

[Abstract]To further explore the regulatory effect of Jinlingzi San on in vivo inflammatory mechanism during inflammatory treatment， this study adopted 1HNMR and LCMS technology to analyze differences in in vivo metabolites of carrageeninduce rat foot swelling model Besides， biomarkers related to inflammation models of Jinlingzi San in SD rats were discovered to speculate the regulatory mechanism of Jinlingzi San in resisting carrageeninduce inflammation Through the analysis of detection spectrum， we found 18 biomarkers of metabolites（citrate， pyruvate， malic acid， succinate， glutamate， lysine， tartrate， 2oxobutyric acid， glycine， guanosine， 9cisretinoic acid， triphosphate， inosine 5′diphosphate， inosine diphosphate， tripolyphosphate， inorganic triphosphate， glycerophosphocholine， 21deoxycortisol） Relevant pathway analysis results were TCA cycle， pyruvate metabolism， glycine， serine and threonine metabolism， and dicarboxylic acid metabolism From the metabolic network， we can see that the antiinflammatory effect of Jinlingzi San can regulate citric acid， succinic acid and glycine content to resist oxygen free radical and reduce body damage by ROS， so as to downregulate inflammatory factors generated from body tissues and resist inflammation.

[Key words]Jinlingzi San； antiinflammation； metabonomics； LCMS

炎癥是機(jī)體對(duì)于外界刺激的一種防御性反應(yīng)，通過(guò)炎癥充血和滲出，包圍和殺傷損傷因子，與此同時(shí)實(shí)質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞的再生功能可使受損的細(xì)胞組織得以修復(fù)和愈合 [13]。目前相對(duì)孤立的研究方法很難監(jiān)測(cè)到機(jī)體全面動(dòng)態(tài)的變化，而基于系統(tǒng)和整體水平的代謝組學(xué)研究，可以對(duì)外界因素所引起的代謝物質(zhì)，隨時(shí)間和空間的變化所致動(dòng)態(tài)多參數(shù)分析[4]，通過(guò)研究與疾病相關(guān)的差異性代謝物，可從整體水平上揭示炎癥的相關(guān)生物學(xué)機(jī)制。

目前，中醫(yī)中藥的抗炎藥理研究成為中醫(yī)藥現(xiàn)代研究較為活躍的領(lǐng)域。由延胡索和川楝子組成的金鈴子散，其在治療胃炎、胃潰瘍等疾病方面療效尤其顯著[5]。角叉菜膠誘導(dǎo)大鼠足腫脹的急性非特異性的炎癥模型，與血管活性物質(zhì)激肽類一起誘發(fā)水腫、出血等病理反應(yīng)，通過(guò)前列腺素來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)的釋放，包括5羥色胺（5HT）、組胺、氧自由基等[6]。本研究利用核磁共振波譜法和液質(zhì)聯(lián)用代謝組學(xué)技術(shù)尋找大鼠炎癥模型體內(nèi)的差異性表達(dá)代謝物，并對(duì)所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行代謝軌跡分析和代謝網(wǎng)絡(luò)富集。通過(guò)這些途徑深入研究金鈴子散對(duì)角叉菜膠所致大鼠炎癥的代謝調(diào)控，以期尋找潛在重要分子靶標(biāo)和揭示其作用機(jī)制。

1材料

11儀器Agilent 1200/6410三重串聯(lián)四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，配有在線脫氣系統(tǒng)（G1322A）、二元泵（G1312B）、自動(dòng)進(jìn)樣器（G1367E）、柱溫箱（G1316A）、VWD 檢測(cè)器（G1314A）、電噴霧離子源（G6410B），美國(guó)安捷倫科技有限公司；Varian UNITY INOVA600型超導(dǎo)傅里葉變換核磁共振譜儀，美國(guó)瓦里安公司；大鼠不銹鋼代謝籠，北京龍東?？蒲性O(shè)備制造有限公司；TGL16B臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；VictorX5酶標(biāo)儀，美國(guó)PerkinElmer公司；LGJ25C冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠。

12試劑09%生理鹽水，石家莊四藥有限公司；戊巴比妥鈉，北京化學(xué)試劑公司，德國(guó)進(jìn)口分裝；疊氮化鈉（NaN3），英國(guó) Alfa Aesar化工有限公司；磷酸二氫鈉（NaH2PO4，純度≥990%）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4，純度≥990%），美國(guó)Sigma 化工有限公司；重水（D2O，光譜純），美國(guó) CIL 有限公司；5 mmol·L-1 DSS內(nèi)標(biāo)液（光譜純，pH=730），加拿大Chenomx有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），比利時(shí) Fisher 試劑有限公司；純化水，屈臣氏（集團(tuán)）有限公司；甲酸（Fluka，50%水溶液，色譜純），美國(guó) SigmaAldrich化工有限公司。

金鈴子散（延胡索，北京同仁堂責(zé)任有限公司，批號(hào)404002248P；川楝子，北京同仁堂責(zé)任有限公司，批號(hào)101152286W）；角叉菜膠（Sigma 公司，批號(hào)1001809743）；阿司匹林（Bayer HealthCare Manufacturing Srl，批號(hào)BJ10205）。

13動(dòng)物雄性SD大鼠30只，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（軍）20120004，體重（200±20） g，所有大鼠均在單一代謝籠內(nèi)飼養(yǎng)。溫度（23±1） ℃，12 h光/暗循環(huán)（光照時(shí)間8：00—20：00），自由進(jìn)食飲水。昆明種雄性小鼠，體重（20±12） g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（軍）20120004，所處實(shí)驗(yàn)環(huán)境與大鼠相同。

14金鈴子散水煎液的提取金鈴子散 （川楝子和延胡索各1 000 g），加10倍量水浸泡后，煎煮1 h，用醫(yī)用紗布過(guò)濾，加8倍量的水進(jìn)行第2次煎煮濃縮，煮沸回流1 h，合并2次濾液，進(jìn)行抽濾和減壓濃縮，使藥液濃縮成浸膏狀，得450 mL藥液，濃縮液和藥材之比為1∶444 （相當(dāng)于1 mL含生藥444 g），4 ℃冷藏，備用。

2方法

21角叉菜膠致大鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?shí)驗(yàn)分組為金鈴子散（低、中、高）實(shí)驗(yàn)組，空白模型組，陽(yáng)性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將大鼠隨機(jī)分組，每組6只，共30只，每天連續(xù) 5 min的撫摸適應(yīng)7 d。金鈴子散實(shí)驗(yàn)組（低、中、高劑量組）大鼠分別以（0147，0443，1329） g·kg-1劑量灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組給予阿司匹林50 mg·kg-1，等體積藥液灌胃給藥，且藥液均用生理鹽水配制，模型組給予等體積的生理鹽水。給藥14 d后，于大鼠右后跖足皮內(nèi)注射1%角叉菜膠生理鹽水溶液01 mL致炎，在各實(shí)驗(yàn)組大鼠的右后肢裸關(guān)節(jié)處作一標(biāo)記，并于致炎后 0，120，180 min，用排水法分別測(cè)量右后足踝關(guān)節(jié)排水體積，并作為大鼠足腫脹程度的指標(biāo)，以抑制率反映藥物抗炎的作用強(qiáng)度[7]。大鼠致炎（3 h）后，每組大鼠分別于腹主動(dòng)脈收集血液，至室溫下靜置10 min析出血清，12 000 r·min-1離心 10 min，取上層淡黃色透明血清，于-80 ℃保存。

沈淑潔等：基于1HNMR及LCMS技術(shù)研究金鈴子散對(duì)炎癥大鼠模型調(diào)節(jié)機(jī)制的影響22角叉菜膠模型大鼠血清核磁和液質(zhì)數(shù)據(jù)采集由于血樣易于采集，包含生物體的整體性代謝物信息，故本實(shí)驗(yàn)采集大鼠的血清進(jìn)行檢測(cè)。NMR測(cè)量前血樣準(zhǔn)備： -80 ℃冰箱中取出，于4 ℃解凍，以D2O稀釋，加入5 mmol·L-1DSS內(nèi)標(biāo)溶液，制備得到含10 mmol·L-1DSS的測(cè)定溶液。將待測(cè)定的溶液離心10 min，取500 μL的上清液于5 mmol·L-1 NMR管中，進(jìn)行NMR 數(shù)據(jù)采集。數(shù)據(jù)在Varian UNITY INOVA 600超導(dǎo)脈沖傅里葉變換核磁共振譜儀上進(jìn)行采集。調(diào)用CPMG脈沖序列，參數(shù)如下：譜寬為8 000 Hz，傅立葉變換點(diǎn)為131 072，采樣點(diǎn)數(shù)是64 000，線增寬因子為3，采樣時(shí)間為4 s，累加次數(shù)64次，自旋擴(kuò)散時(shí)間01 s，弛豫延遲時(shí)間為2 s。采用預(yù)飽和的方式抑制水峰，譜儀偏置設(shè)置在水峰的位置。自由感應(yīng)衰減信號(hào)（FID）經(jīng)過(guò)傅立葉轉(zhuǎn)換后成為一維NMR譜圖[8]。以DSS（δ設(shè)為0）為化學(xué)位移參考峰的位置，其中CPMG數(shù)據(jù)積分范圍為02～54段，對(duì)這段區(qū)間內(nèi)的核磁譜圖按每段001的寬度進(jìn)行分段積分。并且排除溶劑峰和尿素峰（δ 510～460）積分區(qū)段，將積分?jǐn)?shù)據(jù)歸一化后，利用SIMCAP 115軟件包（瑞典，Umetrics AB，Umea）進(jìn)行主成分分析。本實(shí)驗(yàn)中代謝物的譜峰歸屬主要是依據(jù)其化學(xué)位移值、峰的裂分以及參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，同時(shí)借助于軟件Chenomx NMR Suite 71（Chenomx，Inc.，Edmonton，Alberta，Canada） 中代謝產(chǎn)物的自動(dòng)解析功能。分析相關(guān)的差異性代謝物。

液質(zhì)聯(lián)用分析時(shí)，取100 μL解凍后血清加入 400 μL的乙腈沉淀蛋白，4 ℃下12 000 r·min-1離心15 min，移取上清液供 LCMS分析。以Agilent三重串聯(lián)四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集：使用HP ODS C18 Hypersil色譜柱，流動(dòng)相為01%甲酸溶液（A）乙腈（B），梯度洗脫，0～5 min，5%～60%B，5～7 min，60%～75%B，7～10 min，75%～90%B，10～11 min，90%～80%B，11～22 min，80%～75%B，22～25 min，75%～30%B，25～28 min，30%～5%B，流速03 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μL；柱溫30 ℃；VWD檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。質(zhì)譜條件：采用正、負(fù)離子MS2掃描模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，以MassHunter軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集參數(shù)：正、負(fù)離子化模式，干燥氣溫度350 ℃，霧化器壓力50 psi（1 psi=6895 kPa），干燥氣流速10 L·min-1，毛細(xì)管電壓（+）4 000 V，（-）3 500 V，F(xiàn)ragmentor135 V，掃描范圍m/z 50～1 000，Delta EMV （+）200 V，（-）250 V。

23數(shù)據(jù)處理將液質(zhì)聯(lián)用采集到的數(shù)據(jù)上傳至XCMS數(shù)據(jù)處理平臺(tái)進(jìn)行質(zhì)譜特征離子評(píng)估。通過(guò)XCMS分析結(jié)果對(duì)峰值保留時(shí)間偏差進(jìn)行質(zhì)控評(píng)價(jià)，提取組間差別較大的化合物信息（P<005），并根據(jù)平臺(tái)生成的PCA結(jié)果，篩選多元統(tǒng)計(jì)分析中變異最大的9個(gè)化合物，分別為鳥(niǎo)苷、9順視黃酸、三磷酸、肌苷5′磷酸、二磷酸肌苷、無(wú)機(jī)磷酸、甘油磷酸膽堿、21脫氧皮質(zhì)醇、三聚磷酸鹽。通過(guò)匹配在線的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)化合物進(jìn)行鑒定并驗(yàn)證結(jié)果的正確性。結(jié)合核磁譜圖分析得到的9個(gè)差異性代謝物（檸檬酸、丙酮酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸、谷氨酸、賴氨酸、牛磺酸、2酮戊二酸、甘氨酸）上傳到 MetPA 數(shù)據(jù)處理中心，通過(guò)與 KEGG 數(shù)據(jù)匹配ID后，進(jìn)行通路富集和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。以Fishers正確性檢驗(yàn)和超幾何分布檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)在特定生物途徑中的隨機(jī)性進(jìn)行測(cè)試。根據(jù)得到的MetPA預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)，進(jìn)行代謝機(jī)制預(yù)測(cè)和解釋。

