左甲狀腺素鈉片的含量測(cè)定方法學(xué)研究

王東欣

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心）

摘 要：目的：研究并驗(yàn)證HPLC法檢測(cè)左甲狀腺素鈉片的含量的測(cè)定方法。方法：采用氰基硅烷鍵合硅膠；以乙腈-水-磷酸（300：700：1）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為225nm。結(jié)果：方法的專屬性、準(zhǔn)確度、精密度及耐用性良好；在左甲狀腺素鈉的進(jìn)樣量為50.6ng～506ng范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與色譜峰面積線性關(guān)系良好，平均回收率為99.98%，RSD為0.99%（n=9）。結(jié)論：本方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏，可有效檢測(cè)左甲狀腺素鈉片的含量。

關(guān)鍵詞：左甲狀腺素鈉；含量；HPLC

左甲狀腺素鈉，化學(xué)名為O-（4-羥基-3，5-二碘苯基）-3，5-二碘-L-酪氨酸單鈉鹽，為白色或微黃色結(jié)晶性粉末；無(wú)臭，無(wú)味；微有引濕性，是一種人工合成的四碘甲狀腺原氨酸鈉鹽，主要作用有：①維持人體的正常生長(zhǎng)發(fā)育，在生長(zhǎng)發(fā)育期避免由于甲狀腺功能不足導(dǎo)致的身體矮小、肢體短粗、發(fā)育緩慢、智力低下等問(wèn)題，避免成年人甲狀腺功能不全時(shí)導(dǎo)致的黏液性水腫。②促進(jìn)機(jī)體的代謝并增加產(chǎn)熱。③有效提高交感腎上腺系統(tǒng)的感受性。在臨床上適用于甲狀腺激素缺乏的替代治療。

國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)布了左甲狀腺素鈉片國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿，標(biāo)準(zhǔn)中采用高效液相色譜法檢測(cè)左甲狀腺素鈉片的含量，本研究將對(duì)該方法進(jìn)行詳細(xì)的方法學(xué)研究，以判斷該方法是否適合于左甲狀腺素鈉片的產(chǎn)品質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（安捷倫1260）；色譜柱：以氰基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱；左甲狀腺素鈉片（規(guī)格：25μg，批號(hào)：160501、160502、160503，實(shí)驗(yàn)室自制）；左甲狀腺素鈉對(duì)照品（含量為87.6%，批號(hào)：410006-201301），碘塞羅寧對(duì)照品（含量為99.2%，批號(hào)：410013-201501），均購(gòu)自中檢所。

乙腈、甲醇均為色譜級(jí)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

本品含量檢測(cè)方法參照國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)布的左甲狀腺素鈉片標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿中色譜條件進(jìn)行。

2.1 色譜條件

色譜柱：以氰基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱；以乙腈-水-磷酸（300：700：1）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為225nm；流速：1.0ml/min；進(jìn)樣量50μl。

2.2 供試品溶液的制備

取左甲狀腺素鈉片樣品10片，分別加入到5ml量瓶中，加入0.02mol/L氫氧化鈉溶液-甲醇（1：1）的混合溶液2ml，超聲約5分鐘使左甲狀腺素鈉溶解，放冷，用流動(dòng)相稀釋至刻度，振搖使混合均勻，離心，取上清液作為供試品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取左甲狀腺素鈉對(duì)照品適量（約10mg），加入到100ml容量瓶?jī)?nèi)， 加0.02mol/L氫氧化鈉溶液-甲醇（1：1）混合溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml，加入20ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.4 混合對(duì)照品溶液的制備

取左甲狀腺素鈉和碘塞羅寧對(duì)照品適量，加0.02mol/L氫氧化鈉溶液-甲醇（1： 1）混合溶液溶解并稀釋制成每1ml中各約含100μg 的溶液，取1ml，再用流動(dòng)相定量稀釋制成每1ml中各約含5μg 的溶液，作為混合對(duì)照品溶液。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取混合對(duì)照品溶液50μl注入色譜儀，記錄色譜圖，理論板數(shù)按左甲狀腺素峰計(jì)算不得低于2000，左甲狀腺素峰與碘塞羅寧峰的分離度不得小于4.0。

結(jié)果：左甲狀腺素峰與碘塞羅寧峰的分離度符合要求，左甲狀腺峰理論板數(shù)符合要求。

2.6 專屬性實(shí)驗(yàn)

按照處方量精密稱量本品中的輔料，按照供試品溶液的稀釋方法配制輔料空白溶液，精密量取50μl注入色譜儀，記錄色譜圖。

結(jié)果：輔料和溶劑在左甲狀腺素出峰處無(wú)干擾。

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液分別于0、1、2、4、6小時(shí)進(jìn)樣，考察各時(shí)間點(diǎn)左甲狀腺素鈉峰峰面積的RSD%，驗(yàn)證供試品溶液的穩(wěn)定性。

