二氯乙酸鈉對人骨肉瘤MG63細(xì)胞周期及凋亡影響的初步研究

于雅麗，王雷鳴

(鄭州市骨科醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450052)

二氯乙酸鈉對人骨肉瘤MG63細(xì)胞周期及凋亡影響的初步研究

于雅麗，王雷鳴

(鄭州市骨科醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450052)

目的 探討不同濃度的二氯乙酸鈉(DCA)對人骨肉瘤MG63細(xì)胞活性、周期及凋亡的影響。方法 用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)MG63細(xì)胞，不同濃度DCA作用于對數(shù)生長期的細(xì)胞，CCK8試劑盒檢測50、100、200 μg·mL-1DCA處理24 h、48 h后細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測100、200 μg·mL-1DCA-Na作用24 h、48 h后細(xì)胞周期和凋亡情況；qRT-PCR檢測100、200 μg·mL-1DCA處理后細(xì)胞周期相關(guān)基因CDK2的變化。結(jié)果 CCK8檢測結(jié)果顯示50、100、200 μg·mL-1DCA均能抑制MG63細(xì)胞的生長，且有時間和濃度依賴性；不同濃度的DCA-Na分別干預(yù)MG63細(xì)胞不同時間后都明顯阻滯細(xì)胞于G2/M期，且細(xì)胞凋亡率增加(P均<0.001)；不同濃度的DCA干預(yù)MG63細(xì)胞后，細(xì)胞中的CDK2 mRNA的相對表達(dá)量明顯降低(P均<0.001)。結(jié)論 DCA通過抑制CDK2使MG63細(xì)胞阻滯于G2/M期，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞的生長。

二氯乙酸鈉；骨肉瘤；周期蛋白依賴激酶；細(xì)胞周期

骨肉瘤是5～20歲青少年最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤[1-2]，其惡性程度高，肺轉(zhuǎn)移早，易復(fù)發(fā)，病死率約70%[3]，而其發(fā)病機制不明確，傳統(tǒng)化療藥物效果差，副作用大[4-5]，因此闡明其發(fā)病機制及找到治療的生物靶點刻不容緩。周期蛋白依賴激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)是細(xì)胞周期調(diào)控的中心環(huán)節(jié)[6]，而惡性腫瘤的生物學(xué)特點就是細(xì)胞周期的脫靶，使細(xì)胞無限的增殖，而大量的文獻(xiàn)證實骨肉瘤中CDK處于過表達(dá)或失去正常調(diào)控機制的狀態(tài)[7]，因此，通過抑制CDK活性來達(dá)到腫瘤細(xì)胞周期阻滯和凋亡[8]。已有文獻(xiàn)[9]證實二氯乙酸鈉(sodium dichloroacetate,DCA)通過抑制線粒體丙酮酸脫氫酶激酶后啟動三羧酸循環(huán)，促進(jìn)葡萄糖的氧化磷酸化，而激活了線粒體介導(dǎo)的凋亡通路抑制人乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株的生長。研究[10]發(fā)現(xiàn)DCA通過誘導(dǎo)凋亡和阻滯細(xì)胞周期G2期在不影響非腫瘤細(xì)胞生長的情況下抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長，顯著降低結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。而課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)能量抑制劑的活性誘導(dǎo)骨肉瘤MG63細(xì)胞凋亡，抑制人骨肉瘤細(xì)胞MG63生長。為探討DCA是否也通過抑制了CDK2阻滯細(xì)胞于周期G2期來起作用，我們設(shè)計了此課題，觀察觀察不同濃度DCA作用于MG63細(xì)胞后對細(xì)胞活性及周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤MG63細(xì)胞株由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 試劑 CCK-8試劑盒購于日本Dojindo公司；Trizol細(xì)胞裂解液購自美國Invitrogen公司；SYBR Green PCR Master Mix購自Beyotime公司；流式細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自Beyotime公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自澳大利亞Gbico公司；DCA自美國Sigma-Aldrich公司。