大鼠的足腫脹度采用SPSS 170軟件進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行組間樣本方差分析（ANOVA），通過(guò)方差分析中的LSD和SNK法對(duì)樣本組間差異情況進(jìn)行分析。以P<005表示組間有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<001表明組間有極明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3結(jié)果

31角叉菜膠致腫脹實(shí)驗(yàn)足腫脹率本研究中采用角叉菜膠致大鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過(guò)分析不同組別大鼠之間足腫脹抑制率的水平，觀察足腫脹抑制率的變化趨勢(shì)，見(jiàn)表1。

從表1中可以看出0 min時(shí)各組大鼠足腫脹排水體積無(wú)顯著性差異，而120 min時(shí)觀察測(cè)定陽(yáng)性對(duì)照組與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，180 min時(shí)觀察測(cè)定金鈴子散高劑量組與模型對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，從而說(shuō)明金鈴子散高劑量組對(duì)角叉菜膠致大鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)有一定的抑制效果。且180 min抑制效果較120 min顯著，呈作用的時(shí)間依賴性。

32核磁數(shù)據(jù)分析結(jié)果1HNMR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在核磁譜儀上采集后使用Chenomox軟件進(jìn)行目標(biāo)性分

析。刪除水峰（δ 46～51）。通過(guò)自動(dòng)生成的差異性代謝物含量的相對(duì)變化，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得到9個(gè)代謝差異物，見(jiàn)圖1。

33液質(zhì)數(shù)據(jù)分析結(jié)果將不同組別的大鼠血清在液質(zhì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)XCMS進(jìn)行樣本分析，差異代謝物組篩選與鑒定提取中，將液質(zhì)聯(lián)用的正、負(fù)離子數(shù)據(jù)，經(jīng)標(biāo)度化預(yù)處理數(shù)據(jù)后，以XCMS建立2種離子模式數(shù)據(jù)的PCA模型，另外結(jié)合系統(tǒng)自動(dòng)分析出的大鼠血清代謝物中潛在的差異表達(dá)代謝物質(zhì)。從樣本正、負(fù)離子模式的 LCMS 數(shù)據(jù)得到9種潛在代謝差異物。利用生物化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG，METLIN 等）將所得的差異性物質(zhì)進(jìn)行解釋。同時(shí)將得到的差異性代謝物通過(guò)在相同液相條件下，對(duì)與標(biāo)準(zhǔn)化合物的保留時(shí)間和質(zhì)譜圖進(jìn)行確認(rèn)，見(jiàn)圖2。

正離子模式PCA分析提取前3個(gè)主成分方差貢獻(xiàn)率（R2）及累計(jì)貢獻(xiàn)率（Q2）分別為 0913（0894）。說(shuō)明這種模式下的 PCA 模型有91%以上的變量可用于解釋角叉菜膠致大鼠足腫脹模型實(shí)驗(yàn)中89%以上的差異，模型預(yù)測(cè)能力良好。液質(zhì)數(shù)據(jù)在XCMS平臺(tái)進(jìn)行分析，以t 檢驗(yàn)對(duì)2組間平均豐度值進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)，以P<005 提取差異變量。剔除加合、同位素及碎片離子，將差異性代謝物在相同色譜條件下建立的標(biāo)準(zhǔn)化合物的液質(zhì)數(shù)據(jù)驗(yàn)證化合物的準(zhǔn)確性。差異較大的物質(zhì)結(jié)合XCMS分析的結(jié)果最終得到9個(gè)差異變量。

5組大鼠區(qū)分明顯，角叉菜膠致足腫脹5組大鼠血清內(nèi)代謝物呈明顯的聚類分布，說(shuō)明這些不同組別的大鼠之間體內(nèi)代謝物已顯示出明顯的差異性，見(jiàn)圖3。

34MetPA代謝途徑分析通過(guò)LCMS和1HNMR篩選出的代謝物共有18個(gè)，將這些差異性代謝物的數(shù)據(jù)導(dǎo)入 MetPA 進(jìn)行代謝通路查詢，得出了相關(guān) 23條通路分析的詳細(xì)結(jié)果，綜合Raw p，Holm p，F(xiàn)DR（false discovery rate）和 Impact 結(jié)果，對(duì)與炎癥相關(guān)代謝通路的重要性進(jìn)行評(píng)價(jià)，見(jiàn)表2。

以地圖式交互式可視化系統(tǒng)為圖形表現(xiàn)形式（代謝組視圖，路徑視圖和復(fù)合視圖）。代謝組視圖見(jiàn)圖4。

4討論

本研究采用了一維核磁技術(shù)和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)方法，通過(guò)建立角叉菜膠致炎模型比較金鈴子散組與阿司匹林組以及空白組大鼠代謝譜的差異，識(shí)別與炎癥相關(guān)的代謝調(diào)節(jié)通路，觀察金鈴子散對(duì)角叉菜膠致足腫脹大鼠模型的影響并對(duì)炎癥相關(guān)的通路識(shí)別和分析。由代謝網(wǎng)絡(luò)圖可以看出金鈴子散對(duì)角叉菜膠致大鼠足腫脹模型的影響實(shí)驗(yàn)中相關(guān)

的代謝通路有檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)），丙酮酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝以及乙醛酸和二羧酸代謝。

三羧酸循環(huán)和乙醛酸代謝通路產(chǎn)生的檸檬酸鹽和琥珀酸鹽，在生物氧化呼吸鏈反應(yīng)中充當(dāng)催化劑的角色。三羧酸循環(huán)是機(jī)體基本物質(zhì)之間相互聯(lián)系和轉(zhuǎn)化的樞紐。循環(huán)途徑中的丙酮酸是機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的中間產(chǎn)物，可加速脂肪酸氧化分解、降糖和抑制自由基等生理功效[912]，對(duì)機(jī)體能量代謝有較大影響。同時(shí)也是能量代謝的底物，可進(jìn)一步活化三羧酸循環(huán)，增加能量消耗，進(jìn)而改變機(jī)體內(nèi)乙酰輔酶A的水平，增加脂肪的消耗，影響體內(nèi)激素和脂肪的代謝[13]。從體內(nèi)代謝物質(zhì)的相互關(guān)系看出機(jī)體內(nèi)的各種代謝途徑是一個(gè)有密切聯(lián)系且相互影響的體系[14]。實(shí)驗(yàn)中金鈴子散高、中、低劑量組中三羧酸循環(huán)的中間體，包括檸檬酸（NMR定量分析，

LCMS負(fù)離子m/z 1931）、琥珀酸（NMR定量分析，LCMS負(fù)離子m/z 1191）皆呈現(xiàn)隨著給藥劑量增加含量降低的趨勢(shì)，然而模型對(duì)照組含量較高，說(shuō)明相對(duì)較高含量的檸檬酸加強(qiáng)了ATP的抑制效應(yīng)，從而使磷酸果糖激酶的活性受到了抑制，導(dǎo)致磷酸烯醇式丙酮酸得到了積累。然而三羧酸循環(huán)和氨基酸的合成都需要丙酮酸的參與，丙酮酸的積累使得三羧酸循環(huán)中的α酮戊二酸脫氫酶系統(tǒng)活性增強(qiáng)，促進(jìn)活性氧（ROS）產(chǎn)生，使氧化應(yīng)激反應(yīng)增加，從而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，這也是模型組較金鈴子散組含量偏高的原因。另外，在LCMS負(fù)離子模式下測(cè)定的煙酰胺（LCMS負(fù)離子m/z 1211）和甲基煙酰胺（LCMS 負(fù)離子m/z 1382）隨金鈴子散劑量的增加水平下降，推測(cè)機(jī)體炎癥使得能量代謝水平降低，其中間代謝物水平也相應(yīng)降低。另外二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可將檸檬酸、琥珀酸等物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)參與能量的合成，是調(diào)控能量代謝的一種關(guān)鍵性膜蛋白質(zhì)[15]。乙醛酸及二羧酸代謝酶還能將羥基丙酮酸還原為D甘油酸或?qū)⒁胰┧徇€原為乙醇酸。金鈴子散組中乙醛酸的含量較空白對(duì)照組呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，因此二羧酸也可以作為指示機(jī)體炎癥的生物標(biāo)記物。

在甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑中，蘇氨酸主要通過(guò)蘇氨酸脫水酶（TDH）和蘇氨酸脫氫酶（TDG）以及蘇氨酸醛縮酶催化而轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌镔|(zhì)，適量蘇氨酸可增強(qiáng)機(jī)體的免疫性[16]。處于氨基酸代謝中間位置的絲氨酸可在免疫血球素和抗體的產(chǎn)生及為氧化還原勢(shì)能谷胱甘肽的合成提供 NADPH，通過(guò)增加 NADPH 的合成，消除ROS的毒害作用，在維持細(xì)胞的存活中起重要作用[16]。甘氨酸可與蛋氨酸和精氨酸合成胍基乙酸，于肝臟甲基化后生成肌酸，并結(jié)合高磷酸基團(tuán)生成磷酸肌酸，當(dāng)機(jī)體消耗能量過(guò)多時(shí)，磷酸肌酸就可以促進(jìn)ATP的合成，產(chǎn)生能量。在金鈴子散低劑量組中，蘇氨酸（LCMS正離子m/z 1181）、絲氨酸（LCMS正離子m/z 1041）和甘氨酸（LCMS負(fù)離子m/z 761）含量較空白對(duì)照組升高，它們的改變與生物體內(nèi)能量代謝以及蛋白質(zhì)脂肪代謝功能異常有關(guān)，絲氨酸含量升高推測(cè)其可能被用于抵抗機(jī)體炎癥產(chǎn)生的大量ROS自由基，進(jìn)而降低炎癥反應(yīng)。另外金鈴子散高劑量組絲氨酸、蘇氨酸和甘氨酸含量下降，推測(cè)可能是由于金鈴子散中川楝子的毒性使機(jī)體代謝功能損傷，造成氨基酸代謝調(diào)節(jié)的不可逆轉(zhuǎn)。

本實(shí)驗(yàn)采用1HNMR和LCMS技術(shù)的代謝組學(xué)研究方法，建立了角叉菜膠致炎模型，通過(guò)比較金鈴子散組與阿司匹林組以及空白組大鼠代謝譜的差異，識(shí)別與炎癥相關(guān)的代謝物通路，另外結(jié)合二甲苯致小鼠耳腫脹模型從藥理學(xué)角度驗(yàn)證金鈴子散對(duì)炎癥的有效性。在角叉菜膠致大鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)的分析結(jié)果中，金鈴子散給藥組可以使血清中檸檬酸、琥珀酸含量水平下調(diào)，這說(shuō)明金鈴子散可有效干預(yù)大鼠體內(nèi)的糖代謝途徑。甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸含量的升高可能是機(jī)體自身調(diào)節(jié)大量活性氧自由基的一種免疫增強(qiáng)反應(yīng)。另外，在角叉菜膠所致大鼠的炎癥模型中，金鈴子散高劑量組不能對(duì)升高的氨基酸水平進(jìn)行有效逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明其不能有效阻止炎癥部位蛋白質(zhì)的分解?？偟膩?lái)說(shuō)，金鈴子散在調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)炎癥方面的機(jī)制可能是通過(guò)減少氧自由基攻擊程度，降低細(xì)胞損傷，進(jìn)而下調(diào)機(jī)體組織產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子從而完成機(jī)體一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)，達(dá)到抗炎作用。

炎性疾病涵蓋了人體多個(gè)系統(tǒng)器官，因此加強(qiáng)對(duì)相關(guān)炎癥疾病調(diào)節(jié)作用機(jī)制的研究有更為重要的意義。目前代謝組學(xué)采取與計(jì)算機(jī)高通量分析手段相結(jié)合的方式尋找代謝譜的差異，識(shí)別與疾病模型相關(guān)的代謝物通路，并對(duì)可能出現(xiàn)的病證進(jìn)行代謝通路識(shí)別和分析，進(jìn)而為新的作用靶點(diǎn)藥物的研制開(kāi)發(fā)提供新的思路。

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[責(zé)任編輯曹陽(yáng)陽(yáng)]

[收稿日期]20160715

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21375147）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81501229）；北京自然科學(xué)基金項(xiàng)目（7142125）；國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2012ZX09301003001010）

[通信作者]*黃榮清，研究員，主要從事新藥質(zhì)量鑒定和中藥代謝組學(xué)研究，Email：hrongqing@163com

[作者簡(jiǎn)介]沈淑潔，碩士研究生，主要從事中藥代謝組學(xué)研究，Email：guru2016@126com