結(jié)果：左甲狀腺素峰面積6小時(shí)內(nèi)RSD為0.7%，結(jié)果表明左甲狀腺素鈉溶液在6小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 左甲狀腺素鈉線性試驗(yàn)

精密稱取左甲狀腺素鈉對(duì)照品適量，分別配制成每1ml分別含左甲狀腺素鈉濃度為1μg、3μg、5μg、8μg、10μg的混合對(duì)照溶液，分別進(jìn)樣50μl，記錄譜圖。以左甲狀腺素鈉的峰面積為縱坐標(biāo)，以左甲狀腺素鈉對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，計(jì)算線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

結(jié)果：左甲狀腺素鈉線性方程為：y=2057.4x-4776.8，r=0.9999；表明該方法左甲狀腺素鈉進(jìn)樣量在50.6ng～506ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.9 定量限試驗(yàn)

取2.8項(xiàng)下左甲狀腺素鈉對(duì)照品溶液，繼續(xù)進(jìn)行稀釋，分別精密量取50μl進(jìn)樣，以左甲狀腺素鈉峰的信噪比10：1時(shí)濃度計(jì)算進(jìn)樣量為檢測(cè)限。

結(jié)果：當(dāng)左甲狀腺素鈉色譜峰信噪比即約為10：1時(shí)，根據(jù)該稀釋倍數(shù)下的左甲狀腺素鈉對(duì)照品溶液濃度計(jì)算出左甲狀腺素鈉的檢測(cè)限為0.506ng。

2.10 回收率試驗(yàn)

按照本品處方配比，分別精密稱取左甲狀腺素鈉對(duì)照品和輔料各9份，分成3組，按照供試品溶液稀釋方法配制，使每1ml溶液中含左甲狀腺素鈉對(duì)照品的加入量分別為4μg、5μg、6μg，并按照規(guī)定的方法配制對(duì)照品溶液，精密量取各溶液50μl，按照規(guī)定的檢測(cè)方法分別進(jìn)樣檢測(cè)，記錄譜圖，計(jì)算回收率。

結(jié)果：平均回收率為99.98%，RSD為0.99%，說(shuō)明本方法耐用性較好。

2.11 中間精密度試驗(yàn)

取左甲狀腺素鈉片，按照標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的檢測(cè)方法分別由不同人員、不同儀器、不同日期按照規(guī)定的檢測(cè)條進(jìn)樣檢測(cè)，記錄譜圖，計(jì)算RSD%。

結(jié)果：不同人員、不同儀器、不同日期分別檢測(cè)左甲狀腺素鈉含量結(jié)果間RSD為1.06%，表明本方法中間精密度良好。

2.12 重復(fù)性試驗(yàn)

取左甲狀腺素鈉片，按照標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的檢測(cè)方法配制各溶液，共6份，按照規(guī)定的檢測(cè)條進(jìn)樣檢測(cè)，記錄譜圖，計(jì)算RSD%。

結(jié)果：左甲狀腺素鈉片6次含量測(cè)定結(jié)果間RSD為1.12%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.13 耐用性試驗(yàn)

取左甲狀腺素鈉片，按照標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的配制方法配制各溶液，分別調(diào)整流動(dòng)相的比例分別為（295：705：1）、（300：700：1）、（305：695：1）；調(diào)整高效液相色譜儀泵流速為1.0ml/min、0.8ml/min、1.2ml/min；調(diào)整檢測(cè)波長(zhǎng)分別為225nm、223nm、227nm；分別精密量取以上各溶液50μl，按照以上檢測(cè)條件分別進(jìn)樣檢測(cè)，記錄譜圖，考察耐用性。

結(jié)果：液相各檢測(cè)條件輕微改變后，左甲狀腺素峰與碘塞羅寧峰分離度均符合要求，左甲狀腺素鈉含量檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異，說(shuō)明本方法耐用性較好。

2.14 左甲狀腺素鈉片含量測(cè)定

取三批樣品，檢查左甲狀腺素鈉含量，結(jié)果分別為100.2%、99.3%、99.3%。

3 討論

本品的含量測(cè)定參照國(guó)家藥典委員會(huì)左甲狀腺素鈉片標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿中方法進(jìn)行檢查。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，方法的專屬性、準(zhǔn)確度、中間精密度、重復(fù)性、耐用性較好，檢測(cè)靈敏度較高。該方法簡(jiǎn)便、快捷，可準(zhǔn)確檢測(cè)左甲狀腺素鈉片的含量。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì)，左甲狀腺素鈉片標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿.