褐藻提取物鵝掌萊酚（Eckol）抗腫瘤作用的初步探究

祝浩明，王娟娟，舒 夢，陳 溪，孫 強，王 君，胡霞敏，程 靜

褐藻提取物鵝掌萊酚（Eckol）抗腫瘤作用的初步探究

祝浩明，王娟娟，舒 夢，陳 溪，孫 強，王 君，胡霞敏，程 靜*

（武漢科技大學醫(yī)學院，湖北 武漢 430065）

目的 初步探究褐藻提取物鵝掌萊酚（Eckol）的抗腫瘤作用。方法 觀察Eckol對小鼠艾氏腹水瘤、S180肉瘤和離體胃癌SGC7901細胞的影響，通過計算胸腺指數(shù)、脾指數(shù)了解Eckol對小鼠免疫器官的作用。結果 艾氏腹水瘤模型中，Eckol可明顯延長小鼠生存時間（P＜0.05）。與對照組（生理鹽水組）相比，Eckol對S180肉瘤小鼠腫瘤的形成和發(fā)展有明顯的抑制作用，可顯著降低肉瘤組織重量，改善其惡變程度。其中低劑量組（Eckol濃度為0.25 mg/L）的抗腫瘤功效最為明顯（P＜0.01），抑瘤率達48.49%。與對照組相比，Eckol對動物胸腺指數(shù)和脾指數(shù)影響不大。體外研究結果顯示，Eckol對SGC7901細胞的分裂增殖有明顯抑制作用（P＜0.01），且抑制作用呈劑量依賴性。結論 褐藻提取物Eckol具有明顯的抗腫瘤作用。

褐藻；鵝掌萊酚；抗腫瘤

褐藻是重要的藥用和食用資源。褐藻門約有250屬，1 500種以上，是海藻中比較高級的一大類群，具有分布廣、藻體大和生長快等特點，經(jīng)濟價值高[1]。褐藻多酚（Phlorotannin）是從Ecklonia cava、Ecklonia maxima、Eckloniastolonifera等褐藻中提取分離得到的多酚類物質，其基本結構單元為間苯三酚。鵝掌萊酚（Eckol）是間苯三酚的三聚體，因其獨特的化學結構而具有較多的生物學活性，如抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎[2，3]、預防骨質疏松[4]，但其抗腫瘤作用還未見報道。本實驗采取體內(nèi)、體外實驗方法，觀察Eckol對小鼠艾氏腹水瘤、S180肉瘤和體外培養(yǎng)的腫瘤細胞的作用，初步探究其抗腫瘤作用。

1 材料和試劑

1.1 試劑和藥品

Eckol由武漢南泰科技開發(fā)有限公司提供，為黃褐色粉末，難溶于水。羥基喜樹堿由成都普瑞法有限公司生產(chǎn)。Ⅳ型膠原酶、噻唑藍（MTT）、放線菌素D、脂多糖（LPS）均來自Sigma公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、新生牛血清（NBS）購于GIBCO公司。

1.2 動物及分組

昆明種小鼠（購于湖北省實驗動物中心），SPF級，雄性，4～5月齡，體重23～25 g。

艾氏腹水瘤實驗：將小鼠按體重平行隨機分為對照組（生理鹽水組）和Eckol低、中、高劑量組（藥物濃度分別為0.25 mg/L、0.50 mg/L、1.0 mg/L），共4組，每組10只，并用苦味酸進行編號。

S180肉瘤實驗：將小鼠按體重平行隨機分為對照組（生理鹽水組）和Eckol低、中、高劑量組（藥物濃度分別為0.25 mg/L、0.50 mg/L、1.0 mg/L）以及羥基喜樹堿陽性對照組（藥物濃度為1.0 mg/L），共5組，每組10只，并用苦味酸進行編號。