1.3 方法 在加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞株MG63，pH值為6.8～7.2，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化傳代。取生長旺盛的對數(shù)生長期細(xì)胞，制作細(xì)胞濃度為1×105·mL-1的細(xì)胞懸液，取100 μL轉(zhuǎn)種96孔培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，分別加入含DCA終濃度為50、100、200 μg·mL-1的培養(yǎng)基100 μL，對照組不加藥，每組設(shè)3個復(fù)孔。

培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后每孔分別加入5 mg·mL-1的CCK-8溶液10 μL，混勻，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1～4 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長下測定吸光度值(OD值)，測3次，取平均值，依照抑制率公式相對抑制率=[1-(藥物干預(yù)實驗組OD值)/(對照組OD值)]×100%，計算各組抑制率。

Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測不同濃度DCA對細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響取對數(shù)生長期細(xì)胞，常規(guī)消化制成單細(xì)胞懸液，以細(xì)胞濃度1.25×105·mL-1接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，24 h后加入不同濃度DCA-Na (100、200 μg·mL-1)培養(yǎng)24 h、48 h，收集細(xì)胞，離心5 min，棄去上清，體積分?jǐn)?shù)70%冰乙醇固定，4 ℃過夜。檢測時，PBS清洗細(xì)胞，吹打混勻，加入Rnase 5 μL(10 mg·mL-1)，37 ℃放置1 h，加入2 μL Annexin V-FITC和2 μL PI染液，室溫避光染色30 min，計數(shù)10 000個細(xì)胞，F(xiàn)CW流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期時相和凋亡情況，各組細(xì)胞均重復(fù)實驗3次，取其平均值。

實時熒光定量PCR(qRT-PCR)根據(jù)GenBank提供的CDK2序列合成引物Sense (5’-3’): 5’-CCGCCTGGACACTGAGACT-3’，Anti-Sense(3’-5’)：5’-GTGGAGGACCCGATGGA-3’，產(chǎn)物長度270 bp。然后，提取各組細(xì)胞總RNA，取qRT-PCR合成cDNA，qRT-PCR進(jìn)行定量檢測mRNA的相對表達(dá)量。本次使用25 μL Real Time PCR反應(yīng)體系，AB17500機器進(jìn)行PCR反應(yīng)。以2-△△Ct法計算CDK2基因mRNA相對表達(dá)差異，每組重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度DCA對MG63細(xì)胞的活性抑制作用 50、100、200 μg·mL-1的DCA分別作用于MG63細(xì)胞后，其OD值均較對照組(0 μg·mL-1DCA)下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖1。

2.2 不同濃度DCA對MG63細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示不同濃度DCA作用24 h、48 h后細(xì)胞周期明顯阻滯于G2/M期，且有時間和濃度依賴性。見表1。

圖1 不同濃度DCK作用于MG63細(xì)胞后活性抑制曲線

DCA/(μg·mL-1)24h細(xì)胞周期G0/G1SG2/M48h細(xì)胞周期G0/G1SG2/M052.890±1.54037.260±1.9807.933±1.23464.124±2.32124.128±2.23111.573±2.36710049.023±1.09029.890±0.91218.236±1.98253.246±1.57627.256±1.87615.293±1.39220046.320±0.6107.401±0.90144.258±1.10245.354±2.15616.246±0.75239.012±1.982F19.234479.235512.32578.912349.012174.235P0.002<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

注：方差分析顯示，F(xiàn)24 h=7.102，P=0.004；F48 h=12.214，P<0.001。與0 μg·mL-1DCA比較，1)P<0.05；與100 μg·mL-1DCA比較，2)P<0.05

2.3 不同濃度的DCA對MG63細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，不同濃度的DCA處理后MG63細(xì)胞均呈現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象。見表2。

表2 不同濃度的DCA對MG63細(xì)胞凋亡的影響

注：與0 μg·mL-1DCA比較，1)P<0.05；與100 μg·mL-1DCA-Na比較，2)P<0.05

2.4 不同濃度的DCA對MG63細(xì)胞CDK2 mRNA相對表達(dá)量的影響 不同濃度的DCA干預(yù)MG63細(xì)胞后，細(xì)胞中的CDK2 mRNA的相對表達(dá)量明顯降低(P均<0.001)。見表3。

3 討論

CCK8實驗結(jié)果證明了，不同濃度的DCA抑制MG63細(xì)胞的活性，且具有時間和濃度依賴性。這提示，DCA能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡和抑制細(xì)胞周期，而流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，不同濃度的DCA作用于MG63細(xì)胞24 h和48 h后，G2期的細(xì)胞明顯增多，而且隨著濃度的增加，G2期的細(xì)胞也增加，這說明DCA抑制腫瘤細(xì)胞的G2周期，這與文獻(xiàn)不符。Wong等[11]認(rèn)為DCA激活線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路是能通過激活丙酮酸脫氫酶活性啟動三羧酸循環(huán)，釋放大量的ATP，促進(jìn)線粒體膜去極化、降低膜電位。而Cao等[12]認(rèn)為DCA聯(lián)合化療藥能阻滯腫瘤細(xì)胞周期G1期并能增加腫瘤細(xì)胞的凋亡率，但是單獨DCA對細(xì)胞周期不起任何作用。我們的研究與Madhok等[10]的報道是一致的，他的研究是DCA誘導(dǎo)凋亡和阻滯期G2期抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長，顯著降低結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，但不影響非腫瘤細(xì)胞生長。本實驗用不同濃度的DCA作用細(xì)胞24 h和48 h，然后提取RNA進(jìn)行qRT-PCR，結(jié)果顯示，CDK2的表達(dá)明顯下調(diào)，說明DCA抑制CDK2的表達(dá)，但是否說明DCA通過抑制CDK2來進(jìn)行細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，這需要進(jìn)一步實驗。另外，我們的實驗也存在缺點，沒有進(jìn)行非腫瘤細(xì)胞的對照，因此，我們的后續(xù)研究會進(jìn)一步完善實驗過程，力求實驗結(jié)果真是可靠。總之，DCA通過抑制CDK2使MG63細(xì)胞阻滯于G2/M期，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞的生長。

表3 不同濃度的DCA對MG63細(xì)胞CDK2 mRNA相對表達(dá)量的影響

注：與0 μg·mL-1DCA-Na比較，1)P<0.05；與100 μg·mL-1DCA-Na比較，2)P<0.05

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Effect of Sodium Dichloroacetate on Cell Cycle and Apoptosis of Human Osteosarcoma Cell Line MG63

YU Yali,WANG Leiming

(DepartmentofClinicalLaboratory,ZhengzhouCityOsteopathicHospital,Zhengzhou450052,China)

Objective To determine the effect of sodium dichloroacetate (DCA) on human osteosarcoma cell line MG63 in vitro activity,cell cycle and apoptosis.Methods The MG63 cells were cultured with RPMI-1640 medium including 10% of fetal bovine serum as usual,and treated with different concentration DCA. Then CCK8 kit was used to observe growth suppression of cells under different concentrations of DCA at 24 h,48 h; Flow cytometry assay was used to determine the cycle and apoptosis of the cells that were treated by different concentrations of DCA for 24 h,48 h,respectively. Finally,qRT-PCR was used to determine the mRNA relative expression of cell cycle related gene CDK2 after DCA invention.Results Different concentration of DCA inhibited cell growth and proliferation in a time-and dose-dependent manner; different concentration of DCA-Na acting on different time respectively arrested cell cycle G2/M phase,and improved apoptosis(P<0.001); and decreased the expression of CDK2 gene(P<0.001).Conclusion DCA can arrest G2/M cell cycle phase through inhibiting activity of CDK2,and then DCA induce apoptosis of MG63 cells and inhibit the growth of tumor cells.

sodium dichloroacetate; osteosarcoma; cyclin-dependent kinase; cell cycle

鄭州市科技計劃項目(編號：153PKJGG084)

于雅麗(1983-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事骨肉瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail：wa2yl@126.com

王雷鳴(1959-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事骨肉瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail：wanglm3@126.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.01.002

R738.1

A

1673-5412(2017)01-0007-04

2016-07-20)