低分子肝素結(jié)構(gòu)表征技術(shù)研究

周 霞

1武漢大學(xué)藥學(xué)院 湖北省武漢市 420073 2辰欣藥業(yè)股份有限公司 山東省濟(jì)寧市 272000

低分子肝素結(jié)構(gòu)表征技術(shù)研究

周 霞1,2

1武漢大學(xué)藥學(xué)院 湖北省武漢市 420073 2辰欣藥業(yè)股份有限公司 山東省濟(jì)寧市 272000

低分子肝素屬于一種抗凝血類藥物，目前已在臨床上得到大量使用。該藥物具有一定的強(qiáng)極性、微不均一性和硫酸基團(tuán)較差穩(wěn)定性，導(dǎo)致對(duì)其的結(jié)構(gòu)表征研究工作有一定難度。本文對(duì)低分子肝素結(jié)構(gòu)表征技術(shù)進(jìn)行了研究，并詳細(xì)分析了該藥物在電泳、色譜、質(zhì)譜以及核磁方面的研究成果。

低分子肝素；結(jié)構(gòu)；表征；研究

未分級(jí)肝素屬于一類糖胺聚糖，主要出現(xiàn)在動(dòng)物體內(nèi)，在生物學(xué)方面擁有抗凝、抗炎和抗癌等功能；即便如此，若長(zhǎng)時(shí)間使用也會(huì)出現(xiàn)大量的不良影響，比如：出血、導(dǎo)致血小板數(shù)量減少等[1]。低分子肝素是采用化學(xué)或者酶法的方式來(lái)降解未分級(jí)肝素而產(chǎn)生的，它的平均相對(duì)分子量不高于八千；與未分級(jí)肝素相比之下，低分子肝素的抗血栓功能偏高一些、抗凝血功能偏低一些，它的優(yōu)勢(shì)在于：生物利用功能強(qiáng)、體內(nèi)半衰期較長(zhǎng)、輕微出血傾向以及服用后吸收功能強(qiáng)等。

1 低分子肝素的酶解

低分子肝素?fù)碛幸欢ǖ膹?qiáng)極性、微不均一性，很難使用液相分析法將每種組成部分分離開來(lái)，一般情況下采用肝素酶充分降解為二糖，也可分開降解為二、四、六和八糖等相對(duì)均一的成分，接著再進(jìn)行進(jìn)一步分析。肝素酶是通過黃桿菌的分離和純化而產(chǎn)生，屬于一種裂解酶，因其獨(dú)特的特異性可裂解肝素糖苷鍵[2]。通常情況下，肝素酶被分為肝素酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，這三種肝素酶的底物存在不同差異的特異性。

2 電泳分析法

2.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳屬于經(jīng)典的分離方法之一，將其與酸醋纖維膜電泳和瓊脂糖電泳相比較，聚丙烯酰胺凝膠電泳得分辨率要高一些，通常情況下都被用作測(cè)定多糖的平均相對(duì)分子量、表征低分子肝素和降解產(chǎn)物的寡糖鏈散步情況。因低分子肝素具有一定微不均一性和高電荷等的特性，使其電泳方法比蛋白質(zhì)電泳難一些。

2.2 毛細(xì)管電泳

因毛細(xì)管電泳的優(yōu)勢(shì)在于分析速度快、靈敏度和分離度較高、無(wú)需消耗太多樣品以及緩沖液用量等，故目前已被常用于糖類物質(zhì)的分析。毛細(xì)管電泳從上個(gè)世紀(jì)九十年代至今均被使用在分析低分子肝素和未分級(jí)肝素中，最開始是用在二糖合成和寡糖的分析之中。若使用正極模式來(lái)分析二糖的合成，則不容易在一套緩沖液系統(tǒng)中把八種二糖進(jìn)行基線分離，還存在峰的對(duì)稱性不好和拖尾嚴(yán)重的現(xiàn)象，使用負(fù)極模式就不會(huì)出現(xiàn)這些難題。

3 色譜分析法

3.1 尺寸排阻色譜

尺寸排阻色譜是以平均相對(duì)分子量大小狀態(tài)為原則來(lái)進(jìn)行分離物質(zhì)，而物質(zhì)存在色譜柱上的總體時(shí)間一般來(lái)說都和平均相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)線性成負(fù)相關(guān)。通過一組已知平均相對(duì)分子量的同種物質(zhì)設(shè)立出峰時(shí)間和平均相對(duì)分子量大小的準(zhǔn)確曲線，再通過未知樣品的出峰時(shí)間得出它的平均相對(duì)分子量大小。這種方法是如今很多國(guó)家藥典測(cè)定低分子肝素平均相對(duì)分子量常用的手段。