1.3 儀器和設備

倒置生物顯微鏡（德國徠卡）、Bio-Tek酶標儀、CO2培養(yǎng)箱（美國3111）、721分光光度計、分析天平（美國奧豪斯）。

2 方法

2.1 體內(nèi)抗腫瘤實驗

2.1.1 褐藻提取物Eckol對艾氏腹水瘤的抑制作用 對各組小鼠進行預防灌胃給藥，給藥量均為0.2 ml/10 g，1次/d，共7 d。第7 d灌胃給藥1 h后，取艾氏腹水瘤瘤株已傳代10 d的保種小鼠，無菌條件下抽取腹水，顯微鏡下計數(shù)，以無菌生理鹽水按1∶5比例稀釋腫瘤細胞，混勻后，在無菌條件下，按0.5 ml/只接種至實驗小鼠腹腔中。接種后按上述方法再連續(xù)給藥15 d，觀察小鼠的活動狀況并記錄小鼠生存時間，超過15 d的按15 d算。按以下公式計算生命延長率：

生命延長率（%）=（劑量組平均生存天數(shù)-對照組平均生存天數(shù)）/對照組平均生存天數(shù)×100%

劑量組：Eckol低、中、高劑量組。

2.1.2 Eckol對S180肉瘤的抑制作用 對各組小鼠采用預防灌胃給藥，給藥量均為0.2 ml/10 g，1次/d，共7 d。第7 d灌胃給藥1 h后，取S180肉瘤瘤株已傳代10 d的保種小鼠，無菌條件下抽取腹水，顯微鏡下計數(shù)，以無菌生理鹽水調整腫瘤細胞數(shù)至2.5×107，混勻后，每只小鼠右腋下接種腫瘤細胞懸液0.4 ml。接種24 h后，對照組以及Eckol低、中、高劑量組按上述方法給藥，羥基喜樹堿陽性對照組腹腔注射給藥，給藥量為0.2 ml/10 g，各組連續(xù)給藥10 d，最后一次給藥24 h后記錄小鼠體重，頸椎脫臼法處死小鼠，剝?nèi)「鹘M小鼠皮下瘤組織，取胸腺和脾臟，分別稱取濕重并記錄，按下列公式計算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。此外，每組選取一例瘤組織進行組織切片HE染色，觀察腫瘤細胞形態(tài)。

抑瘤率（%）=（對照組瘤重-劑量組瘤重）／對照組瘤重× 100%

脾指數(shù)=小鼠脾重（mg）／小鼠體重（g）

胸腺指數(shù)=小鼠胸腺重（mg）／小鼠體重（g）

2.2 體外抗腫瘤活性實驗

Eckol對胃癌SGC7901細胞株生長增殖抑制作用實驗：采用MTT法，用10%RPMI-1640生長培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，收集對數(shù)期細胞，用2%RPMI-1640維持培養(yǎng)基，調節(jié)細胞濃度，除空白調零孔外，每孔均勻接種約1×104個細胞，200 μl到96孔板中?？瞻渍{零孔僅加入10%RPMI-1640培養(yǎng)液180 μl，于37℃、飽和蒸汽、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，倒置顯微鏡下觀察。除空白調零孔及正常對照孔外，每孔分別加入濃度為0.125 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L的20 μl Eckol提取液，每種濃度各設5個復孔。正常對照孔僅加入PBS 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去孔內(nèi)液體，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，于37℃、飽和蒸汽、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，1 000 r/min平板離心機離心后，棄上清，晾干，加入200 μl DMSO，在搖床上低速震蕩10 min，使結晶完全溶解后，用酶標儀560 nm測每孔光密度值（OD值），按以下公式計算細胞增殖抑制率：

細胞增殖抑制率（%）=（1-藥物處理組OD值/正常培養(yǎng)液對照組OD值）×100%

藥物處理組：指不同濃度的Eckol提取液組；

正常培養(yǎng)液組：指與藥物處理組同條件下的PBS組。

3 結果

3.1 Eckol對艾氏腹水瘤的抑制作用

如表1所示，與對照組相比，Eckol中、高劑量組小鼠生存時間分別為（11.3±2.1）d、（11.3±3.0）d，差異有顯著性（P＜0.05），說明Eckol在一定濃度范圍內(nèi)對腫瘤的生長和發(fā)展有顯著的抑制作用，并能延長腹水瘤小鼠生存時間。

表1 Eckol對艾氏腹水瘤小鼠生存時間的影響

3.2 Eckol對S180肉瘤的抑制作用

如表2所示，相對于對照組的腫瘤生長良好，Eckol低、中、高劑量組腫瘤的生長均受到抑制，抑瘤率分別為48.49%、36.96%和36.65%，其中以低劑量組抑瘤效果最為明顯，抑瘤率明顯高于羥基喜樹堿陽性對照組。說明Eckol對S180肉瘤的體內(nèi)增殖具有良好的抑制活性。圖1顯示，S180肉瘤經(jīng)HE染色后，用高倍鏡進行觀察，對照組的癌細胞大小和形態(tài)完全不一致，細胞核變大，核染色較深，細胞核和細胞漿之間的比例增大，核的大小、形狀、染色不一，多處可見核分裂相，不對稱性、多極性、頓挫性等病理性分裂相增多。羥基喜樹堿陽性對照組可見大片細胞死亡，殘存的瘤細胞大小和形態(tài)趨近一致。Eckol低、中、高劑量組的死亡細胞數(shù)呈劑量依賴性，尤其高劑量組呈大面積的索式死亡區(qū)，瘤細胞大小和形態(tài)較均一，經(jīng)Eckol劑量處理后細胞大小和形態(tài)都發(fā)生了變化。與對照組比較，羥基喜樹堿陽性對照組中羥基喜樹堿能明顯降低小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。而Eckol低、中、高劑量組小鼠胸腺指數(shù)分別為對照組的76.32%、87.72%和93.05%，差異無顯著性。

表2 Eckol對小鼠S180實體瘤重量的影響

圖1 Eckol對腫瘤組織形態(tài)學的影響

3.3 Eckol對體外培養(yǎng)的SGC7901細胞的影響

如表3所示，Eckol可能并非通過免疫調節(jié)作用發(fā)揮間接抗腫瘤效應，而是通過直接細胞毒性發(fā)揮效應。為了解Eckol對腫瘤細胞的直接作用，我們利用經(jīng)典MTT法對其進行驗證。如圖2所示，Eckol對胃癌SGC7901細胞的增值抑制作用呈劑量依賴性，隨著劑量的增加，細胞生存率不斷下降，即增殖抑制率呈上升趨勢。且與對照組比較，各劑量組均存在顯著性差異，說明Eckol對SGC7901細胞的體外增殖具有明顯的抑制作用。

表3 Eckol對小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響（±s，mg/g）

表3 Eckol對小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響（±s，mg/g）

注：與對照組比較，無顯著性差異

組別 胸腺指數(shù) 脾指數(shù)對照組Eckol低劑量組Eckol中劑量組Eckol高劑量組羥基喜樹堿陽性對照組3.754±1.100 2.865±0.740 3.293±0.510 3.493±0.790 2.111±0.650 8.145±1.920 5.628±1.010 6.835±1.370 6.303±1.230 4.848±1.850

圖2 Eckol對細胞生存率的影響（24 h）

4 討論

如今癌癥已成為威脅人類健康、致人死亡的重要病因。目前臨床上治療癌癥的化療藥物具有選擇性低、對正常組織傷害性大的特點。大量研究表明，從海藻中提取的很多活性成分具有抗腫瘤作用。魏玉西等[5]發(fā)現(xiàn)鼠尾藻多酚類化合物具有較強的抗腫瘤活性，對離體人肺腺A-549細胞、人肝癌BEL-7402細胞的增殖具有很強的抑制作用。史大華等[6]在低分子量的巖藻多糖的研究中也證實巖藻多糖具有抗腫瘤作用。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，Eckol能延長艾氏腹水瘤小鼠生存時間；Eckol劑量組的小鼠毛發(fā)普遍要比對照組的有光澤，行動也更活躍；在S180移植性實體瘤實驗中，Eckol劑量組的平均瘤重比對照組輕，說明Eckol具有明顯的抑制肉瘤生長的作用。在與羥基喜樹堿陽性對照組比較時發(fā)現(xiàn)，羥基喜樹堿陽性對照組小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)顯著降低，而給予Eckol的高、中、低劑量組與陽性對照組相比，其胸腺指數(shù)均呈上升趨勢，且胸腺指數(shù)的上升為劑量依賴性，高劑量組的胸腺指數(shù)最大，與陽性對照組相比差異有顯著性。高劑量組的S180小鼠脾指數(shù)顯著高于陽性對照組，差異有顯著性。而劑量組小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)明顯低于對照組，但不存在顯著性差異。說明羥基喜樹堿的組織毒性遠遠大于Eckol，羥基喜樹堿能致免疫器官胸腺和脾臟萎縮。在MTT法體外實驗中，離體的人胃癌細胞株SGC7901細胞經(jīng)Eckol處理24 h，隨著Eckol濃度的增加，存活細胞數(shù)顯著下降，且除低劑量組外，細胞增殖抑制率與對照組比較有顯著性差異，說明一定劑量范圍的Eckol對離體分離的人癌細胞具有抑制作用。多項研究表明，Eckol類化合物在一些細胞信號通路中起著重要作用[7，8]。而Lee S H[9]發(fā)現(xiàn)從褐藻Ecklonia Cave中分離提取的褐藻多酚通過誘導腫瘤細胞凋亡，對人MCF-7肺癌細胞株的體外增殖具有顯著的抑制作用。本實驗只是對Eckol抗腫瘤作用做初步研究，詳細的抗腫瘤機制以及可能涉及分子水平的信號通路還有待深入研究。

[1]秦緒龍，萬升標，江濤.Eckol類褐藻多酚的研究進展[J].海洋湖沼通報，2007（1）：176-181.

[2]Joung E J，Lee M S，Choi J W.Anti-inflammatory effects of phlorofucofuro eckol B-rich ethyl acetate fraction obtained from Myagropsismyagroides on lipopoly-saccharide stimulated RAW 264.7 cells and mouse edema[J].Int Immunopharmacol，2012（14）：471-480.

[3]Ha H L，Shin H J，F(xiàn)eitelson M A，et al.Oxidative stress and antioxidants in hepatic pathogenesis[J].World J Gastroenterol，2010（16）：6035-6043.

[4]Karadeniz F，Ahn B N，Kim J A，et al.Phlorotannins suppress adipogenesis in preadipocytes while enhancing osteoblastogenesis in pre-osteoblasts [J].Archives of Pharmacal Research，2015（38）：2172-2182.

[5]魏玉西，孫峋，王長云，等.鼠尾藻多酚的抗腫瘤活性研究[J].中草藥，2008，39（1）：93-95.

[6]史大華，劉瑋煒，劉永江，等.低分子量海帶巖藻多糖的制備及其抗腫瘤活性研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23（1）：53-55.

[7]王芳，王勤，蔣志軍.InsP 6誘導荷S180小鼠不同器官中MDA含量和紅細胞中SOD活性改變[J].中國微循環(huán)，2001，5（1）：30-32.

[8]陳曉峰，顧振綸，梁中琴.基質金屬蛋白酶與腫瘤侵襲和轉移研究進展[J].中國藥理學通報，2001，17（3）：253-255.

[9]Lee S H.Anti-inflammatory Mechanisms of Phlorotannins Derived from Eiseniabicyclis and their inhibitory effect on Matrix Metaloproteinases[D]. South Korea：Pukyong National University，2010.

（*通訊作者：程靜）

R285.6

A

1671-1246（2017）05-0093-03

注：本文系武漢科技大學大學生科技創(chuàng)新基金研究項目（15ZRA164）