3.2 離子交換色譜

低分子肝素硫酸基團(tuán)穩(wěn)定性較差，含有兩個(gè)以上硫酸基，附帶兩個(gè)以上負(fù)電荷，故強(qiáng)陰離子交換（SAX）在制備和分析中比較常見[3]。將SAX與其余的色譜分離手段進(jìn)行比較，SAX-HPLC的分離能力更為強(qiáng)大一些，而制備和半制備的SAX-HPLC還可使用在制備少量低分子肝素酶解后產(chǎn)生的寡糖組成成分中。強(qiáng)陰離子交換也可被用作純化低分子肝素，如今已經(jīng)有許多以強(qiáng)陰離子交換原理為基礎(chǔ)的固相提取柱。

3.3 離子對(duì)反相色譜

通過離子對(duì)反相色譜來(lái)分析低分子肝素的原則是：給予流動(dòng)相內(nèi)增加烷基胺類離子對(duì)試劑，作用在于加強(qiáng)低分子肝素和肝素寡糖保存在反相色譜柱上的能力。正常情況下，當(dāng)?shù)头肿痈嗡氐墓烟擎満荛L(zhǎng)時(shí)，說明硫酸基數(shù)量較多，那么融合的離子對(duì)劑也相對(duì)較多，從而使預(yù)存能力變強(qiáng)，在這種情況下便可把低分子肝素按鏈的長(zhǎng)度打開。

4 質(zhì)譜分析法

4.1 基質(zhì)輔助激光誘導(dǎo)解析質(zhì)譜

基質(zhì)輔助激光誘導(dǎo)解吸質(zhì)譜的基本原理為：把樣品和基質(zhì)溶液放在樣品版上作融合和干燥環(huán)節(jié)，再進(jìn)行激光照射環(huán)節(jié)，待基質(zhì)充分吸收激光能量后在將樣品進(jìn)行帶動(dòng)，接著從樣品板上向外濺射，樣品會(huì)從固體狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闅怏w狀態(tài)，再在氣體狀態(tài)中和基質(zhì)分子進(jìn)行結(jié)合便產(chǎn)生離子化。

4.2 電噴霧電離質(zhì)譜

電噴霧電離質(zhì)譜主要是在“離子霧化”的基礎(chǔ)上將樣品進(jìn)行電離，因低分子肝素含有較多的硫酸基和羥基，普遍都采用負(fù)離子方法[5]。因低分子肝素的硫酸基團(tuán)在進(jìn)行離子化時(shí)比較容易流失，故在使用電噴霧電離質(zhì)譜法來(lái)分析肝素時(shí)必須調(diào)整質(zhì)譜要求，盡可的能使用穩(wěn)定的離子化要求。

5 核磁共振

核磁共振波譜針對(duì)分子結(jié)構(gòu)變化具有較高的敏感性，通常被用于表征低分子肝素的結(jié)構(gòu)。雖可從一維1H-NMR的結(jié)局中分析出單糖組成、數(shù)量和雜質(zhì)等的部分信息，但想要得到完全的低分子肝素結(jié)構(gòu)，常常需對(duì)2D-NMR進(jìn)行分析[6]。

6 結(jié)束語(yǔ)

低分子肝素具有極性強(qiáng)和結(jié)構(gòu)復(fù)雜的特性，故必須采用多種分析方式才能準(zhǔn)確的表征低分子肝素的結(jié)構(gòu)。因比較困難才能將低分子肝素的單一組成部分完全分離再進(jìn)行分析，因此分析和表征低分子肝素降解構(gòu)成的二糖以及寡糖的結(jié)構(gòu)一直是如今探究的要點(diǎn)。

[1]石峰,姬勝利,遲延青等.低分子肝素的制備方法及其結(jié)構(gòu)與生物活性的關(guān)系[J].中國(guó)生化藥物雜志,2003,24(02):101-104.

[2]廖勁松,郭勇.低分子肝素研究進(jìn)展[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2004,20(02):175-178.

[3]張利赟.低分子肝素藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)綜述[J].科技傳播,2010,7(16):91-92.

[4]丘曉琳,李國(guó)明,葉俊生等.低分子肝素/殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合微囊的制備及釋藥性能[J].應(yīng)用化學(xué),2005,22(04):361-366.

[5]杜旭召,李道遠(yuǎn),遲連利等.低分子肝素分析及結(jié)構(gòu)表征方法的研究進(jìn)展[J].食品與藥品,2012,23(09):363-365.

[6]王章杰.一種低分子肝素完全降解產(chǎn)物的色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法[D].山東大學(xué),2014,21(15):45-32.

周霞，陜西省漢中市人。大學(xué)本科學(xué)歷。中級(jí)職稱。研究方向?yàn)槎嗵穷愃幬铩?/p>